本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因動物毛色報告基因表達載體構(gòu)建及其應用。

背景技術(shù)：

在轉(zhuǎn)基因動物制備過程中，經(jīng)常會使用到報告基因來“報告”目的基因相關(guān)的表達情況。常用的報告基因有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、β-乳糖苷酶基因、二氫葉酸還原酶基因、熒光蛋白基因等，其中用于活體檢測轉(zhuǎn)基因動物的常用報告基因主要為熒光蛋白基因。熒光蛋白家族是從水螅蟲綱和珊瑚類動物中發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)量為20～30kD的同源性蛋白，包括綠色、紅色、黃色和青色熒光蛋白等。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是其中應用的最多的一種，最初是從維多利亞發(fā)光水母(Aequorea victoria)中分離得到。由于對GFP研究及應用的突出貢獻，下村修、馬丁·莎爾菲、錢永健3位學者共同獲得了2008年的諾貝爾化學獎。利用GFP作為報告基因的優(yōu)點是在395nm的紫外光和475nm的藍色激發(fā)光激發(fā)下，可在508nm處自行發(fā)射綠色熒光，不需要輔助因子和底物，且GFP相對分子質(zhì)量小、熒光穩(wěn)定、對活細胞無害、檢測方法容易，可以用于活體動物檢測。缺點是：肉眼不可見，需要藍色激發(fā)光激發(fā)，需要實驗室配備熒光顯微鏡或者藍色激發(fā)光激發(fā)設備，對于檢測大型動物比較困難，需要配置較大的藍色激發(fā)光激發(fā)設備，成本較高等。

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是動物體黑色素細胞中黑色素合成的關(guān)鍵酶，TYR基因編碼序列長1592bp。它是一個含銅的氧化還原酶,催化酪氨酸氧化成多巴(dopa)，進一步將多巴氧化成多巴醌(dopaquinone)，多巴醌經(jīng)過一系列的生化反應最終合成黑色素。毛色白色的大鼠、小鼠、家兔、豬等動物中酪氨酸酶發(fā)生功能性突變，黑色素無法沉積，產(chǎn)生白化特征，從而呈現(xiàn)白色毛色性狀。因此，可以利用野生型TYR基因作為肉眼可見的報告基因，即利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在毛色白色動物中轉(zhuǎn)入野生型TYR基因，使之在皮膚組織中表達野生型TYR基因，表達后動物皮膚組織一定程度上恢復黑色素沉積，出現(xiàn)黑色表型，達到報告轉(zhuǎn)基因表達的目的。TYR基因作為報告基因的優(yōu)點是檢測方便、快捷，檢測成本低，動物表型明顯，易于觀察，不需要配備熒光顯微鏡等高端儀器，可以廣泛應用于轉(zhuǎn)基因動物制備效率評估和基因捕獲等功能基因組學研究等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測方便、快捷，檢測成本低，肉眼可見的毛色報告基因表達盒、載體及應用。

本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因動物毛色報告基因表達盒，該表達盒是由依次串聯(lián)的兩個人TYR增強子，人TYR啟動子，小鼠TYR基因和bGH polyA組成；其序列如SEQ ID NO.13 所示。

本發(fā)明中所述的毛色報告基因表達盒是由依次串聯(lián)的2個人TYR增強子，人TYR啟動子，小鼠TYR基因和牛生長激素(bGH)多聚腺苷酸(polyA)組成；所述人TYR增強子克隆自人基因組，長度為204個核苷酸序列，能夠在皮膚組織中特異增強目標基因表達；所述人TYR啟動子克隆自人基因組，長度為262個核苷酸序列，能夠驅(qū)動TYR基因在皮膚組織中特異表達；所述小鼠TYR基因克隆自小鼠基因組cDNA，全長為1592個核苷酸序列；所述bGH polyA克隆自質(zhì)粒pT3-PGK-NEO，長度為232bp。

本發(fā)明還公開了一種轉(zhuǎn)基因動物毛色報告基因表達載體，該載體含有上述的轉(zhuǎn)基因動物毛色報告基因表達盒。

本發(fā)明公開了序列如SEQ ID NO.13的基因表達盒作為毛色報告基因的應用。具體是：將含有所述基因表達盒的表達載體轉(zhuǎn)入毛色為白色的宿主動物基因組，轉(zhuǎn)基因表達后，轉(zhuǎn)基因宿主動物的皮膚組織的黑色素沉積恢復，產(chǎn)生毛色變化，肉眼可直接觀察轉(zhuǎn)基因的表達情況。

本發(fā)明進一步公開了上述轉(zhuǎn)基因動物毛色報告基因表達盒在制備轉(zhuǎn)基因動物中的應用。轉(zhuǎn)基因宿主動物的皮膚組織的黑色素沉積恢復，產(chǎn)生毛色變化，肉眼可直接觀察轉(zhuǎn)基因的表達情況。所述宿主動物的背景毛色為白色。

本發(fā)明所述的表達載體優(yōu)點在于將表達載體轉(zhuǎn)入毛色為白色的宿主動物基因組，轉(zhuǎn)基因表達后，產(chǎn)生黑色素沉積，能夠在宿主動物的皮膚、毛發(fā)等部位肉眼直接觀察到毛色變化，直接反應目的基因表達情況。應用本發(fā)明中構(gòu)建的載體，以小白鼠為宿主動物制備轉(zhuǎn)基因鼠，成功獲得轉(zhuǎn)基因后代，并觀察到毛色變化，獲得黑鼠，表明該載體可以作為報告基因應用。

附圖說明

圖1：PCR擴增bGH polyA產(chǎn)物電泳圖；

圖2：PCR擴增TYR增強子1產(chǎn)物電泳圖；

圖3：PCR擴增TYR增強子2產(chǎn)物電泳圖；

圖4:PCR擴增TYR啟動子產(chǎn)物電泳圖；

圖5:PCR擴增TYR基因產(chǎn)物電泳圖；

圖6：phEN-Pro-TYR質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖；

圖7：pLB-PG-TYR質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖；

圖8：pLB-PG-TYR載體示意圖

圖9：PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠TYR基因產(chǎn)物電泳圖；

圖10：轉(zhuǎn)基因小鼠5日齡照片。

具體實施方式

下述實施例中提到的實驗方法，如無特別說明均為常規(guī)方法。

pT3-PGK-NEO質(zhì)粒公開于下述文獻：沈丹,謝雨琇,李慶平,等.多轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)座特性比較研究.中國農(nóng)業(yè)科學,2015,48(11):2270-2278.；申請人可向公眾提供。

實施例I、毛色報告基因表達載體pPG-TYR的構(gòu)建

1、phEN-Pro-TYR載體構(gòu)建

首先采用高保真PCR法以pT3-PGK-NEO質(zhì)粒為模板克隆bGH polyA(引物序列：bGHpA F:TctagaCtagagctcgctgatcagcc(SEQ ID NO.1)；bGHpA R:TctagaCatatgtccccagcatgcctgctatt(SEQ ID NO.2))，反應體系為50l，10μL 5×SF Buffer、1l dNTP、2μL 10μM bGHpAF、2l 10μM bGHpAR、1μL PhantaTM Super-Fidelity，1μl pT3-PGK-NEO(5ng)為模板，加超純水至50μL(高保真酶購自諾唯贊公司)。PCR擴增程序：94℃40s，55℃40s，72℃30s，循環(huán)30次。PCR擴增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖1)。將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，與T載體(購自天根生化科技有限公司)連接，進行TA克隆，篩選出陽性克隆測序，測序比對正確后保存供下一步連接用。

TA克隆方法同上，采用高保真PCR法，分別以人基因組、小鼠基因組cDNA為模板克隆人

TYR增強子、人TYR啟動子，小鼠TYR基因，引物序列如下：

hTyr-ENAF:CATATG ACGCGTaattctgtcttcgagaacat(SEQ ID NO.3)；

hTyr-ENAR:GAATTCccatggaaatgctgcctctgg；(SEQ ID NO.4)

hTyr-ENBF:GAATTC aattctgtcttcgagaacat；(SEQ ID NO.5)

hTyr-ENBR:GATATCccatggaaatgctgcctctgg；(SEQ ID NO.6)

hTyr-ProF:GATATC attctaaccataagaattaa；(SEQ ID NO.7)

hTyr-ProR:GCGGCCGCcaggaactggctaattggag；(SEQ ID NO.8)

TyrCDF:gcggccgcCTAAAGGAGAAAATGTTCTTGGCTG；(SEQ ID NO.9)

TyrCDR:tctagaTCACAGATGGCTCTGATACAGC(SEQ ID NO.10)(如圖2-5)。測序正確后，將各元件(2個人TYR增強子、人TYR啟動子，小鼠TYR基因和bGH polyA)通過限制性內(nèi)切酶位點按順序先后克隆至質(zhì)粒載體pcDNA3(pcDNA3為商品化質(zhì)粒，購自Addgene公司)，獲得含多元件的重組載體，經(jīng)電泳和酶切鑒定正確后(如圖6)，將此載體命名為phEN-Pro-TYR。

2、pLB-PG載體構(gòu)建

化學合成5’、3’TIR及酶切位點(單鏈序列：PG-92:GGATCCTACCGTATTTTCCGCACTATAAGGCGCACCTCGCGAGCGGCCGCGAATTCGGTG CGCCTTATAGTGCGGAAAATACGGTAGGATCC(SEQ ID NO.11))，將合成的單鏈核苷酸退火，與T載體連接，進行TA克隆，篩選出陽性克隆測序，測序比對正確后保存供下一步連接用，將此載體命名為pLB-PG。

3、pLB-PG-TYR載體構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶NdeI酶切phEN-Pro-TYR載體，瓊脂糖凝膠回收毛色報告基因表達盒(2555bp)。同時用平端限制性內(nèi)切酶NruI酶切pLB-PG載體，回收約2996bp的DNA片段作為載體框架。將上述回收的毛色報告基因表達盒和pLB-PG框架16℃過夜連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Top10，提質(zhì)粒進行電泳及酶切鑒定(如圖7)，陽性克隆者命名為pLB-PG-TYR。載體示意圖如圖8所示，載體序列見SEQ ID NO.12(其中5’TIR 378-407，人TYR增強子1421-624，人TYR增強子2 631-834，人TYR啟動子841-1102，小鼠TYR基因1111-2702，bGH polyA 2731-2962，3’TIR 2982-3011，ColE Origin 3629-4509，Amp CDS 4573-5230)。

實施例II、含毛色報告基因表達載體制備的轉(zhuǎn)基因小鼠的驗證

1、表達TYR基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備

本試驗采用的小鼠品系為FVB小鼠。成熟雌小鼠腹腔內(nèi)注射5國際單位(IU)的孕馬血清促性腺激素(PMSG)之后，約在48—54h后再注射2.5-5.0IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG)，約12h后即可誘發(fā)排卵。雌小鼠給予hCG后立刻與雄性小鼠合籠。交配后雌鼠的陰道栓易見，可用交配指示劑指示。受精卵于合籠后次晨顯微注射前幾小時收集。將輸卵管仔細切開，采用輸卵管沖洗術(shù)或輸卵管壺部切開術(shù)收集受精卵。

pLB-PG-TYR質(zhì)粒用OMEGA無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取。用限制性內(nèi)切酶BamHI將環(huán)狀pLB-PG-TYR質(zhì)粒線性化，原核顯微注射小鼠受精卵，將注射后受精卵移植到代孕母鼠體內(nèi)，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。

2、轉(zhuǎn)基因小鼠的整合檢測

檢測1中獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠后代中外源基因的整合情況。

檢測方法一：肉眼觀察。通過觀察小鼠皮膚和毛色是否沉積黑色素。

檢測方法二：剪尾檢測。利用TYR基因的引物(TyrCDF和TyrCDR)，通過普通PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠基因組DNA中相應載體元件的整合。輔助驗證檢測方法一是否有效。PCR反應體系為20μL，2×Taq mix、1μL 10μM引物F、1μL 10μM引物R、，100ng小鼠尾組織DNA，加超純水至20μL(2×Taq mix購自諾唯贊公司)。PCR擴增程序：95℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min30s，循環(huán)30次，最后72℃延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出能擴增出TYR基因的鼠為轉(zhuǎn)基因陽性鼠。

PCR結(jié)果顯示3號小鼠可擴增出TYR基因的目的條帶，其余不能擴增出條帶(圖9)。觀察新生小鼠的皮膚和毛色，3號小鼠顯示有黑色素沉積，呈現(xiàn)黑色表型，其余小鼠的皮膚和毛色，沒有黑色素沉積，呈現(xiàn)白色表型(圖10)。兩種檢測方法的結(jié)果一致，說明通過肉眼觀察來判定轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測方法可行。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是為了說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 揚州大學

<120> 一種轉(zhuǎn)基因動物毛色報告基因表達盒、表達載體及應用

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctagactag agctcgctga tcagcc 26

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctagacata tgtccccagc atgcctgcta tt 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catatgacgc gtaattctgt cttcgagaac at 32

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaattcccat ggaaatgctg cctctgg 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaattcaatt ctgtcttcga gaacat 26

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatatcccat ggaaatgctg cctctgg 27

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatatcattc taaccataag aattaa 26

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcggccgcca ggaactggct aattggag 28

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcggccgcct aaaggagaaa atgttcttgg ctg 33

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tctagatcac agatggctct gatacagc 28

<210> 11

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggatcctacc gtattttccg cactataagg cgcacctcgc gagcggccgc gaattcggtg 60

cgccttatag tgcggaaaat acggtaggat cc 92

<210> 12

<211> 5620

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcccctgcag ccgaattata ttatttttgc caaataattt ttaacaaaag ctctgaagtc 60

ttcttcattt aaattcttag atgatacttc atctggaaaa ttgtcccaat tagtagcatc 120

acgctgtgag taagttctaa accatttttt tattgttgta ttatctctaa tcttactact 180

cgatgagttt tcggtattat ctctattttt aacttggagc aggttccatt cattgttttt 240

ttcatcatag tgaataaaat caactgcttt aacacttgtg cctgaacacc atatccatcc 300

ggcgtaatac gactcactat agggagagcg gccgccagat cttccggatg gctcgagttt 360

ttcagcaaga tggatcctac cgtattttcc gcactataag gcgcacctcg tatgacgcgt 420

aattctgtct tcgagaacat agaaaagaat tatgaaatgc cacatgtggt tacaagtaat 480

gcagacccaa ggctccccag ggacaagaag tcttgtgtta atctctttgt ggctctgaaa 540

gaaagagaga gagaaaagat taagcctcct tgtggagatc atgtgatgac ttcctgattc 600

cagccagagg cagcatttcc atgggaattc aattctgtct tcgagaacat agaaaagaat 660

tatgaaatgc cacatgtggt tacaagtaat gcagacccaa ggctccccag ggacaagaag 720

tcttgtgtta atctctttgt ggctctgaaa gaaagagaga gagaaaagat taagcctcct 780

tgtggagatc atgtgatgac ttcctgattc cagccagagg cagcatttcc atgggatatc 840

attctaacca taagaattaa actattaatg gtgaatagag tttttcactt taacataggc 900

ctatcccact ggtgggatac gagccaattc gaaagaaaag tcagtcatgt gcttttcaga 960

ggatgaaagc ttaagataaa gactaaaagt gtttgatgct ggaggtggga gtggtattat 1020

ataggtctca gccaagacat gtgataatca ctgtagtagt agctggaaag agaaatctgt 1080

gactccaatt agccagttcc tggcggccgc ctaaaggaga aaatgttctt ggctgttttg 1140

tattgccttc tgtggagttt ccagatctct gatggccatt ttcctcgagc ctgtgcctcc 1200

tctaagaact tgttggcaaa agaatgctgc ccaccatgga tgggtgatgg gagtccctgc 1260

ggccagcttt caggcagagg ttcctgccag gatatccttc tgtccagtgc accatctgga 1320

cctcagttcc ccttcaaagg ggtggatgac cgtgagtcct ggccctctgt gttttataat 1380

aggacctgcc agtgctcagg caacttcatg ggtttcaact gcggaaactg taagtttgga 1440

tttgggggcc caaattgtac agagaagcga gtcttgatta gaagaaacat ttttgatttg 1500

agtgtctccg aaaagaataa gttcttttct tacctcactt tagcaaaaca tactatcagc 1560

tcagtctatg tcatccccac aggcacctat ggccaaatga acaatgggtc aacacccatg 1620

tttaatgata tcaacatcta cgacctcttt gtatggatgc attactatgt gtcaagggac 1680

acactgcttg ggggctctga aatatggagg gacattgatt ttgcccatga agcaccaggg 1740

tttctgcctt ggcacagact tttcttgtta ttgtgggaac aagaaattcg agaactaact 1800

ggggatgaga acttcactgt tccatactgg gattggagag atgcagaaaa ctgtgacatt 1860

tgcacagatg agtacttggg aggtcgtcac cctgaaaatc ctaacttact cagcccagca 1920

tccttcttct cctcctggca gatcatttgt agcagatcag aagagtataa tagccatcag 1980

gttttatgcg atggaacacc tgagggacca ctattacgta atcctggaaa ccatgacaaa 2040

gccaaaaccc ccaggctccc atcttcagca gatgtggaat tttgtctgag tttgacccag 2100

tatgaatctg gatcaatgga tagaactgcc aatttcagct ttagaaacac actggaagga 2160

tttgccagtc cactcacagg gatagcagat ccttctcaaa gtagcatgca caatgcctta 2220

catatcttta tgaatggaac aatgtcccaa gtacagggat cggccaacga tcccattttt 2280

cttcttcacc atgcttttgt ggacagtatt tttgaacaat ggctgcgaag gcaccgccct 2340

cttttggaag tttacccaga agccaatgca cctatcggcc ataacagaga ctcttacatg 2400

gttcctttca taccgctcta tagaaatggt gatttcttca taacatccaa ggatctggga 2460

tatgactaca gctacctcca agagtcagat ccaggctttt acagaaatta tattgagcct 2520

tacttggaac aagccagtcg tatctggcca tggcttcttg gggcagcact ggtgggagct 2580

gttattgctg cagctctctc tgggcttagc agtaggctat gccttcagaa gaagaagaag 2640

aagaagcaac cccaggagga aaggcagcca ctcctcatgg acaaagacga ctaccacagc 2700

ttgctgtatc agagccatct gtgatctaga ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc 2760

cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 2820

gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta 2880

ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag 2940

acaatagcag gcatgctggg gacatgagcg gccgcgaatt cggtgcgcct tatagtgcgg 3000

aaaatacggt aggatccatc tttctagaag atctcctaca atattctcag ctgccatgga 3060

aaatcgatgt tcttctttta ttctctcaag attttcaggc tgtatattaa aacttatatt 3120

aagaactatg ctaaccacct catcaggaac cgttgtaggt ggcgtgggtt ttcttggcaa 3180

tcgactctca tgaaaactac gagctaaata ttcaatatgt tcctcttgac caactttatt 3240

ctgcattttt tttgaacgag gtttagagca agcttcagga aactgagaca ggaattttat 3300

taaaaattta aattttgaag aaagttcagg gttaatagca tccatttttt gctttgcaag 3360

ttcctcagca ttcttaacaa aagacgtctc ttttgacatg tttaaagttt aaacctcctg 3420

tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acattatacg agccggaagc ataaagtgta 3480

aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgccaa 3540

ttgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 3600

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 3660

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 3720

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 3780

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 3840

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 3900

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 3960

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 4020

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 4080

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 4140

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 4200

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg 4260

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 4320

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 4380

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 4440

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 4500

tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 4560

ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 4620

catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 4680

ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 4740

caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 4800

ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 4860

tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 4920

cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 4980

aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 5040

tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 5100

gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 5160

cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 5220

aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 5280

tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 5340

tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 5400

gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 5460

atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 5520

taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta 5580

tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 5620

<210> 13

<211> 2542

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aattctgtct tcgagaacat agaaaagaat tatgaaatgc cacatgtggt tacaagtaat 60

gcagacccaa ggctccccag ggacaagaag tcttgtgtta atctctttgt ggctctgaaa 120

gaaagagaga gagaaaagat taagcctcct tgtggagatc atgtgatgac ttcctgattc 180

cagccagagg cagcatttcc atgggaattc aattctgtct tcgagaacat agaaaagaat 240

tatgaaatgc cacatgtggt tacaagtaat gcagacccaa ggctccccag ggacaagaag 300

tcttgtgtta atctctttgt ggctctgaaa gaaagagaga gagaaaagat taagcctcct 360

tgtggagatc atgtgatgac ttcctgattc cagccagagg cagcatttcc atgggatatc 420

attctaacca taagaattaa actattaatg gtgaatagag tttttcactt taacataggc 480

ctatcccact ggtgggatac gagccaattc gaaagaaaag tcagtcatgt gcttttcaga 540

ggatgaaagc ttaagataaa gactaaaagt gtttgatgct ggaggtggga gtggtattat 600

ataggtctca gccaagacat gtgataatca ctgtagtagt agctggaaag agaaatctgt 660

gactccaatt agccagttcc tggcggccgc ctaaaggaga aaatgttctt ggctgttttg 720

tattgccttc tgtggagttt ccagatctct gatggccatt ttcctcgagc ctgtgcctcc 780

tctaagaact tgttggcaaa agaatgctgc ccaccatgga tgggtgatgg gagtccctgc 840

ggccagcttt caggcagagg ttcctgccag gatatccttc tgtccagtgc accatctgga 900

cctcagttcc ccttcaaagg ggtggatgac cgtgagtcct ggccctctgt gttttataat 960

aggacctgcc agtgctcagg caacttcatg ggtttcaact gcggaaactg taagtttgga 1020

tttgggggcc caaattgtac agagaagcga gtcttgatta gaagaaacat ttttgatttg 1080

agtgtctccg aaaagaataa gttcttttct tacctcactt tagcaaaaca tactatcagc 1140

tcagtctatg tcatccccac aggcacctat ggccaaatga acaatgggtc aacacccatg 1200

tttaatgata tcaacatcta cgacctcttt gtatggatgc attactatgt gtcaagggac 1260

acactgcttg ggggctctga aatatggagg gacattgatt ttgcccatga agcaccaggg 1320

tttctgcctt ggcacagact tttcttgtta ttgtgggaac aagaaattcg agaactaact 1380

ggggatgaga acttcactgt tccatactgg gattggagag atgcagaaaa ctgtgacatt 1440

tgcacagatg agtacttggg aggtcgtcac cctgaaaatc ctaacttact cagcccagca 1500

tccttcttct cctcctggca gatcatttgt agcagatcag aagagtataa tagccatcag 1560

gttttatgcg atggaacacc tgagggacca ctattacgta atcctggaaa ccatgacaaa 1620

gccaaaaccc ccaggctccc atcttcagca gatgtggaat tttgtctgag tttgacccag 1680

tatgaatctg gatcaatgga tagaactgcc aatttcagct ttagaaacac actggaagga 1740

tttgccagtc cactcacagg gatagcagat ccttctcaaa gtagcatgca caatgcctta 1800

catatcttta tgaatggaac aatgtcccaa gtacagggat cggccaacga tcccattttt 1860

cttcttcacc atgcttttgt ggacagtatt tttgaacaat ggctgcgaag gcaccgccct 1920

cttttggaag tttacccaga agccaatgca cctatcggcc ataacagaga ctcttacatg 1980

gttcctttca taccgctcta tagaaatggt gatttcttca taacatccaa ggatctggga 2040

tatgactaca gctacctcca agagtcagat ccaggctttt acagaaatta tattgagcct 2100

tacttggaac aagccagtcg tatctggcca tggcttcttg gggcagcact ggtgggagct 2160

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ttgctgtatc agagccatct gtgatctaga ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc 2340

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ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag 2520

acaatagcag gcatgctggg ga 2542