本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域的分子標(biāo)記，特別涉及一個(gè)與黃瓜果實(shí)軟刺基因ts共分離的indel分子標(biāo)記。

背景技術(shù)：

黃瓜(cucumissativusl.)是葫蘆科(cucurbitaceae)甜瓜屬(cucumis)一年蔓生的草本植物，黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我國主栽蔬菜作物之一。

果實(shí)是黃瓜經(jīng)濟(jì)性狀最重要的部分，黃瓜果實(shí)屬于瓠果，由子房和花托共同發(fā)育而成。在黃瓜果實(shí)上有一個(gè)重要的性狀是果刺，果刺是黃瓜特化的表皮毛。到目前為止，黃瓜表皮毛基因的研究相對(duì)較少。2015年，zhaojl等利用mict微毛突變體和野生型雜交獲得的7936株f2群體，利用bsa法將mict基因定位在黃瓜第3號(hào)染色體遺傳距離為71.13kb的區(qū)間內(nèi)。詳細(xì)結(jié)果請(qǐng)參看：zhaojl等在《journalofintegrativeplantbiology》(植物生理學(xué)報(bào))2015年第57卷925-935頁發(fā)表的題為《micro-trichomeasaclassihomeodomain-leucinezippergeneregulatesmulticellulartrichomedevelopmentincucumissativus.》(微毛基因作為i型亮氨酸同源拉鏈基因調(diào)控黃瓜多細(xì)胞表皮毛發(fā)育)一文。同年，wangyl等利用tril無毛突變體和野生型雜交獲得的1058株f2群體，通過bsa法將控制表皮毛起始發(fā)育的tril基因定位在黃瓜6號(hào)染色體uw007183和uw007211標(biāo)記之間，遺傳距離為37.4kb，詳細(xì)結(jié)果請(qǐng)參看：wangyl等在《theoreticalandappliedgenetics》(理論應(yīng)用遺傳學(xué))2015年第129卷305-316頁發(fā)表的題為《identificationandmappingoftril,ahomeodomain-leucinezippergeneinvolvedinmulticellulartrichomeinitiationincucumissativus》一文。

mict基因(micro-trichomes)和tril基因(trichome-less)分別控制黃瓜微毛性狀和無毛性狀，由于果刺是表皮毛的特化，因此mict突變體的果刺性狀特點(diǎn)是小果刺，tril突變體的果刺性狀特點(diǎn)是無果刺。tril基因隱性上位于mict基因。csttg1基因平行并直接作用于tril基因，來調(diào)控黃瓜表皮毛的形成。因此，黃瓜果實(shí)軟刺基因ts的研究將為其他作物及黃瓜的表皮毛發(fā)育機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

隨著人們生活水平的提高，品質(zhì)育種已提到重要位置。黃瓜果刺性狀屬于感觀品質(zhì)范疇。歐美溫室類型的黃瓜為無果瘤、少刺的果皮，稱其為水果黃瓜，其市場價(jià)格為普通黃瓜的2-3倍。外觀光滑黃瓜污染少，清洗方便，食用衛(wèi)生，是無公害蔬菜的理想品種。經(jīng)檢測表明：無瘤少刺黃瓜果肉農(nóng)藥殘留量比有刺黃瓜低27％，果皮農(nóng)藥殘留量低18％。黃瓜軟刺柔軟不刺激，易脫落，增強(qiáng)了植株的抗逆性，是消費(fèi)者的更佳選擇?；騮s控制軟刺的形成，它的研究將會(huì)推動(dòng)品質(zhì)育種進(jìn)程。用與目的性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇在黃瓜遺傳育種中是十分有效的方法，分子標(biāo)記是在dna水平上對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，具有高效、快速、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點(diǎn)，可在苗期進(jìn)行選擇，加快育種的進(jìn)程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用分子標(biāo)記和bsa(bulkedsegregantanalysis)法，提供一種快速篩選黃瓜硬刺/軟刺果實(shí)類型的indel分子標(biāo)記，該標(biāo)記穩(wěn)定性高、可靠性強(qiáng)，在苗期就可以快速篩選、鑒定硬刺/軟刺瘤黃瓜果實(shí)類型的分子標(biāo)記，進(jìn)而縮短育種周期，加快黃瓜硬刺/軟刺性狀育種進(jìn)程。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種快速篩選黃瓜硬刺/軟刺果實(shí)類型的indel分子標(biāo)記，命名為indel-ts1，該標(biāo)記具有序列表seqidno.1所示的334個(gè)核苷酸序列。所述indel分子標(biāo)記與軟刺基因ts共分離。該indel分子標(biāo)記具有高穩(wěn)定性，可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于世界各地黃瓜硬刺/軟刺類型的篩選。

上述篩選硬刺/軟刺黃瓜果實(shí)類型與軟刺基因ts共分離的indel分子標(biāo)記，由seqidno.2所示的上游引物和seqidno.3所示的下游引物擴(kuò)增得到。引物由上海生工合成。其擴(kuò)增程序：94℃5min；32cycles；94℃25s；55℃25s；72℃25s；72℃5min。

本發(fā)明中的indel分子標(biāo)記與軟刺基因ts共分離，對(duì)于最終克隆ts基因具有很大的幫助，為研究果刺性狀的形成打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本發(fā)明利用多種硬刺親本和軟刺親本雜交獲得f1，f1單株均為硬刺；f1再自交獲得多種f2分離群體，通過對(duì)f2分離群體中硬刺、軟刺進(jìn)行遺傳學(xué)分析，確定黃瓜軟刺性狀屬于單基因隱性遺傳性狀。從f2群體中隨機(jī)各挑取10株硬刺單株和10株軟刺單株，并構(gòu)建硬刺池和軟刺池。采用ssr分子標(biāo)記結(jié)合bsa方法，篩選黃瓜軟刺連鎖分子標(biāo)記。最終將軟刺基因ts定位在109.7kb區(qū)間內(nèi)。在該109.7kb開發(fā)300對(duì)indel標(biāo)記，結(jié)合bsa法進(jìn)一步篩選連鎖標(biāo)記，最終其中indel分子標(biāo)記indel-ts1在親本間表現(xiàn)出多態(tài)性，并且與ts基因共分離。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：傳統(tǒng)的育種方法是根據(jù)植物的形態(tài)來進(jìn)行選擇，由于黃瓜軟刺性狀需要植株結(jié)瓜時(shí)才能確定，耗費(fèi)時(shí)間較長，本發(fā)明的分子標(biāo)記可在植物種子期間或子葉長出的早期階段就可鑒定，即省時(shí)也準(zhǔn)確，所以可用于黃瓜分子標(biāo)記輔助育種，加速黃瓜品質(zhì)育種的進(jìn)程。本發(fā)明的分子標(biāo)記與黃瓜軟刺性狀共分離，所有世界各地的黃瓜品種均可以用這個(gè)分子標(biāo)記篩選硬刺/軟刺品種(除無刺無瘤黃瓜品種gl)。

附圖說明

圖1：分子標(biāo)記indel-ts1的pcr擴(kuò)增效果：sa419-2為黃瓜果實(shí)硬刺親本；nc073為黃瓜果實(shí)軟刺親本；f1代表兩親本雜交后代；f2硬刺單株和f2軟刺單株分別代表在f2群體中隨機(jī)挑選的10株硬刺和10株軟刺植株。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例

一遺傳分離群體的構(gòu)建與黃瓜軟刺基因的鑒定

1.多種f2群體的構(gòu)建

構(gòu)建f2群體所用到的軟刺品種為：nc073。硬刺品種有：s77，sa419-2。本實(shí)施例利用這3個(gè)親本配制了雜交組合，得到f1代，f1代均為硬刺單株；f1代自交、回交產(chǎn)生f2代群體和bc1群體。在f2和bc1群體中出現(xiàn)硬刺和軟刺性狀分離現(xiàn)象，鑒定并統(tǒng)計(jì)硬刺/軟刺表型，分析硬刺和軟刺在f2和bc1中的分離比，利用卡方分析法進(jìn)行驗(yàn)證，最后得出黃瓜軟刺性狀屬于細(xì)胞核單基因控制的隱性性狀。

2.ts基因緊密連鎖ssr標(biāo)記和indel標(biāo)記的篩選

2.1黃瓜基因組dna的提取

用ctab法提取親本、bc1及f2分離群體的葉片總dna。方法為：取單株幼葉放于2ml離心管中，加入兩粒鋼珠，750ulctab提取緩沖溶液(60℃預(yù)熱)，研磨機(jī)60hz/90s研磨，60℃放置0.5-1h，中間緩慢搖勻1次。加等體積的氯仿，緩慢搖晃5min，12000r/min離心10min，吸取500ul上清，加入兩倍體積無水乙醇，-20℃放置30min，離心去上清，70％酒精洗兩次。晾干，1×te溶解。加入10ug/ml的rna酶。0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，核酸儀檢測其濃度。最終稀釋成50ng/ul的濃度，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2硬刺/軟刺基因池的建立

bsa法從f2分離群體中分別隨機(jī)選取硬刺株和軟刺株個(gè)體各10株，建立硬刺和軟刺黃瓜的基因池。

2.3標(biāo)記的篩選

用551對(duì)ssr引物組合和300對(duì)indel標(biāo)記對(duì)兩個(gè)親本及兩個(gè)基因池進(jìn)行篩選。反應(yīng)體系為基因組dna30ng，引物0.5μmol/l，200μmol/ldntps，2mmol/lmgcl2，1μl10×pcrreactionsbuffer，0.6utaqdna聚合酶，總反應(yīng)體系為10μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s55℃30s；72℃30s；32個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳緩沖液為0.5×tbe，160w恒功率，電泳3h。

電泳后進(jìn)行銀染。銀染方法為：將帶膠的玻璃板放入固定液中，在搖床上輕輕搖動(dòng)至指示劑顏色褪去，其中固定液的組成為：冰醋酸、無水乙醇、蒸餾水的體積比為1:10:100；用超純水洗1min-3min；將沖洗后的膠板放入染色液中搖動(dòng)半小時(shí)，其中染色液的組分為2g/l硝酸銀；將染色后的膠板放入超純水中漂洗后放入裝有顯色液的塑料盒中，輕輕搖動(dòng)至條帶清晰，放入自來水中沖洗，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并拍照。其中顯影液組分為：1l蒸餾水中加入30gnaoh和4ml甲醛混勻得到的。

在硬刺、軟刺兩個(gè)親本間和硬刺池、軟刺池之間表現(xiàn)出相同的多態(tài)性條帶，即硬刺親本sa419-2和硬刺基因池中的條帶一致，軟刺親本nc073和軟刺基因池條帶一致；而硬刺親本sa419-2和硬刺基因池中的條帶與軟刺親本nc073和軟刺基因池條帶不同。通過721株群體進(jìn)行遺傳連鎖分析，將與軟刺親本nc073的帶型一致的個(gè)體記為a，將與硬刺親本sa419-2帶型一致的個(gè)體記為b，雜合帶型記為h。結(jié)果該indel標(biāo)記與ts基因共分離，根據(jù)9930黃瓜基因組網(wǎng)站(http://www.icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/)顯示該indel標(biāo)記距離軟刺基因ts的物理距離為254bp。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

<110>江蘇師范大學(xué)

<120>快速篩選黃瓜硬刺/軟刺果實(shí)類型的indel分子標(biāo)記

<160>3

<210>1

<211>334

<212>dna

<213>黃瓜（cucumissativusl.）

<400>1

tcggagagacaatgagaaccgtttcggagatagcgtcaaaacgcaaatgtcgcaaaacga60

aaatggatagttgcaaatttagcaattaaattcaaattaattaagtatataaaacaattt120

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aaaatgggtttcaacaatagggacataaaatcgg334

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tcggagagacaatgagaacc20

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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