本發(fā)明涉及一種流感病毒弱毒活疫苗毒株的篩選和鑒定方法，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

流感是一種嚴重威脅人類健康和公共衛(wèi)生安全的呼吸道傳染病。當(dāng)前防治流感的主要方法是患者應(yīng)用抗病毒藥物進行治療和對正常人群進行免疫接種。但是由于近些年來流行的流感病毒都具有普遍的耐藥性，使得目前使用的抗流感病毒藥物的療效非常有限，流感的治療面臨無藥可用的局面。因此疫苗接種已成為當(dāng)前流感防治體系中最為基礎(chǔ)和有效手段。目前使用的流感疫苗有兩種，一種為流感病毒滅活疫苗，另一種為流感病毒減毒活疫苗。中國使用的是流感滅活疫苗。

傳統(tǒng)的滅活疫苗都是利用雞胚作為生產(chǎn)基質(zhì)，這使得其應(yīng)用面臨諸多問題。首先，由雞胚生產(chǎn)的流感疫苗中會殘存一些雞胚的成分，這些成分往往造成疫苗接種者出現(xiàn)比較嚴重的副反應(yīng)，這使得某些人群根本無法接種流感疫苗；為了降低疫苗接種的副反應(yīng)，現(xiàn)在要經(jīng)過復(fù)雜的純化過程去除雞胚蛋白，而這又增加了疫苗生產(chǎn)的時間和經(jīng)濟成本。其次，目前所使用的滅活疫苗對于嬰幼兒及老年人的免疫效果不是很好，而其主要原因可能是雞胚疫苗中的異源性抗原分散了這些人群機體有限的免疫應(yīng)答能力，另外也與禽類和人類細胞在抗原微修飾方面的差異有關(guān)。此外，當(dāng)一種新型流感病毒出現(xiàn)后，利用當(dāng)前疫苗的雞胚生產(chǎn)體系一般需要將近6個月的時間才能生產(chǎn)出新的疫苗，這常使得我們無法在面臨流感流行或大流行的時候及時生產(chǎn)和儲備足夠量的疫苗。而且某些流禽流感病毒由于其對雞胚的高度致死性，可能根本就無法通過雞胚來生產(chǎn)該類病毒的疫苗。流感減毒活疫苗由于其在介導(dǎo)細胞免疫和粘膜免疫方面的優(yōu)勢特點，它能給人體提供非常好的免疫保護效果。這些冷適應(yīng)減毒疫苗是將野生型流感病毒在非病毒生理條件下進行持續(xù)的傳代，使病毒在冷適應(yīng)的過程中獲得某種突變，進而從突變的病毒中篩選出能夠作為弱毒活疫苗的毒株。這種方法非常的耗時，冷適應(yīng)能獲得的突變病毒量非常有限，導(dǎo)致在候選篩選過程中的可選擇性很小。另外。冷適應(yīng)獲得的突變病毒，往往是在病毒的基因組發(fā)生一個或若干個點突變，這種突變在后續(xù)疫苗生產(chǎn)和免疫過程中非常容易發(fā)生回復(fù)性突變，可能造成疫苗的返祖，進而引起疾病。盡管如此，現(xiàn)有的冷適應(yīng)減毒疫苗都是由國外相關(guān)單位所研發(fā)，我國還沒有自己獨立知識產(chǎn)權(quán)的減毒疫苗毒株，這在一定程度上阻礙了流感病毒減毒活疫苗在中國的生產(chǎn)和應(yīng)用。由此可見，發(fā)展新的流感減毒活疫苗篩選和評價體系，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的減毒疫苗毒株，克服傳統(tǒng)弱毒疫苗研制體系缺陷是應(yīng)對當(dāng)前嚴峻的流感防控形勢迫切需求，也具有很高的經(jīng)濟價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是研究和開發(fā)了一種通過構(gòu)建和篩選病毒基因由mu噬菌體轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的高密度隨機插入突變體庫，獲得弱毒活疫苗候選毒株的方法，并開發(fā)了一套對所獲得的弱毒活疫苗毒株進行系統(tǒng)性評價的技術(shù)體系。這些方法不但可以直接應(yīng)用于流感病毒弱毒活疫苗毒株的篩選和評價，而且對于其他病毒弱毒活疫苗的研制和開發(fā)有廣泛的借鑒意義。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種流感病毒弱毒活疫苗毒株的篩選和鑒定方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)利用mu噬菌體轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的隨機插入技術(shù)建立m基因的高密度突變庫：

利用finnzymes公司mu噬菌體轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的隨機插入突變試劑盒向流感病毒a/wsn/1933m基因各個堿基間插入5’-nnnnntgcggccgca-3’這一15nt長的寡核苷酸序列，從而獲得流感病毒m基因的高密度突變庫；

(2)通過流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)獲得病毒突變體庫：

用電轉(zhuǎn)化的方法將攜有m基因突變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌dh10b感受體細胞，從重組菌種提取m基因突變體庫質(zhì)粒，然后利用a/wsn/33h1n1流感病毒8質(zhì)粒病毒反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)獲取病毒突變體庫；

(3)通過第二代測序技術(shù)對病毒突變體庫組分進行分析：

取步驟(2)獲得的病毒突變體庫病毒在mdck細胞上進行傳代，然后利用trizol試劑提取病毒rna，并對各rna按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒iscripttmcdnasynthesiskit進行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的cdna，以該cdna為模板，分別使用3個m基因的特異性正向引物5’-agcaaaagcaggtagatatt-3’，5’-ggggccaaagaaatagcact-3’，5’-tcctagctccagtgctggtc-3’與vic標記的插入序列特異性反向引物做pcr擴增，由pcr獲得的熒光標記pcr產(chǎn)物設(shè)置一次重復(fù)和liz-500分子量標準利用96-毛細管3730xldna分析儀進行測序，所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)應(yīng)用abi軟件依照以下標準進行分析，去除pcr過程、引物及測序儀器產(chǎn)生的非特異性數(shù)據(jù)；

(4)小鼠體內(nèi)篩選流感病毒弱毒活疫苗候選毒株：

首先通過超速離心的方法濃縮突變體庫病毒，測定其病毒滴度后用于后續(xù)小鼠感染實驗，病毒通過滴鼻的方法感染6-8周齡的c57/b6小鼠，分別在感染后第二天、第四天、第六天和第八天收取小鼠的肺臟組織并進行勻漿處理，從肺組織勻漿中用trizol試劑提取總rna，依照上述步驟(3)的方法對樣本中病毒m基因進行測序并進行定性和定量分析，根據(jù)不同m基因突變病毒在各樣本中的存在情況，確定弱毒活疫苗候選毒株；

(5)弱毒活疫苗候選毒株遺傳穩(wěn)定性和安全性評價：

(a)弱毒活疫苗的分離和表型鑒定：首先對上述弱毒活疫苗候選毒株進行了單克隆化，對其中能在mdck細胞中能夠有效復(fù)制的w7-757、w7-791和w7-797三株病毒進行擴增，篩選出表現(xiàn)出更好的復(fù)制能力和較低的細胞毒性的w7-791病毒；

(b)弱毒活疫苗遺傳穩(wěn)定性檢測：將w7-791病毒在mdck細胞和小鼠體內(nèi)進行傳代，對從細胞或小鼠肺臟勻漿中獲得病毒的基因序列中的m基因的序列進行測定，確定w7-791病毒m基因的突變能夠被穩(wěn)定地遺傳下去；

(c)弱毒疫苗的安全性評估：用不同滴度的w7-791病毒免疫6-8周齡小鼠，沒發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生體重下降及流感癥狀；給15日齡的新生balb/c小鼠滴鼻接種不同滴度的w7-791或10⁴tcid50的野生型wsn病毒，對小鼠體重和肺臟病變進行檢測，w7-791接種小鼠上未觀察到像野生型wsn病毒感染小鼠那樣的體重下降和肺部病變，由此確定w7-791病毒即為流感病毒弱毒活疫苗毒株。

進一步地，步驟(2)中的電轉(zhuǎn)化的條件是2.0kv、200ω、25μf。

進一步地，步驟(2)中獲取病毒突變體庫的具體方法是：培養(yǎng)的hek293t細胞轉(zhuǎn)至6孔培養(yǎng)板中，待細胞匯合度達到80～90％時，按照轉(zhuǎn)染試劑操作說明，將含插入突變m基因的質(zhì)粒和含有流感病毒其他7個基因片段的質(zhì)粒等量混合，與轉(zhuǎn)染試劑按比例混勻，室溫孵育15min，逐滴加入hek293t細胞培養(yǎng)液中，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，收集轉(zhuǎn)染細胞上清，并將病毒接種于mdck細胞上進行擴增，感染48小時后收集病毒，將部分病毒凍存以備后用。

進一步地，步驟(3)中pcr使用novagen的pcr酶kodhot-startpolymerase，pcr的反應(yīng)條件是預(yù)變性95℃，10min；變性95℃，45s；退火52℃，30s；延伸72℃，90s；運行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

進一步地，步驟(3)中去除非特異性數(shù)據(jù)的方法為：(a)所有數(shù)據(jù)都滿足標準的默認檢測水平；(b)由于序列的初始70bp具有較強的非特異性背景，所以被去除；(c)所有的序列都與流感病毒m基因?qū)?yīng)的dna序列進行聯(lián)配；(d)對測序數(shù)據(jù)分別做相對于野生型a/wsn/1933病毒感染細胞、未感染病毒細胞、及不同基因文庫對照的歸一化處理。

進一步地，步驟(4)中確定弱毒疫苗候選毒株的標準為：病毒在感染后能夠有效地復(fù)制，且在6-8天時被機體清除。

進一步地，步驟(5)中的滴度為10⁶-10⁸tcid50。

通過本發(fā)明方法篩選得到的流感病毒弱毒活疫苗毒株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13784，分類命名：a型流感病毒，保藏日期：2017-02-21。其m基因具有如seqidno.1所示的序列。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果

mu噬菌體轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的隨機插入技術(shù)能夠快速、高通量獲得任何基因的高密度突變體庫，結(jié)合流感病毒反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，能獲得很大庫容的流感病毒突變體庫，該病毒突變體庫為篩選流感病毒弱毒疫苗毒株提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。這優(yōu)于傳統(tǒng)的通過冷適應(yīng)突變的辦法構(gòu)建弱毒疫苗毒株的方法。另外，該發(fā)明中綜合運用新興第二代高通量測序技術(shù)和小鼠體內(nèi)對病毒突變體庫進行篩選進而獲得弱毒活疫苗候選毒株的疫苗篩選技術(shù)，該技術(shù)也具有高通量、速度快和結(jié)果可靠等特點，可以大大縮短弱毒疫苗的研制周期。最后，本發(fā)明發(fā)展了一套系統(tǒng)全面的疫苗免疫效果評價體系，不但能夠科學(xué)評價疫苗為機體所能提供的免疫保護力，而且也能在一定程度上闡明疫苗提供免疫保護的具體機制，為疫苗的進一步改良和優(yōu)化提供幫助。

附圖說明

圖1轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的m基因片段突變流感病毒庫的建立流程示意圖；

圖2m基因突變體庫的基因分析圖；

圖3.用m基因突變體庫滴鼻感染小鼠后在不同時間所做的基因分型結(jié)果；

圖4.通過初次突變分離出來的不同突變克隆在m基因上的分布概況(a)；上述m基因突變質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到293t細胞中病毒滴度變化示意圖(b)；

圖5.流感病毒對mdck細胞活力的影響示意圖；

圖6.感染mdck細胞的病毒滴度變化示意圖；

圖7.本發(fā)明的流感病毒株(w7-791)與野生流感病毒株(wt-wsn)對小鼠的影響示意圖；

圖8.小鼠接種本發(fā)明的流感病毒株(w7-791)后，小鼠對同亞型流感病毒抵御作用示意圖；

圖9.小鼠對本發(fā)明的流感病毒株(w7-791)的免疫應(yīng)答示意圖。

其中，圖1中(a)在流感病毒(a/wsn/1933)m基因片段上利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的突變隨機插入15個堿基，獲得高密度突變的m基因質(zhì)粒庫。將獲得的m基因突變質(zhì)粒庫和其他七個野生型流感病毒基因反向遺傳學(xué)操作質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染來建立突變病毒庫。含有突變病毒庫的細胞上清被繼續(xù)用來感染mdck細胞或者直接感染小鼠。在不同時間點收集被感染的小鼠的肺和淋巴器官來分離病毒。導(dǎo)致病毒生長減緩的突變用基因分型鑒定出來并進一步評價體內(nèi)和體外感染效果；(b)用基因特異性引物和識別15nt插入片段的引物進行pcr擴增，并對獲得的pcr產(chǎn)物測序，就可獲得庫里所有突變點的位置。(c)流感突變庫可在體內(nèi)或體外做篩選。通過比較未被篩選和被篩選過的庫基因分型結(jié)果便可確定基因組中必需的和非必需的區(qū)域。

圖2中，流感病毒awsn(h1n1)m1和m2蛋白總體突變庫的基因分析結(jié)果概要(上部分)。柱狀表示基因中插入位點。所有突變庫被轉(zhuǎn)染到293t細胞中，并在mdck細胞中擴增幾輪，標記成1-4代。峰值代表的熒光強度反應(yīng)了病毒rna的量(下部分)。

圖3中，用m基因片段突變病毒庫滴鼻感染8只6-8周齡c57/b6小鼠.在不同時間點收集肺臟并做基因分型。各峰值表示插入位置的病毒rna量。pbs處理的和野生型wsn感染的肺勻漿作為陽性對照。

圖4中，從m基因突變庫里篩選出的的單個病毒克隆(a)通過初次突變分離出來的67個不同突變克隆在m基因上的分布概況。(b)上述m基因突變質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到293t細胞中，細胞上清被收集并測定病毒滴度。

圖6中，用0.25moi的野生型wsn病毒和w7-791病毒感染mdck細胞來檢測不同時間點的病毒滴度。

圖7中，(a，c)接種10⁶、10⁷或者10⁸tcid50的w7-791或野生型wsn病毒后小鼠體重檢測；(b，d)接種后第四和第六天病毒滴度測定；(e)w7-791、wsn或pbs接種新生balb/c小鼠后小鼠體重監(jiān)測。

圖8中，(a)小鼠免疫和病毒感染流程示意圖；(b-c)每組5只小鼠滴鼻免疫10⁵pfu的w7-791或者同體積pbs，免疫一個月后接種4倍mld50的wsn病毒，在病毒感染后定時檢測小鼠體重和存活狀況；(d-e)每組5只小鼠滴鼻免疫10⁵pfu的w7-791或者pbs，免疫一個月后接種4倍mld50的pr8病毒，病毒感染后定時檢測小鼠體重和存活狀況。***代表p-值<0.001。

圖9中，(a)小鼠肺勻漿液中病毒滴度檢測；(b)免疫小鼠血清hai活性檢測；(c)免疫小鼠血清抗流感病毒抗體檢測；(d)微量中和實驗測定w7-791免疫小鼠血清中的中和抗體滴度；(e-f)過繼w7-791免疫小鼠的血清到未免疫小鼠體內(nèi)，24小時后接種致死量的wsn和hk68/h3病毒，觀察并記錄各時間點小鼠存活率；(g-h)過繼w7-791免疫小鼠的t細胞到未免疫小鼠體內(nèi)，24小時后接種致死量的wsn和hk68/h3病毒，觀察并記錄各時間點小鼠的存活率。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，通過實施例對本發(fā)明進行具體描述和說明：

本發(fā)明所建立的新型流感病毒弱毒活疫苗篩選和評價方法的具體技術(shù)方案如圖1所示，具體描述如下：

1.利用mu噬菌體轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的隨機插入技術(shù)建立m基因的高密度突變庫

首先，根據(jù)finnzymes公司mu噬菌體轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的隨機插入突變試劑盒(mgskit,finnzymes)說明書的操作步驟，向流感病毒a/wsn/1933m基因個各堿基間插入5’-nnnnntgcggccgca-3’這一15nt長的寡核苷酸序列，從而獲得流感病毒m基因的高密度突變庫(如圖1a；圖2)。

2.通過流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)獲得病毒突變體庫

用電轉(zhuǎn)化的方法將攜有m基因突變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(e.coli)dh10b感受體細胞，電轉(zhuǎn)化的條件是2.0kv、200ω、25μf(electromaxtmdh10b,invitrogen)。從重組菌種提取m基因突變體庫質(zhì)粒，然后利用hoffmann等(pnas，2000)建立的a/wsn/33(h1n1)流感病毒8質(zhì)粒病毒反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)獲取病毒突變體庫。具體方法是：培養(yǎng)的hek293t細胞轉(zhuǎn)至6孔培養(yǎng)板中，待細胞匯合度達到80～90％時，按照轉(zhuǎn)染試劑操作說明，將含插入突變m基因的質(zhì)粒和含有流感病毒其他7個基因片段的質(zhì)粒等量混合，與轉(zhuǎn)染試劑按比例混勻，室溫孵育15min，逐滴加入hek293t細胞培養(yǎng)液中，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，收集轉(zhuǎn)染細胞上清，并將病毒接種于mdck細胞上進行擴增。感染48小時后收集病毒，將部分病毒凍存以備后用(如圖1a)。

3.通過第二代測序技術(shù)對病毒突變體庫組分進行分析

取上述所獲得的病毒突變體庫病毒在mdck細胞上進行傳代，然后利用trizol試劑(invitrogen)提取病毒rna，并對各rna按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒iscripttmcdnasynthesiskit(bio-rad)操作說明的要求進行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的cdna。以該cdna為模板，使用分別3個m基因的特異性正向引物(5’-agcaaaagcaggtagatatt-3’，5’-ggggccaaagaaatagcact-3’，5’-tcctagctccagtgctggtc-3’)與vic標記的插入序列特異性反向引物做pcr，pcr使用novagen的pcr酶kodhot-startpolymerase。pcr的反應(yīng)條件是預(yù)變性95℃10min(1循環(huán))；變性95℃，45s；退火52℃，30s；延伸72℃，90s；運行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min(1循環(huán))。由pcr獲得的熒光標記pcr產(chǎn)物(設(shè)置一次重復(fù))和liz-500分子量標準(appliedbiosystem)利用96-毛細管3730xldna分析儀(3730xldnaanalyzer,appliedbiosystems)進行測序(如圖1b)。所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)應(yīng)用abi軟件依照以下標準進行分析，(1)所有數(shù)據(jù)都滿足標準的默認檢測水平；(2)由于序列的初始70bp具有較強的非特異性背景，所以被去除；(3)所有的序列都與流感病毒m基因?qū)?yīng)的dna序列進行聯(lián)配；(4)對測序數(shù)據(jù)分別做相對于野生型a/wsn/1933病毒感染細胞、未感染病毒細胞、及不同基因文庫對照的歸一化處理，這樣就去除了pcr過程、引物及測序儀器產(chǎn)生的非特異性數(shù)據(jù)。

4.小鼠體內(nèi)篩選流感病毒弱毒活疫苗候選毒株

在本發(fā)明中，我們應(yīng)用小鼠模型和上述第二代測序技術(shù)鑒定病毒突變體庫組分的方法從m基因突變病毒庫中篩選流感病毒弱毒活疫苗候選毒株(如圖1a)。首先通過超速離心的方法濃縮突變體庫病毒，測定其病毒滴度后用于后續(xù)小鼠感染實驗。病毒通過滴鼻的方法感染6-8周齡的c57/b6小鼠，每組8只，分別在感染后第二天、第四天、第六天和第八天收取小鼠的肺臟組織并進行勻漿處理，從肺組織勻漿中用trizol試劑提取總rna，依照上述3的方法對樣本中病毒m基因進行測序并進行定量分析。在實驗中，以pbs處理和野生型wsn病毒感染小鼠肺組織中提取的總rna作為對照。利用上述3的方法對所提取rna中m基因的序列進行定性和定量分析，以確定不同m基因突變病毒在各樣本中的存在情況。我們觀察到三種不同復(fù)制動力學(xué)的病毒(如圖3)。如圖3所示，a簇病毒，這種病毒具有有效的復(fù)制能力，它們與野生型病毒一樣，可能會導(dǎo)致疾?。籦簇突變病毒可能由于突變影響了病毒基因和蛋白的結(jié)構(gòu)與功能或造成病毒逃逸宿主免疫應(yīng)答功能的喪失而被嚴重致弱，生長緩慢，這些病毒由于在機體內(nèi)幾乎不能存活，所以不能有效刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，所以不是理想的疫苗候選毒株。相比之下，c簇病毒雖然在感染后前六天能夠有效地復(fù)制，但是在6-8天時則被機體清除，此時幾乎檢測不到這些病毒的存在。這樣的病毒就能刺激機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，但由于其不能持續(xù)復(fù)制而不能引起疾病，所以就可以作為弱毒活疫苗候選毒株。

5.候選弱毒活疫苗毒株遺傳穩(wěn)定性和安全性評價

良好的弱毒活疫苗需要具有絕對的安全性，而且其表型和基因型需要能夠在代際之間穩(wěn)定遺傳。所以，我們對上述所篩選獲得的弱毒疫苗候選毒株進行系統(tǒng)全面的安全性和遺傳穩(wěn)定性評價是本技術(shù)體系非常重要的組成部分。為此，我們進行了如下實驗：(1)弱毒毒的分離和表型鑒定：我們首先對上述c簇病毒進行了單克隆化，一共獲得了67個病毒克隆。并對其中能在mdck細胞中能夠有效復(fù)制的w7-757、w7-791和w7-797三株病毒進行了擴增(圖4)。而其中w7-791表現(xiàn)出更好的復(fù)制能力和較低的細胞毒性(圖5，圖6)。所以我們初步認為w7-791可能是比較理想的弱毒疫苗候選毒株；(2)弱毒疫苗遺傳穩(wěn)定性檢測：為了確保疫苗不會發(fā)生回復(fù)突變，發(fā)生弱毒疫苗返祖的現(xiàn)象，我們將w7-791病毒在mdck細胞和小鼠體內(nèi)進行了一系列的傳代，對從細胞或小鼠肺臟勻漿中獲得病毒的基因序列特別是m基因的序列進行了測定，我們發(fā)現(xiàn)w7-791病毒m基因的突變能夠被穩(wěn)定地遺傳下去，并不會發(fā)生插入突變的刪除或回復(fù)突變的現(xiàn)象。而且隨著傳代次數(shù)的增多，w7-791病毒的滴度也逐漸降低。這說明w7-791病毒所具有的突變和表型能夠穩(wěn)定的遺傳下去。(3)疫苗的安全性評估：用不同滴度的w7-791病毒免疫6-8周齡小鼠，甚至是當(dāng)每只小鼠病毒接種量高達10⁷tcid50，我們也沒發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生體重下降及流感癥狀。與相比，10³tcid50的野生型wsn病毒感染的小鼠則出現(xiàn)明顯的流感癥狀并出現(xiàn)體重下降。w7-791感染小鼠6天病毒載量要比野生型wsn病毒及h3亞型病毒感染小鼠肺內(nèi)病毒滴度低100倍(圖7a，b，c，d)。如果觀察感染后4天小鼠的肺臟，我們發(fā)現(xiàn)pbs組和w7-791感染小鼠的肺臟沒有發(fā)生明顯病變，而野生型wsn病毒感染的小鼠則呈現(xiàn)嚴重的肺組織損傷。為了進一步確認w7-791的安全性，我們給15日齡的新生balb/c小鼠滴鼻接種不同量(10⁶,10⁷or10⁸tcid50)的w7-791或10⁴tcid50的野生型wsn病毒，小鼠體重和肺臟病變檢測結(jié)果表明，w7-791接種小鼠上未觀察到像野生型wsn病毒感染小鼠那樣的體重下降和肺部病變(圖7e)。這些結(jié)果都表明，我們篩選獲得的流感病毒突變株w7-791是只能在體外和體內(nèi)呈限制性復(fù)制，對成年和新生小鼠都具有較高安全新的弱毒株。

6.候選疫苗毒株保護效果的系統(tǒng)性評價

確定候選疫苗株后，就需要對其為機體所能提供的免疫保護力進行評價。其中主要涉及一下內(nèi)容：(1)免疫保護性檢測：用w7-791免疫小鼠，在免疫后一月，用4倍mld50的野生型wsn病毒或pr8病毒對小鼠進行感染。我們發(fā)現(xiàn)未免疫組小鼠在實驗過程中體重嚴重下降并死亡，而w7-791免疫小鼠一直保持了正常的體重，而且也未表現(xiàn)出任何流感癥狀(如圖8a-e)。(2)體液免疫水平檢測：通過流感病毒血凝抑制實驗或病毒中和實驗可以測定免疫小鼠血清中流感特異性抗體或病毒中和抗體。免疫小鼠抗體檢測結(jié)果表明，w7-791免疫的小鼠只產(chǎn)生了wsn病毒特異性的抗體，而沒有針對pr8病毒、hk68(h3n1)、wis(h3n2)病毒的抗體(如圖9a-c)。而將w7-791免疫小鼠的血清過繼轉(zhuǎn)移給未免疫小鼠，在用各種病毒對這些小鼠感染時，免疫小鼠血清除能提供部分針對wsn本身的保護了外，并不能保護其他病毒對小鼠的感染(圖9d-f)。這就說明體液免疫并不是w7-791病毒株所提供免疫力的唯一來源。(3)細胞免疫應(yīng)答水平檢測：將w7-791免疫小鼠的t淋巴細胞過繼轉(zhuǎn)移給未免疫小鼠，然后用不同的野生型流感病毒感染小鼠，觀察所過繼t淋巴細胞可能為小鼠所能提供的免疫力，從而確定t細胞免疫在疫苗保護中所發(fā)揮的作用。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)w7-791免疫小鼠的t細胞過繼轉(zhuǎn)移給未免疫小鼠后，能夠使小鼠獲得部分廣譜的保護力，從而在一定程度上降低小鼠在受到各種流感病毒感染時的發(fā)病程度和疾病癥狀(圖9d-f)。由此說明w7-791能有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性t細胞免疫應(yīng)答，這也符合流感病毒弱毒活疫苗免疫的特點。

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<110>蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所

<120>一種流感病毒弱毒活疫苗毒株的篩選和鑒定方法

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