本發(fā)明涉及一種脂滴熒光探針及其應用，尤其涉及一種具有超高選擇性的兩親性的脂滴探針及其在專一性地標記或顯示活細胞或組織中的脂滴形態(tài)和分布中的應用。

背景技術：

脂滴，長期以來一直被認為是細胞中存儲中性脂質(zhì)(甘油三酯和膽固醇酯)的簡單的惰性的球體。但是最近的研究表明脂滴并不是靜態(tài)的，而是細胞內(nèi)高度動態(tài)的細胞器，廣泛地存在于真核細胞和原核細胞中。它們在細胞中扮演著重要的角色，參與細胞中的多種活動，比如調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質(zhì)的代謝，維持細胞內(nèi)平衡，并與細胞內(nèi)多種細胞器相互作用。而且脂滴的異?？蓪е露喾N疾病，如肥胖癥，糖尿病，動脈粥硬化等。因此為了深入研究脂滴的生物角色和各種生理活動對脂滴的影響，包括質(zhì)譜分析、電子顯微鏡等的各種各樣的方法均被使用。在各種方法中，熒光探針能夠?qū)崟r原位地可視化脂滴，故其成為了研究脂滴及其相關活動的強有力的手段。

正如我們所知，脂滴有一個大的無水的中性核，所以根據(jù)“相似相容”原理，一些親脂性的探針已經(jīng)被開發(fā)并用來成像脂滴。其中較廣泛應用的有兩個商業(yè)化的脂滴探針：Nile Red和BODIPY。Nile Red是一個親脂性的探針，盡管它能夠優(yōu)先地聚集在脂滴，但是它也對細胞內(nèi)絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)染色，而且在水中也有微弱的熒光發(fā)出，因此造成了極大的背景噪音，導致選擇性很差。為了提高選擇性，另一種親脂性的探針BODIPY以及其它親脂性的脂滴探針也相繼被用來成像脂滴。相比Nile Red,它們的選擇性有所改善，但是仍然不能滿足研究需求，阻礙了脂滴的進一步研究。由此可見，單純地依賴于脂滴的親脂性來設計親脂性的脂滴探針很難實現(xiàn)高選擇性地成像脂滴的目的。因此，迫切地需要一種新的設計方法以獲得高選擇性的脂滴探針，能夠?qū)Ｒ恍缘匕邢蛑?，實現(xiàn)無背景噪音地成像。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種具有超高選擇性的兩親性的脂滴熒光探針及其在專一性地標記或顯示活細胞或組織中的脂滴形態(tài)和分布中的應用，以實現(xiàn)用于無背景噪音地成像細胞和組織中的脂滴。

本發(fā)明所述超高選擇性且具兩親性的脂滴熒光探針，其特征在于：該探針化學名稱為1-(3’-(7’-硝基苯并呋咱-4’-)氨丙基)-2,3,3-三甲基吲哚溴鹽，簡稱NII；其化學通式如式(I)所示：

本發(fā)明所述超高選擇性且具兩親性的脂滴熒光探針(NII)的制備方法概述如下：

先合成4-(3’-溴丙氨基)-7-苯并呋咱(化合物1)，再將其與2,3,3-三甲基吲哚混合，以乙醇為溶劑，加熱回流制得1-(3’-(7’-硝基苯并呋咱-4’-)氨丙基)-2,3,3-三甲基吲哚溴鹽(NII)。

上述超高選擇性且具兩親性的脂滴熒光探針(NII)制備的反應式如下：

目前的報道已經(jīng)表明，脂滴內(nèi)部的中性核是被一個兩親性的磷脂單分子層所包被，為了有效地存儲脂滴同時維持脂滴結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，脂滴內(nèi)部的水被排出，因此實際上脂滴形成了一個獨特的兩親性的結(jié)構(gòu)，它包含一個極性的頭部和無水的內(nèi)部?；谶@樣的認識，本發(fā)明預測兩親性的分子能夠超高選擇性地靶向脂滴，并成功篩選出了一個基于兩親性的有機小分子探針。這個兩親性的探針分別由一個強親脂性的熒光團NBD和一個陽離子部分(吲哚鹽)組成。在這里，我們選擇了一個遵循ICT(分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移)機制的NBD作為熒光母體，一方面它具有強的親脂性，能夠和脂滴的中性核有強的結(jié)合力，同時結(jié)合陽離子部分和脂滴的極性頭部之間的強的靜電作用力，可以實現(xiàn)專一性地靶向脂滴，從而有利于無背景噪音地成像。另一方面，該熒光團的發(fā)光性質(zhì)受環(huán)境的極性影響，即在低極性環(huán)境中它的熒光強度明顯地高于其在高極性環(huán)境中，這樣當該親脂性的熒光團靶向脂滴低極性的內(nèi)部后，能發(fā)出強烈的熒光，實現(xiàn)熒光開關的效果，進而也有利于無背景噪音地成像。因此，兩親性探針的雙靶標策略能夠?qū)Ｒ恍缘匕邢蛑危瑢崿F(xiàn)無背景噪音的成像。

本發(fā)明所述超高選擇性且具兩親性的脂滴熒光探針在專一性地標記或顯示活細胞或組織中的脂滴形態(tài)和分布中的應用。

其中：所述活細胞優(yōu)選永生化細胞或正常細胞，所述組織優(yōu)選小鼠肌肉組織或肝臟組織。

進一步的，所述永生化細胞優(yōu)選是HeLa細胞或PC-3細胞；所述正常細胞優(yōu)選是MSC細胞。

本發(fā)明提供的具有超高選擇性的可用于無背景噪音地成像脂滴的兩親性的熒光探針同時具有雙光子成像能力。

實驗結(jié)果證實，本發(fā)明所述的兩親性的脂滴探針具有超高的選擇性，能夠?qū)Ｒ恍缘匕邢蚣毎踔粮鼜碗s的組織中的脂滴，其成像效果遠遠強于商業(yè)化的脂滴探針Nile red。同時，由于在NBD基礎上非共軛地引入了陽離子鹽部分并不會影響NBD的發(fā)光性質(zhì)，這使得兩親性的探針NII保持了NBD的熒光性質(zhì)，即ICT性質(zhì)，熒光受環(huán)境極性的影響，隨環(huán)境極性的增加，熒光強度降低，同時熒光峰位有所紅移。因此當NII靶向具有低極性的脂滴內(nèi)部時，熒光強度將遠遠大于其在水中的熒光強度，從而可以實現(xiàn)了熒光開關效果。同時，這樣的高信噪比和低的背景噪音也使得探針進行染色后，可無需進一步洗滌，即可在顯微鏡下直接觀察。同時NII具有合適的雙光子性能，可用于雙光子成像。在雙光子顯微鏡下，細胞和組織中的脂滴可被清楚地觀察到。此外，NII探針的光穩(wěn)定性極好，明顯強于Nile Red.同時它的染色速度極快(2分鐘)，細胞毒性很低，并且可和其他探針兼容。因此探針NII能夠成為研究脂滴及其相關活動的一個強有力的工具，更重要的是利用兩親性分子的雙靶向的設計思路能夠為未來膜性細胞器包括脂滴在內(nèi)的探針的設計提供一個通用的指導。

本發(fā)明提供的高選擇性的兩親性的脂滴探針NII是首次報道的兩親性的可用于無背景噪音地成像脂滴的熒光探針。與其功能相近的其他親脂性的脂滴熒光探針相比，本發(fā)明所述探針NII具有超高的選擇性、無背景噪音成像、雙光子性能、極好的光穩(wěn)定性、快速染色能力、免洗滌、細胞毒性低等特點。

綜上，本發(fā)明的探針是一種全新的探針，具有適用范圍廣，單、雙光子光穩(wěn)定性好，染色速度快，細胞毒性低，以及能在活性細胞中專一地成像脂滴的特點，其應用前景廣闊。

附圖說明

圖1：用Hoechst 33342和NII(A)或Nile red(B)共同染色HeLa細胞的共聚焦熒光照片。

其中：(1)圖為明場激光掃描的微分干涉照片；(2)圖為Hoechst 33342在405nm激光輻照下得到的熒光照片；(3)圖為NII或Nile red在473nm激光輻照下得到的熒光照片；(4)圖為(1)、(2)、(3)的疊加圖。(5,6,7)分別為對應的黃色框中的放大圖。標尺(4)＝20μm；標尺(5)＝1μm。

圖2：用Hoechst 33342和NII(A)或Nile red(B)共同染色經(jīng)過不同處理的HeLa細胞的共聚焦熒光照片。

不同處理：(1-4)為固定細胞，(5-8)為固定后的細胞再通過二甲苯去除細胞內(nèi)脂滴。

其中：1、5圖為明場激光掃描的微分干涉照片；2、6圖為Hoechst 33342在405nm激光輻照下得到的熒光照片；3、7圖為NII、Nile red在473nm激光輻照下得到的熒光照片；4、8圖為2、3的疊加圖。標尺＝20μm。

圖3：用NII染色經(jīng)過油酸處理不同時間的HeLa細胞的共聚焦熒光照片。

(A)：2h；(B):4h；(C):6h。

其中：1圖為NII在473nm激光輻照下得到的熒光照片；2圖為為明場激光掃描的微分干涉照片；3圖為1、2的疊加圖。標尺＝20μm。

圖4：(A)圖：用NII染色HeLa細胞的雙光子熒光照片，標尺＝20μm；

(B)圖：NII的單/雙光子光穩(wěn)定性及Nile red的單光子光穩(wěn)定性的量化圖；

(C)圖：用NII處理HeLa細胞不同時間(2h,10h,24h)后細胞的存活率。

圖5：用NII染色小鼠肌肉組織(橫切面和縱切面)以及肝臟組織后在840nm激光輻照下得到的不同深度的雙光子熒光照片。標尺＝20μm。

具體實施方式

實施例1：

4-(3’-溴丙氨基)-7-苯并呋咱(1)的合成

在燒瓶中，將4-氯-7-硝基苯呋咱(2g,10mmol)溶解在甲醇中，攪拌15分鐘，然后加入3-溴丙胺(2.19g,10mmol)，于室溫下反應8小時。反應結(jié)束后用二氯甲烷萃取，水洗。用無水硫酸鈉進行干燥。最后用石油醚和乙酸乙酯的混合物進行柱層分析獲得最終產(chǎn)物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.54(t,J＝5.40Hz,1H),8.54(d,J＝9.00Hz,1H),6.45(d,J＝8.70Hz,1H),3.64(m,4H),2.23(m,2H)。

1-(3’-(7’-硝基苯并呋咱-4’-)氨丙基)-2,3,3-三甲基吲哚溴鹽(NII)的合成

將合成的化合物(1)(0.3g,1mmol)與2,3,3-三甲基吲哚(240Μl,1.5mmol)混合，以乙醇為溶劑，加熱回流。24小時后反應結(jié)束，冷卻至室溫，沉淀物用乙醚沖洗三次，然后再用水沖洗三遍，得到最終產(chǎn)物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)9.48(s,1H),8.57(d,J＝9.00Hz,1H),7.99(m,1H),7.81(m,1H),7.58(m,2H),6.51(d,J＝9.00Hz,1H).¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm)＝197.62,144.84,142.30,141.59,138.28,129.83,129.28,123.94,115.81,100.08,54.72,46.12,40.68,40.47,40.26,40.05,39.84,39.63,39.39,22.52,14.61.HRMS(m/z):[M]⁺calculated for C₂₀H₂₂N₅O₃,380.43；found,380.18。

實施例2：永生化的癌細胞HeLa的培養(yǎng)

HeLa細胞株均是在37℃，5％CO₂的CO₂培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。HeLa細胞株在內(nèi)含10％胎牛血清和1％雙抗的H-DMEM培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)。

等細胞生長到對數(shù)期，接片培養(yǎng)：①將蓋玻片于無水乙醇中浸泡30min，酒精燈烘干后放入一次性35mm培養(yǎng)皿中；②將100mL細胞瓶中的細胞用PBS洗三遍，用1mL0.25％胰酶消化3-5分鐘，小心地倒出培養(yǎng)基，加入少量新鮮培養(yǎng)基吹打均勻，細胞計數(shù)后，留下合適密度的細胞，將培養(yǎng)基加至所需體積(控制細胞終濃度為1×10⁵)，接種至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中，放入CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞爬片生長。

實施例3：NII和Nile red染色HeLa細胞內(nèi)脂滴的共聚焦熒光顯微實驗

將接好的細胞爬片先用細胞核染料Hoechst 33342(5μM)孵育30min，用PBS洗滌2遍，然后在室溫下用4μM NII染色孵育2min或5μM Nile red孵育20min。將細胞爬片取出，細胞生長面朝下蓋在載玻片上，在共聚焦熒光顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的脂滴被NII清晰地著色，呈圓球狀，主要分布在細胞質(zhì)中(未被Hoechst著色的區(qū)域)。然而，Nile red除了染色圓點之外，也染色了細胞內(nèi)大多數(shù)結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明所述兩親性探針NII是具有超高選擇性的脂滴探針，能夠給出脂滴的無背景噪音的熒光照片。

結(jié)果見圖1。用Hoechst 33342和NII(A)或Nile red(B)共同染色HeLa細胞的共聚焦熒光照片。其中(1)圖為明場激光掃描的微分干涉照片；(2)圖為Hoechst 33342在405nm激光輻照下得到的熒光照片；(3)圖為NII或Nile red在473nm激光輻照下得到的熒光照片；(4)圖為(1)、(2)、(3)的疊加圖。(5,6,7)分別為對應的黃色框中的放大圖。標尺(4)＝20μm；標尺(5)＝1μm。

實施例4：通過去除脂滴法證明兩親性脂滴探針NII的超高選擇性的證明實驗

二甲苯可用來去除固定細胞中的脂滴，因此可用來進一步證明NII對脂滴的超高選擇性。對照組：細胞先用多聚甲醛固定，30分鐘后細胞已被固定，然后吸去多聚甲醛，加入1ML的PBS，再用細胞核染料Hoechst 33342(5μM)孵育30min,用PBS洗滌2遍，然后用4μM NII染色孵育2min或5μM Nile red孵育20min。實驗組：細胞先用多聚甲醛固定，30分鐘后細胞已被固定，然后吸去多聚甲醛，之后用不同濃度梯度的酒精(70％,80％,90％,95％和100％)依次處理細胞各5分鐘，然后用二甲苯處理細胞兩次，各5分鐘，之后再用反濃度梯度的酒精依次處理各5分鐘。最后用PBS洗滌細胞兩次，此時細胞內(nèi)的脂滴被完全去除。然后用細胞核染料Hoechst 33342(5μM)孵育30min,用PBS洗滌2遍，最后用4μM NII染色孵育2min或5μM Nile red孵育20min。將兩組實驗中的細胞爬片取出，細胞生長面朝下蓋在載玻片上，在共聚焦顯微鏡分別收集NII，Nile red和Hoechst 33342的信號。

觀察發(fā)現(xiàn)，去除脂滴前，細胞內(nèi)的脂滴能夠被NII清晰地著色，但是脂滴被去除之后，沒有檢測到來自NII的熒光。相比之下，去除脂滴后，細胞內(nèi)的其他環(huán)境仍會被Nile red著色。因此該實驗證明了兩親性探針NII只能夠?qū)Ｒ坏厝旧?，而不能染色細胞?nèi)的其他環(huán)境。

結(jié)果如圖2。用Hoechst 33342和NII(A)或Nile red(B)共同染色經(jīng)過不同處理的HeLa細胞的共聚焦熒光照片。不同處理：(1-4)為固定細胞，(5-8)為固定后的細胞再通過二甲苯去除細胞內(nèi)脂滴。其中1、5圖為明場激光掃描的微分干涉照片；2、6圖為Hoechst 33342在405nm激光輻照下得到的熒光照片；3、7圖為NII、Nile red在473nm激光輻照下得到的熒光照片；4、8圖為2、3的疊加圖。標尺＝20μm。

實施例5：通過用油酸處理HeLa細胞再一次證明兩親性脂滴探針NII的超高選擇性的證明實驗

因為油酸能夠作為一種中性磷脂聚集在脂滴內(nèi)，從而能誘導脂滴的形成，使脂滴增多。因此我們用油酸處理HeLa細胞來進一步證明兩親性脂滴探針NII的超高選擇性。將接好的細胞爬片分別用油酸處理不同的時間(2h,4h,6h)，然后吸出，用PBS洗滌2遍，之后用4μM NII染色孵育2min。取出細胞爬片，將細胞生長面朝下蓋在載玻片上，在共聚焦熒光顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的增長，細胞內(nèi)的脂滴增大，來自NII的綠色熒光也顯著增強。這表明NII也能很好地染色細胞內(nèi)新產(chǎn)生的脂滴。

結(jié)果見圖3。用NII染色經(jīng)過油酸處理不同時間的HeLa細胞的共聚焦熒光照片。(A)：2h；(B):4h；(C):6h.其中1圖為NII在473nm激光輻照下得到的熒光照片；2圖為為明場激光掃描的微分干涉照片；3圖為1、2的疊加圖。標尺＝20μm。

實施例6：NII染色HeLa細胞的雙光子照片，單/雙光子光穩(wěn)定性及其細胞毒性試驗

將接種好的細胞爬片用4μM的NII進行染色，室溫下孵育2min。然后將細胞爬片取出，細胞生長面朝下蓋在載玻片上，直接在雙光子顯微鏡(激發(fā)波長：840nm，平均飛秒脈沖功率為3mW)下觀察細胞。結(jié)果表明NII具有雙光子成像能力，能夠在雙光子激發(fā)下清晰地成像細胞中的脂滴。同時，測定其單/雙光子光穩(wěn)定性及Nile red的單光子光穩(wěn)定性，結(jié)果表明NII有極好的光穩(wěn)定性，明顯高于Nile red。用CCK8測定NII的細胞毒性，結(jié)果表明NII對細胞的毒性極小。

結(jié)果見圖4。(A)用NII染色HeLa細胞的雙光子熒光照片，標尺＝20μm；(B)NII的單/雙光子光穩(wěn)定性及Nile red的單光子光穩(wěn)定性的量化圖；(C)用NII處理HeLa細胞不同時間(2h,10h,24h)后細胞的存活率。

實施例7：NII染色小鼠肌肉組織和肝臟組織的雙光子顯微實驗

將從小鼠體內(nèi)取出的肌肉組織和肝臟組織分別培養(yǎng)在裝有細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)小皿中，然后用10μM的NII染色，室溫下孵育2分鐘后直接在雙光子顯微鏡下(激發(fā)波長：840nm)下進行觀察。

實驗結(jié)果表明：NII能夠清晰地可視化組織中脂滴的形態(tài)及分布，且成像深度可達82μm。

結(jié)果見圖5。用NII染色小鼠肌肉組織橫斷面、縱切面和肝臟組織后在840nm激光輻照下得到的不同深度的雙光子熒光照片。