本發(fā)明屬于生物技術(shù)構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒、構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：急性肝衰竭是由多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟本身的合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙的一組臨床綜合征，其病因復(fù)雜，病情發(fā)展迅速，病死率極高(達(dá)80％)，目前尚缺乏特異的治療手段。其主要病理變化是肝細(xì)胞的大量死亡。己發(fā)現(xiàn)，急性肝衰竭的肝細(xì)胞主要死亡形式之一是凋亡，急性肝衰竭的發(fā)生與肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞的程序性死亡，是一個極其復(fù)雜、受基因精確調(diào)控的過程，在肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。近幾年來，越來越多的肝衰竭中肝細(xì)胞凋亡相關(guān)因子被發(fā)現(xiàn)，其功能不斷被研究。例如，已有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、TGF-β1、IGF-1、NGF過表達(dá)等均能誘導(dǎo)肝細(xì)胞大量凋亡，引發(fā)肝功能衰竭。盡管如此，肝衰竭發(fā)生機(jī)理到目前仍未完全闡明。因此，發(fā)現(xiàn)新的參與肝衰竭肝細(xì)胞凋亡的基因?qū)⒂谥谶M(jìn)一步了解肝衰竭發(fā)生機(jī)制，也為肝衰竭治療提供新的靶標(biāo)。我們在前期大鼠肝衰竭基因組學(xué)和肝再生基因組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，磷脂酶Cγ2(phospholipaseCgamma2，PLCγ2)基因在整個肝衰竭發(fā)生過程中及肝損傷引起的肝再生后期表達(dá)均顯著增強(qiáng)，系統(tǒng)生物學(xué)分析顯示該基因可能與肝細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。PLCγ2屬于PLCγ亞家族成員之一，PLCγ2被激活后水解PIP2產(chǎn)生IP3和DAG，二者可分別通過誘發(fā)Ca2+信號途徑和PKC信號途徑，扳動一系列生理生化活動。PLCγ2通常被認(rèn)為在炎癥反應(yīng)中起重要作用，近些年有研究發(fā)現(xiàn)，PLCγ2還參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。如Takatma等發(fā)現(xiàn)PLCγ2對細(xì)胞的生長起負(fù)調(diào)控效應(yīng)，敲除該基因后DT40細(xì)胞株凋亡不能被誘導(dǎo)，若將cDNA重新轉(zhuǎn)入該細(xì)胞中，凋亡即可恢復(fù)。張兵等發(fā)現(xiàn)活化的PLCγ2可通過PKCα信號通路誘導(dǎo)胃癌MGC80-3細(xì)胞的凋亡。RNA干擾是一種重要的基因沉默手段，相比基因敲除，實(shí)驗(yàn)相對簡單，篩選位點(diǎn)多，容易獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相對于傳統(tǒng)的反義核酸、核酶技術(shù)，該技術(shù)特異性高、技術(shù)流程設(shè)計更為簡單易行，抑制基因表達(dá)的效果更為顯著；療效迅速且持續(xù)性較好。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是基因轉(zhuǎn)錄后沉默的重要機(jī)制之一。雖然在哺乳動物細(xì)胞中siRNA能高效、特異性抑制基因的表達(dá)，但是人工合成RNA用一般的真核質(zhì)粒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效率低，難以成為基因治療藥物，也很難實(shí)現(xiàn)基因干涉的目的。為此，我們擬通過構(gòu)建靶向大鼠磷脂酶Cγ2基因的shRNA干擾重組腺病毒以下調(diào)PLCγ2基因表達(dá)，觀察抑制該基因表達(dá)對大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響，以期為肝衰竭治療提供新的靶標(biāo)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒、構(gòu)建方法及應(yīng)用，轉(zhuǎn)染效率高，可以作為基因治療藥物，實(shí)現(xiàn)基因干涉。本發(fā)明提供了一種大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒，靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒是將靶向大鼠磷脂酶Cγ2的寡核苷酸shRNA插入含有腺病毒基因組的骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG中后得到的，所述寡核苷酸shRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明還提供了一種上述靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒構(gòu)建方法，其特征在于，具體包括以下步驟：步驟1，單鏈shRNA寡核苷酸的合成步驟1.1，分別合成單鏈shRNA寡核苷酸的F序列和R序列；其中，F(xiàn)序列為：AATTCGCCAGCTTCGTGAGAAGATCATTCAAGAGATGATCTTCTCACGAAGCTGGCTTTTTTG；R序列為：GATCCAAAAAAGCCAGCTTCGTGAGAAGATCATCTCTTGAATGATCTTCTCACGAAGCTGGCG；步驟2，重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定步驟2.1，用EcoRI和BamHI雙酶切穿梭載體pHBAd-U6-GFP，凝膠回收線性化的、長序列片段的空載體；步驟2.2，將合成的F序列、R序列分別用1×TE稀釋成濃度為1μg/1μL，得到F溶液和R溶液，然后將F溶液和R溶液退火，形成退火產(chǎn)物雙鏈F/R；步驟2.3，將步驟2.2中的雙鏈F/R與步驟2.1中長序列片段的空載體連接，得到重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA；步驟3，重組大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒的構(gòu)建步驟3.1，將HEK293細(xì)胞接種于含10％FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中，于5％CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80％時，重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA和骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑LipofiterTM介導(dǎo)，共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，得到細(xì)胞混合物；步驟2.2，將所述細(xì)胞混合物接種于含10％FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中，按“8”字形晃動，5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)，6h后更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞出毒情況，當(dāng)細(xì)胞漸成葡萄狀并出現(xiàn)噬斑時，將從培養(yǎng)皿底部脫落的細(xì)胞收集至離心管中，離心管交替置于液氮和37℃水浴條件下凍融，然后離心，收集上清毒液，即得到Ad-PLCγ2shRNA第1代毒種P1；步驟2.3，用第一代毒種P1感染密度為90％的HEK293細(xì)胞，收集第二代毒種P2；步驟2.4，用第二代毒種P2感染密度為90％的HEK293細(xì)胞，收集第三代毒種P3，所述第三代毒種P3即為靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒。本發(fā)明還提供了一種上述靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒在抑制肝細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒、構(gòu)建方法及應(yīng)用，具有以下有益效果：1、本發(fā)明針對PLCγ2在肝細(xì)胞凋亡中的促進(jìn)作用，針對大鼠磷脂酶Cγ2基因的siRNA核苷酸序列，設(shè)計并合成基于腺病毒穿梭載體相應(yīng)的shRNA寡核苷酸序列，利用腺病毒載體自身攜帶的RNA依賴性聚合酶III的U6啟動子，在靶細(xì)胞中不斷產(chǎn)生靶向目的基因的shRNA，由于shRNA能被細(xì)胞內(nèi)Dicer酶加工成siRNA，發(fā)揮基因干涉作用；構(gòu)建PLCγ2重組腺病毒以代替基因的模式，可以針對性對細(xì)胞生長情況進(jìn)行調(diào)控，本發(fā)明的靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒，對大鼠肝細(xì)胞凋亡中有著顯著促進(jìn)作用，為肝衰竭的預(yù)防和治療提供新的治療思路。2、本發(fā)明是利用缺陷型腺病毒將靶向大鼠磷脂酶Cγ2基因的shRNA寡核苷酸引入大鼠肝細(xì)胞中，以抑制宿主細(xì)胞中磷脂酶Cγ2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而達(dá)到預(yù)防和治療肝衰竭的目的，效果顯著。附圖說明圖1是本發(fā)明的靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的流程圖；圖2是本發(fā)明所用的穿梭質(zhì)粒pHBAd-U6-GFP經(jīng)BamHI、EcoRI雙酶切的瓊脂糖凝膠鑒定結(jié)果；其中，泳道1為pHBAd-U6-GFP的BamHI/EcoRI雙酶切結(jié)果，泳道2為GeneRayDNAMarker；圖3是本發(fā)明的重組腺病毒包裝過程中光鏡下觀察到的細(xì)胞病變效應(yīng)(×100)；其中，圖3A是穿梭載體pHBAd-U6-GFP(空載體)與骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG共轉(zhuǎn)染后得到的第1代毒種P1，圖3C是圖3A中的第1代毒種P1感染后得到的第2代毒種P2，圖3E是圖3C中的第2代毒種P2感染后得到的第3代毒種P3；圖3B是重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA與骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG共轉(zhuǎn)染后得到的第1代毒種P1，圖3D是圖3B中的第1代毒種P1感染后得到的第2代毒種P2，圖3F是圖3D中的第2代毒種P2感染后得到的第3代毒種P3；圖4是本發(fā)明的Ad-PLCγ2shRNA轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察(×100)；其中圖4A為Ad-PLCγ2shRNA的結(jié)果，圖4B為Ad-U6-GFP空載的結(jié)果；圖5是本發(fā)明的Ad-PLCγ2shRNA對大鼠肝細(xì)胞中PLCγ2干擾效率的qRT-PCR檢測結(jié)果；圖6是本發(fā)明的Ad-PLCγ2shRNA感染大鼠肝細(xì)胞后PLCγ2蛋白表達(dá)的電泳圖；圖7是本發(fā)明的Ad-PLCγ2shRNA感染大鼠肝細(xì)胞后PLCγ2蛋白表達(dá)量；圖8是本發(fā)明的Ad-PLCγ2shRNA對大鼠肝細(xì)胞增殖活性影響情況；圖9是本發(fā)明的Ad-PLCγ2shRNA抑制大鼠肝細(xì)胞凋亡情況；其中，圖9A為對照組檢測結(jié)果，圖9B為Ad-PLCγ2shRNA組檢測結(jié)果，圖9C為Ad-U6-GFP空載組檢測結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，由于不涉及發(fā)明點(diǎn)，故不對其步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。下述實(shí)施例中穿梭載體pHBAd-U6-GFP和含有腺病毒基因組的骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG購自上海漢恒生物公司；HEK293細(xì)胞株購自上海漢恒，大腸桿菌菌株DH5α購自Invitrogen公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自GIBCO公司；BamHI、EcoRI限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNAladder購自Fermentas公司；質(zhì)粒DNA小、大量抽提試劑盒購自康為世紀(jì)；凝膠回收試劑盒購自Axygen；MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自美國Sigma公司；DNaseⅠ購自美國Roche公司；HiScriptReverseTranscriptase(RNaseH)購自genecopoeia公司；兔抗大鼠PLCγ2購于Abcam公司；小鼠抗大鼠β-actin、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗IgG、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗IgG購于武漢博士德生物工程有限公司；APC-Annexin/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒提取試劑盒購自南京凱基生物。本發(fā)明提供了一種靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒，將靶向大鼠磷脂酶Cγ2的寡核苷酸shRNA插入含有腺病毒基因組的骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG中后得到的，所述寡核苷酸shRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的流程如圖1所示，具體按照以下步驟構(gòu)建：步驟1，單鏈shRNA寡核苷酸的合成根據(jù)GenBank中大鼠PLCγ2基因序列(NM_017168.1)，利用Oligo公司的設(shè)計軟件OligonucleotideRNAiDesigner設(shè)計一條針對PLCγ2的siRNA寡核苷酸序列靶點(diǎn)，進(jìn)而設(shè)計基于pHBAd-U6-GFP穿梭載體的核苷酸序列，分別是單鏈shRNA寡核苷酸的F序列(核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)和R序列(核苷酸序列如SEQIDNO.3所示(見表1)，交由上海漢恒生物技術(shù)有限公司合成。設(shè)計依據(jù)如下：Ad-PLCγ2-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用TTCAAGAGA以避免形成終止信號；正義鏈模板的5’端添加了AATTC，與EcoRI酶切后形成的粘端互補(bǔ)，反義鏈模板的5’端添加了GATCC，與BamHI酶切形成的粘端互補(bǔ)。表1F序列和R序列及其相應(yīng)的PLCγ2RNA靶點(diǎn)步驟2，重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定步驟2.1，用EcoRI和BamHI雙酶切穿梭載體pHBAd-U6-GFP，其酶切體系如表2所示。表2酶切體系酶切體系在37℃下反應(yīng)1h，凝膠回收線性化的、長序列片段的空載體，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定結(jié)果顯示條帶在5000-6000bp之間(見圖2)，長序列片段的空載體的大小為5118bp，結(jié)果符合預(yù)期效果。步驟2.2，將合成的F序列、R序列分別用1×TE稀釋成濃度為1μg/1μL，得到F溶液和R溶液，然后將F溶液和R溶液退火，形成退火產(chǎn)物雙鏈F/R；F溶液和R溶液退火的體系如表3所示。表3F溶液和R溶液退火的體系10×Buffer2μLR溶液(1μg/1μL)1μLF溶液(1μg/1μL)1μLddH2O16μL總體系20μL退火條件為：95℃10min后，每隔10min降低20℃，最終至15℃退火10min形成雙鏈。步驟2.3，將步驟2.2中的雙鏈F/R與步驟2.1中長序列片段的空載體連接，得到重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA，連接體系如表4所示。表4雙鏈F1/R1與長序列片段的空載體連接體系F/R雙鏈(20μmol/L)1μL長序列片段的空載體(200ng/μL)1μLligasebuffer2μLT4DNAligase1μLH2O15μL總體系20μL以上連接體系在4℃過夜(時間大于12h)。步驟2.4，重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA的鑒定，具體步驟如下；吸取10μL重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA加入含有100μL大腸桿菌菌株DH5α的離心管中，輕輕混合均勻，在冰上放置30min。將離心管放到42℃水浴中熱激90s，取出后迅速放于冰上，冷卻2min。向離心管中加入5倍體積的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45-60min，8000rpm離心30s，去部分上清，留100μL左右培養(yǎng)液，吹打均勻后，用三角涂布棒涂布在含氨芐西林的選擇性LB平板上，倒置培養(yǎng)皿于37℃250r/min搖菌14h，待單菌落長出后，挑取重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA轉(zhuǎn)化的單菌落送往上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果顯示，克隆的重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA中shRNA干擾序列與本研究設(shè)計合成的靶序列正義鏈完全一致。這證明合成的寡核苷酸序列已插入到了穿梭載體pHBAd-U6-GFP中，成功構(gòu)建了重組穿梭質(zhì)粒。步驟3，大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒的構(gòu)建步驟3.1，將HEK293細(xì)胞接種于含10％Hyclon胎牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)液中，于5％CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞生長到對數(shù)生長期時(細(xì)胞密度70-80％)，將重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA和骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑LipofiterTM介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，得到細(xì)胞混合物。當(dāng)細(xì)胞生長到對數(shù)生長期時，具體共轉(zhuǎn)染的步驟如下：a.取2μg重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA和4μg骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG，用300μLDMEM完全培養(yǎng)液稀釋，室溫下放置5min，得到質(zhì)粒混合液。b.取15μLLipofiterTM，用300μLDMEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置5min，得到試劑溶液。c.將細(xì)胞混合液和試劑溶液混合，室溫下避光孵育20min，得到細(xì)胞混合物。步驟3.2，將所述細(xì)胞混合物接種于裝有含10％FBS的DMEM完全培養(yǎng)液的60mm培養(yǎng)皿中，按“8”字形晃動，5％CO2(體積分?jǐn)?shù))、37℃條件下培養(yǎng)，6h后更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)液。觀察細(xì)胞出毒情況，當(dāng)細(xì)胞漸成葡萄狀并出現(xiàn)噬斑時(8天左右)，表明重組腺病毒包裝成功。將從培養(yǎng)皿底部脫落的細(xì)胞收集至離心管中，離心管交替置于液氮和37℃水浴條件下進(jìn)行凍融，其中，液氮和37℃分別放置3次，3000rpm室溫離心5min，收集上清毒液，即得到Ad-PLCγ2shRNA第1代毒種P1(參見圖3)。步驟3.3，用第一代毒種P1感染密度為90％的HEK293細(xì)胞，收集第二代毒種P2，具體操作為：取3mL第一代毒種P1感染密度至少為90％的HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)3天后待染毒細(xì)胞脫落，將脫落的細(xì)胞置于新的離心管中，并將離心管交替置于液氮和37℃水浴條件下進(jìn)行凍融，其中液氮和37℃分別放置3次，3000rpm離心5min，收集上清毒液，收集第二代毒種P2(參見圖3)。步驟3.4，用第二代毒種P2感染密度為90％的HEK293細(xì)胞，收集第三代毒種P3，具體操作為：取3mL第二代毒種P2感染密度至少為90％的HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)3天后待染毒細(xì)胞脫落，將脫落的細(xì)胞置于新的離心管中，并將離心管交替置于液氮和37℃水浴條件下進(jìn)行凍融，其中，液氮和37℃分別放置3次，3000rpm離心5min，收集上清毒液，獲得第三代毒種P3(參見圖3)，所述第三代毒種P3即為靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒。需要說明的是，圖3是本發(fā)明的重組腺病毒包裝過程中光鏡下觀察到的細(xì)胞病變效應(yīng)(×100)；其中，圖3A是穿梭載體pHBAd-U6-GFP(空載體)與骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG共轉(zhuǎn)染后得到的第1代毒種P1，圖3C是圖3A中的第1代毒種P1感染后得到的第2代毒種P2，圖3E是圖3C中的第2代毒種P2感染后得到的第3代毒種P3；圖3B是重組質(zhì)粒pHBAd-PLCγ2shRNA與骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG共轉(zhuǎn)染后得到的第1代毒種P1，圖3D是圖3B中的第1代毒種P1感染后得到的第2代毒種P2，圖3F是圖3D中的第2代毒種P2感染后得到的第3代毒種P3。為了便于描述，以下實(shí)施例中將靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒采用“Ad-PLCγ2shRNA”的簡稱。下面，我們通過一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，來驗(yàn)證本發(fā)明Ad-PLCγ2shRNA的效果：一、滴度檢測對上述方法制備而成的Ad-PLCγ2shRNA的滴度進(jìn)行檢測，第三代毒種P3樣品滴度用改進(jìn)的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50％tissuecultureinfectivedose，TCID50)法測定。具體方法如下：首先培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞生長密度為80％時，胰酶消化細(xì)胞并計數(shù)細(xì)胞數(shù)量。用含5％FBS的DMEM培養(yǎng)液制備1×105/ml的細(xì)胞懸液，100μl/孔接種至96孔板。同時，在離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10-6～10-13。表5顯示的是三種重組干涉病毒的稀釋梯度。將稀釋好的病毒接種到96孔板中，100μl/孔，每個稀釋度設(shè)8個復(fù)孔，并設(shè)立2孔不含腺病毒的DMEM作為陰性對照。混勻后將96孔板置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8天后觀察細(xì)胞病變(CPE)情況，并對CPE孔計數(shù)，計算每行的陽性率。對于100μL樣品，按Karber法計算病毒滴度，方法如下：T＝101+d(s-0.5)，其中d＝log10稀釋度＝1(對10倍稀釋度而言)，s＝陽性比率之和(自第一個10倍稀釋度算起)；再根據(jù)公式T＝a×10bTCID50/mL＝a×10b-0.7PFU/mL，將TCID50/mL轉(zhuǎn)換成PFU/mL。注：兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的滴度值相差應(yīng)<100.7利用上述方法測得的Ad-PLCγ2shRNA的滴度如表5所示，Ad-PLCγ2shRNA感染滴度為1.58×1010PFU/ml，病毒滴度高。表5病毒滴度稀釋結(jié)果二、Ad-PLCγ2shRNA對大鼠肝細(xì)胞感染情況及干擾效率檢測需要說明的是，下述實(shí)施例中Ad-U6-GFP空載腺病毒的制備方法同Ad-PLCγ2shRNA，區(qū)別在于采用的是穿梭載體pHBAd-U6-GFP與骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。(1)熒光顯微鏡觀察感染情況取體外培養(yǎng)1周的大鼠肝細(xì)胞，以每孔1×106個細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。共分為Ad-PLCγ2shRNA組、Ad-U6-GFP空載組和對照組等共三組，每組3個重復(fù)孔。前2組依次滴加MOI為100Ad-PLCγ2shRNA和Ad-U6-GFP空載腺病毒，對照組則無病毒感染，在含10％FBS，HGF5ng/ml的DMEM條件培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，24h后熒光顯微鏡觀察感染效果并拍照，結(jié)果參見圖4，其中圖4A為Ad-PLCγ2shRNA的結(jié)果，圖4B為Ad-U6-GFP空載的結(jié)果。熒光顯微鏡下可見Ad-PLCγ2shRNA組和Ad-U6-GFP空載組細(xì)胞中均有綠色熒光蛋白表達(dá)，發(fā)綠色熒光的細(xì)胞占總數(shù)細(xì)胞的90％以上，說明構(gòu)建的重組腺病毒有效的感染了肝細(xì)胞，同時對細(xì)胞活性沒有明顯影響。(2)熒光實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)檢測Ad-PLCγ2shRNA干擾效率感染24h后收集各組細(xì)胞，用Trizol法分別提取各組細(xì)胞總RNA，在260/280nm波長下測定總RNA純度，各組比值均在1.8-2.0之間，滿足實(shí)驗(yàn)要求。取3.8μg總RNA，在EDC-810PCR儀中于70℃下反應(yīng)5min，短暫離心后置于冰上。反應(yīng)體系如表6所示。表6EDC-810PCR儀中的反應(yīng)體系將表6所示的反應(yīng)體系在EDC-810PCR儀中42℃下反應(yīng)60min，接著95℃下反應(yīng)5min，得到合成的cDNA，在ViiATM7熒光定量PCR儀中(ABI公司，美國)進(jìn)行PCR，其反應(yīng)體系如表7所示。表7熒光定量PCR儀中的PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)條件如下：50℃2min，95℃10min；95℃30sec，60℃30sec，共40個循環(huán)，行溶解曲線。其中，目的基因PLCγ2和內(nèi)參基因β-Actin引物序列用PrimerPremier5.0軟件，根據(jù)基因序列進(jìn)行設(shè)計，由北京擎科生物技術(shù)公司合成，序列如表8所示。最后以β-Actin為內(nèi)參基因，根據(jù)公式：相對含量＝2-ΔΔCt計算PLCγ2表達(dá)量，通過PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)及熒光信號強(qiáng)度分析并計算結(jié)果。表8實(shí)時定量PCR引物信息qRT-PCR結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，Ad-PLCγ2shRNA組細(xì)胞中PLCγ2mRNA水平顯著降低，為對照的0.05倍，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，Ad-PLCγ2shRNA組PLCγ2mRNA水平較對照組有顯著差異(p<0.01)，說明Ad-PLCγ2shRNA的干擾效率高，能顯著降低肝細(xì)胞中PLCγ2基因的表達(dá)量。(3)Ad-PLCγ2shRNA對大鼠肝細(xì)胞PLCγ2蛋白表達(dá)的影響設(shè)計對照組、Ad-PLCγ2shRNA組和Ad-U6-GFP空載組，每組3個重復(fù)孔。對照組細(xì)胞未用任何病毒進(jìn)行感染，Ad-PLCγ2shRNA組和Ad-U6-GFP空載組分別加入感染復(fù)數(shù)(Multiplicityofinfection，MOI)為100的Ad-PLCγ2shRNA和Ad-U6-GFP空載腺病毒。培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，用4℃預(yù)冷的PBS(0.01M，pH7.2)洗滌細(xì)胞3次，向各孔中加入含PMSF(100mM)的RIPA裂解液400μL(RIPA與PMSF的體積比例為100:1)，于冰上裂解30min，將細(xì)胞碎片及裂解液移至1.5ml離心管中，4℃下10000×g離心5min，收集上清液，得到提取蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。取40μg提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為10％)分離蛋白，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5％脫脂奶粉的TBST封閉液在室溫下封閉2h，分別滴加一抗[兔抗大鼠PLCγ2抗體(1：200體積稀釋)和小鼠抗大鼠β-actin抗體(內(nèi)參照)(1：200體積稀釋)]，4℃孵育過夜(大于12h)。用TBST洗膜(5min×6次)以洗去多余一抗，滴加相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗(1:50000體積稀釋)于37℃孵育2h，再用TBST洗膜(5min×6次)以除去多余二抗。經(jīng)ECL發(fā)光試劑顯色后，用X光膠片壓片、顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。晾干后掃描膠片，用BandScan5.0分析膠片灰度值。PLCγ2蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照β-actin蛋白條帶灰度值之比表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。本研究用免疫印跡方法檢測Ad-PLCγ2shRNA感染后大鼠肝細(xì)胞PLCγ2蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖6所示，圖6中能夠明顯的看到PLCγ2蛋白條帶，說明可以良好的表達(dá)大鼠肝細(xì)胞PLCγ2蛋白。轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞24h后，細(xì)胞中PLCγ2蛋白水平較對照組和Ad-U6-GFP空載組明顯降低，統(tǒng)計學(xué)顯示差異顯著(p<0.01)。對照組PLCγ2蛋白表達(dá)量為0.733±0.065，與Ad-U6-GFP空載組(0.764±0.091)相比無顯著差異(p>0.05)，結(jié)果參見圖7。表明Ad-PLCγ2shRNA可顯著抑制體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞PLCγ2蛋白的表達(dá)。三、Ad-PLCγ2shRNA對大鼠肝細(xì)胞增殖活性的影響設(shè)計對照組、Ad-PLCγ2shRNA組和Ad-U6-GFP空載組，將處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的大鼠肝細(xì)胞以每孔2×104個細(xì)胞接種于96孔板，每孔體積100μL，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，按上述方法(四-1所述的方法)進(jìn)行干擾重組腺病毒感染，每組5個復(fù)孔，另設(shè)陰性對照孔(即對照組)。分別用Ad-PLCγ2shRNA(Ad-PLCγ2shRNA組)和Ad-U6-GFP空載腺病毒(Ad-U6-GFP空載組)感染后24h、48h和72h每孔加入MTT(終質(zhì)量濃度5mg/mL)20μL，繼續(xù)孵育4h，加入二甲基亞砜150μL震蕩孵育10min，使結(jié)晶紫充分溶解。酶標(biāo)儀上在568nm波長處測定各孔吸光度(absorbance，A)，以無細(xì)胞培養(yǎng)液孔調(diào)零。細(xì)胞生長增殖率(％)＝實(shí)驗(yàn)組A/陰性對照組A值×100％。MTT檢測結(jié)果如圖8所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，Ad-PLCγ2shRNA組的吸光度值逐漸增強(qiáng)，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，各時間點(diǎn)的Ad-PLCγ2shRNA組的吸光度值均顯著高于相應(yīng)時點(diǎn)的對照組和Ad-U6-GFP空載組(p<0.01)，而對照組與Ad-U6-GFP空載組兩者之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，表明沉默PLCγ2基因可以促進(jìn)大鼠肝細(xì)胞的增殖。圖8顯示的是大鼠肝細(xì)胞在不同時點(diǎn)的增殖情況(與正常細(xì)胞組相應(yīng)時間段比，**p<0.01，n＝5)四、Ad-PLCγ2shRNA對大鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞周期影響設(shè)計對照組、Ad-PLCγ2shRNA組和Ad-U6-GFP空載組，將處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的大鼠肝細(xì)胞以每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔板，每孔體積2mL，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后用MOI＝100的Ad-PLCγ2shRNA感染細(xì)胞(Ad-PLCγ2shRNA組)，同時設(shè)置陰性對照組(即對照組)和陽性對照組(即Ad-U6-GFP空載組)。繼續(xù)在37℃、5％(v/v)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用不含EDTA的0.25％胰酶消化細(xì)胞，消化終止后收集細(xì)胞，1000rpm離心5min，去上清，PBS重懸潤洗2次。1000rpm，5min，去上清后用PBS重懸細(xì)胞，緩慢加入預(yù)冷的80％乙醇，4℃固定6h后棄離心上清(1000rpm，5min)，用預(yù)冷PBS洗2次。加入100μLRNase(50ug/ml)，37℃水浴30min；再加入400μLPI染液，4℃避光反應(yīng)30min。最后用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞周期的流式細(xì)胞檢測結(jié)果如表9顯示，轉(zhuǎn)染24h后，對照組和Ad-U6-GFP空載組在G1期細(xì)胞的比例分別為(76.64±0.32)％和(77.48±0.73)％，Ad-PLCγ2shRNA組G1期細(xì)胞比例則降至(74.77±1.31)％，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，后者與前兩組相比差異顯著(p<0.01)；而Ad-PLCγ2shRNA組S期細(xì)胞比例增加至(19.77±0.85)％，與對照組((16.10±0.94)％)和Ad-U6-GFP空載組((15.14±0.87)％)相比有極顯著增加(p＜0.01)。從以上數(shù)值可以看出，Ad-PLCγ2shRNA組肝細(xì)胞G1期縮短，S期延長，細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，細(xì)胞周期進(jìn)程加快。表9大鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞周期分布注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異極顯著(p﹤0.01)，相同大寫字母表示差異不顯著(p﹥0.05)。顯著性水平為p<0.05。五、Ad-PLCγ2shRNA對大鼠肝細(xì)胞凋亡率的影響設(shè)計對照組、Ad-PLCγ2shRNA組和Ad-U6-GFP空載組，將處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的大鼠肝細(xì)胞以每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔板，每孔體積2mL，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后用MOI＝100的Ad-PLCγ2shRNA感染細(xì)胞(Ad-PLCγ2shRNA組)，同時設(shè)置陰性對照組(即對照組)和陽性對照組(即Ad-U6-GFP空載組)。繼續(xù)在37℃、5％(v/v)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用不含EDTA的0.25％胰酶消化細(xì)胞，消化終止后收集細(xì)胞，1000rpm離心5min，去上清，PBS重懸洗2次。去上清后收集細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞沉淀加入到含5μL7-AAD染液的BindingBuffer中，混勻，室溫下避光反應(yīng)10min。反應(yīng)后加入450μLBindingBuffer，再加入1μLAnnexinV-APC，混勻，室溫下避光反應(yīng)10min。最后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測各組細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞檢測結(jié)果如圖9所示，其中圖9A為對照組檢測結(jié)果，圖9B為Ad-PLCγ2shRNA組檢測結(jié)果，圖9C為Ad-U6-GFP空載組檢測結(jié)果，圖9A、9B、9C中與縱軸平行的線為界限，左側(cè)為AnnexinV-APC(即熒光素APC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V)陰性，線右側(cè)為AnnexinV-APC陽性，左下象限(LL)為AnnexinV、7-AAD雙陰性，代表正?；罴?xì)胞；左上象限(UL)為7-AAD單陽性，代表細(xì)胞碎片及損傷的細(xì)胞；右下象限(LR)為AnnexinV單陽性，代表早期凋亡細(xì)胞；右上(UR)象限為AnnexinV、7-AAD雙陽性，代表晚期凋亡細(xì)胞。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24h后，對照組和Ad-U6-GFP空載組細(xì)胞凋亡率分別為9.87％和9.52％，而Ad-PLCγ2shRNA組細(xì)胞凋亡率降至4.89％，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，感染組凋亡率與其他兩組相比差異極顯著(p＜0.01)，表明抑制PLCγ2表達(dá)可抑制大鼠肝細(xì)胞凋亡。盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。序列表<110>河南科技大學(xué)<120>一種靶向大鼠磷脂酶Cγ2干擾重組腺病毒、構(gòu)建方法及應(yīng)用<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>883<212>DNA<213>人工序列<400>1ttcggatttcttggctttatatatcttgtggaaggacgaaacaccggtccgcagaattcg60ccagcttcgtgagaagatcattcaagagatgatcttctcacgaagctggcttttttggat120ccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatc180aattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggt240aaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgta300tgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacg360gtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattga420cgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactt480tcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttg540gcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccc600cattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcg660taacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatat720aagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgctaccggacgccaccatggtg780agcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgac840gtaaacgggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggc883<210>2<211>63<212>DNA<213>人工序列<400>2aattcgccagcttcgtgagaagatcattcaagagatgatcttctcacgaagctggctttt60ttg63<210>3<211>63<212>DNA<213>人工序列<400>3gatccaaaaaagccagcttcgtgagaagatcatctcttgaatgatcttctcacgaagctg60gcg63當(dāng)前第1頁1 2 3