專利名稱：人抗凝血酶Ⅲ轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于對轉(zhuǎn)基因動物環(huán)境安全的檢測和評價(jià)領(lǐng)域，具體涉及一種人抗凝血酶 III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動物研究的不斷深入和加快，轉(zhuǎn)基因育種成為培養(yǎng)新品種的重要途徑，商業(yè)化轉(zhuǎn)基因動物即將面世的同時(shí)，與轉(zhuǎn)基因相伴而生的潛在的安全問題已引起世界各國的關(guān)注和重視[1_2]。轉(zhuǎn)基因動物是通過基因工程技術(shù)使生物遺傳信息發(fā)生了轉(zhuǎn)移、替換、融合和表達(dá)的遺傳工程體，由于外源基因的插入，打破了原有的育種規(guī)律，改變了物種多樣性局面，可能發(fā)生潛在的生物環(huán)境安全問題，造成重大經(jīng)濟(jì)損失， 對人類生存造成威脅。因此，對轉(zhuǎn)基因動物環(huán)境安全的檢測和評價(jià)有利于保證人類健康和生態(tài)環(huán)境安全、促進(jìn)轉(zhuǎn)基因動物相關(guān)技術(shù)的快速健康發(fā)展。基因漂移是指轉(zhuǎn)基因生物中轉(zhuǎn)入的外來基因，轉(zhuǎn)移到相鄰的其他生物之中，從而改變其他生物的基因組成[3]。轉(zhuǎn)基因植物發(fā)生基因漂移可能引起的生態(tài)環(huán)境安全性問題已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，而轉(zhuǎn)基因動物發(fā)生基因漂移的可能性一直沒有被重視。因而研究轉(zhuǎn)基因動物發(fā)生基因漂移的可能性對于評價(jià)轉(zhuǎn)基因動物環(huán)境安全性具有重要的意義。本研究建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測抗凝血酶III的技術(shù)方法，并充分發(fā)揮了申請人青島森淼實(shí)業(yè)有限公司的轉(zhuǎn)基因羊資源優(yōu)勢M，開展抗凝血酶III (ATIII)轉(zhuǎn)基因羊環(huán)境安全性評估的初步研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)施研究一種人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法，其特征是包括如下步驟引物及Taqman探針設(shè)計(jì)，血液基因組DNA的制備，ATIII基因的擴(kuò)增，ATIII基因的克隆，熒光定量PCR檢測和敏感性評價(jià)及定量分析；其中，(1)引物及Taqman探針設(shè)計(jì)①利用Primer Primer 5. 0軟件分析人ATIII基因的序列NM_000488，設(shè)計(jì)并合成用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的人ATIII特異性引物F5’ -gtgataggaactgtaacct-3' ；R 5' -cggccagcaatcacaacag-3',②利用 Applied Biosystems 公司的 Primer Express 3. 0 軟件設(shè)計(jì) Taqman 探針和引物F 5 ’ -TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3’，R 5，-GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3，，Taqman 探針5，-(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)-3，，③利用BLAST在線軟件分析設(shè)計(jì)引物和探針序列的特異性；
(2)血液基因組DNA的制備血樣采用EDTA抗凝，血液置于1. 5ml離心管中4°C保存?zhèn)溆?；利用QIAGEN離心柱血液基因組提取試劑盒提取血液基因組；(3)ATIII基因的擴(kuò)增①以編號A22的轉(zhuǎn)ATIII基因羊血液基因組為模板；②PCR擴(kuò)增體系如下DNA模板 10ng，IOXEx Taq bufer 2· 5μ l，dNTP 2. 5mM 5μ1，引物F IOpM ，引物 R IOpM ，Taq 酶 0. 2 μ 1，ddH20 補(bǔ)至Ij 25 μ 1。反應(yīng)條件為 94°C 5min ;95°C 30S，55°C 30S， 72°C 1. 5min，25個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；擴(kuò)增片段大小為1263bp,以瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增效果并回收；G)ATIII基因的克隆利用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒將ATIII基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，膠回收產(chǎn)物連接到PMD18T載體中，轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α，挑取單克隆，PCR鑒定，并測序鑒定；(5)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度的計(jì)算將上述質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測定260nm與280nm波長下的OD值，計(jì)算DNA濃度并判斷其純度，然后轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)；(6)熒光定量PCR檢測；(7)敏感性評價(jià)及定量分析；(8)特異性評價(jià)上述的人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法，其特征是所述的與標(biāo)準(zhǔn)品對照計(jì)算每微升質(zhì)?？截悢?shù)的方法是①制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；標(biāo)準(zhǔn)品作10倍梯度稀釋，_20°C保存?zhèn)溆?；②樣品質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測定^Onm與^Onm波長下的OD值，然后按照下面的公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)每微升質(zhì)?？截悢?shù)=(質(zhì)量/ 分子量)X (6. 02 X IO23)=[質(zhì)粒濃度(ng/Ι μ 1) X 1 μ ] X 10_9/2404697 ]X (6. 02 X IO23個(gè)/mol)，其中6. 02 X IO23是阿佛加德羅常數(shù)；2404697是標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的分子
Mo上述的人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法，其特征是所述的熒光定量PCR檢測的方法是上述的人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法，其特征是所述的敏感性評價(jià)及定量分析的方法是25 μ 1 反應(yīng)體系包括 TaqMan Universal PCR Master Mix 緩沖液 12. 5 μ 1，血樣 DNA模板10ng，引物為300nM、探針為250nM，體系用ddH20補(bǔ)齊；特異性反應(yīng)條件為二溫循環(huán)，即95°C IOmin ；95°C 15s,60°C lmin, 40個(gè)循環(huán)；用矩陣法篩選引物和探針的最佳使用量。上述的人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法，其特征是所述的敏感性評價(jià)及定量分析的方法是RNA標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)1/10系列稀釋，利用建立的檢測體系對不同濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以確定檢測靈敏度；同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)品檢測擴(kuò)增曲線獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，對檢測樣品進(jìn)行定量分析。上述的人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法，其特征是所述的特異性評價(jià)的方法是利用建立的檢測體系對編號為A22的轉(zhuǎn)人ATIII基因羊血液基因組，非轉(zhuǎn)基因羊血液基因組，和其它對照動物血液基因組，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以驗(yàn)證其特異性；上述的人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法，其特征是所述的采取動物血液基因組樣品的方法是采用頸靜脈取血的方法分別采集轉(zhuǎn)ATIII基因羊血液基因組血液樣品，轉(zhuǎn)乙肝表面抗原基因羊血液樣品，轉(zhuǎn)干擾素轉(zhuǎn)基因羊血液樣品，野生型山羊血液樣品，家養(yǎng)犬靜脈血液樣品，試驗(yàn)用小鼠靜脈血液樣品；以及采用翅靜脈采血法采取家養(yǎng)雞血液樣品和家養(yǎng)鵝血液樣品；建立上述各動物血液基因組，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以驗(yàn)證人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法的特異性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的技術(shù)方案建立了靈敏、特異的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測人ATIII基因的技術(shù)方法，最低能檢測到Icopy的ATIII基因，并且檢測特異性高。在此基礎(chǔ)上，開展了抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊環(huán)境安全性評估的初步研究。完成了與ATIII轉(zhuǎn)基因羊密切接觸的同種和異種動物血液基因組中ATIII基因的檢測工作(共57 個(gè)樣本)。結(jié)果表明人ATIII基因沒有在轉(zhuǎn)基因羊和非轉(zhuǎn)基因羊及其它動物間發(fā)生漂移，提示轉(zhuǎn)基因羊?qū)τ诃h(huán)境是安全的。


圖1是實(shí)施例2的PCR克隆人ATIII基因片段示意圖；圖2是實(shí)施例3的熒光定量PCR檢測ATIII標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(1到1 X IO9Copy/ μ 1)的擴(kuò)增曲線示意圖；圖3是實(shí)施例3的定量PCR檢測ATIII的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖；圖4是實(shí)施例3的定量PCR的特異性試驗(yàn)示意圖；Α、轉(zhuǎn)ATIII基因羊血液基因組為模板；B、以非轉(zhuǎn)基因羊和小鼠血液基因組為模板；圖5是實(shí)施例4的定量PCR檢測野生型山羊、β -干擾素和乙肝表面抗原轉(zhuǎn)基因羊血液樣品中ATIII基因示意圖；圖6是實(shí)施例4的定量PCR檢測狗、雞和鵝血液樣品中ATIII基因示意圖；圖7是實(shí)施例4的FQ-PCR檢測ATIII轉(zhuǎn)基因羊血液樣品中ATIII基因示意圖。圖1中，泳道M :DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)品；泳道1 :ATIII基因PCR擴(kuò)增片段；圖中顯示ATIII基因被成功克隆。圖2中，縱坐標(biāo)是相對熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)是循環(huán)數(shù)；圖中顯示擴(kuò)增曲線呈標(biāo)準(zhǔn)的S 型，表明PCR反應(yīng)效率高。圖3中，縱坐標(biāo)是Ct值，橫坐標(biāo)是模板拷貝數(shù)的對數(shù)；圖中顯示熒光定量PCR的靈敏度可以達(dá)到lcopy/μ 1，但是當(dāng)濃度為lcopy/μ 1時(shí)，Ct值的重復(fù)性較差；標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3. 072，R2 為 0. 992.圖4中，縱坐標(biāo)是相對熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)是循環(huán)數(shù)；圖中顯示只有轉(zhuǎn)ATIII基因的羊血液基因組中能檢測到ATIII基因。圖5中，縱坐標(biāo)是相對熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)是循環(huán)數(shù)；圖中顯示野生型山羊血液中、 白介素6和乙肝表面抗原轉(zhuǎn)基因羊血液中均未檢測到AT3基因。圖6中，縱坐標(biāo)是相對熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)是循環(huán)數(shù)；圖中顯示狗、雞和鵝血樣中也未檢測到AT3基因的存在。圖7中，縱坐標(biāo)是相對熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)是循環(huán)數(shù)；圖中顯示轉(zhuǎn)ATIII基因羊血液中可以檢測到ATIII基因。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料及儀器野生型山羊、轉(zhuǎn)乙肝表面抗原基因羊、轉(zhuǎn)β-干擾素轉(zhuǎn)基因羊、轉(zhuǎn)ATIII基因羊、 狗、雞和鵝的血樣采集于青島森淼實(shí)業(yè)有限公司的轉(zhuǎn)基因動物養(yǎng)殖基地；血液基因組提取試劑盒，購自美國QIAGEN公司；TaqMan Universal PCR Master Mix，_ 自__ Applied Biosystems ^W]；Taqman探針及引物由大連Takara公司合成；其它普通生化試劑均為國產(chǎn)分析純。美國Applied Biosystems 公司 7500 熒光定量 PCR 儀和 9700 型 PCR 儀。實(shí)施例1引物及Taqman探針設(shè)計(jì)利用I^rimer 5. 0軟件分析人ATIII基因的序列(NM_000488)，設(shè)計(jì)并合成用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的人ATIII特異性引物(F :5’ -gtgataggaactgtaacct-3' ；R 5' -cggccagcaatcacaacag-3‘)。禾Ij用 Applied Biosystems 公司的 Primer Express 3. 0 軟件設(shè)計(jì) iTaqman 探針和引物(F:5，-TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3，；R :5，-GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3，Jaqman 探針5，-(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)-3，)。利用BLAST在線軟件分析設(shè)計(jì)引物和探針序列的特異性。引物及探針委托大連Takara公司合成。實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因羊血液基因組DNA制備、DNA擴(kuò)增及克隆1.轉(zhuǎn)基因羊血液基因組DNA的制備血樣采用EDTA抗凝，血液置于1. 5ml離心管中4°C保存?zhèn)溆谩＠肣IAGEN離心柱血液基因組提取試劑盒提取血液基因組。2.轉(zhuǎn)基因羊ATIII基因的擴(kuò)增以轉(zhuǎn)ATIII基因羊(試驗(yàn)編號A2》血液基因組為模板。PCR擴(kuò)增體系如下25 μ 1 的體系，DNA 模板 3 μ 1，IOXEx Taq bufer 2. 5 μ 1, dNTP(2. 5mM) 2. 5 μ 1, 引物 F(IOpM)，引物 R(IOpM)，Taq 酶 0.2 μ 1，ddH20 補(bǔ)到 25μ1。反應(yīng)條件為 94°C 5min ； 95°C 30S，55°C 30S，72°C 1. 5min，25 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 擴(kuò)增片段大小為 U63bp，以瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增效果并回收。3.轉(zhuǎn)基因羊ATIII基因的克隆利用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒將ATIII基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收(具體操作見試劑盒說明書)，膠回收產(chǎn)物連接到PMD18T載體中，轉(zhuǎn)化E.coli DH5ci，挑取單克隆，PCR鑒定，并測序鑒定。4.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度的計(jì)算將上述質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測定^Onm與^Onm波長下的OD值，判斷其純度 (0D :260nm/0D280nm > 1. 8者為純品)，然后按照下面的公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)每微升質(zhì)?？截悢?shù)=(質(zhì)量/分子量)X (6. 02 X IO23)=[質(zhì)粒濃度(ng/Ι μ 1) X 1 μ ] X 10_9/240 4697] X (6. 02Χ，其中:6. 02 X IOm是阿佛加德羅常數(shù)；2404697是標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的分子量。標(biāo)準(zhǔn)品作10倍梯度稀釋，-20°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例3熒光定量PCR檢測及分析1.熒光定量PCR檢測25 μ 1 反應(yīng)體系包括 TaqMan Universal PCR Master Mix 緩7中液 12. 5 μ 1，血樣 DNA模板10ng，引物和探針濃度按具體實(shí)驗(yàn)添加，體系用ddH20(雙蒸水double distilled water)補(bǔ)齊。特異性反應(yīng)條件為二溫循環(huán)(95°C IOmin ；95°C 15s，60°C lmin, 40cycle)。用矩陣法篩選引物和探針的最佳使用量。2.敏感性評價(jià)及定量分析RNA標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)1/10系列稀釋，利用建立的檢測體系對不同濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以確定檢測靈敏度。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)品檢測擴(kuò)增曲線獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，對檢測樣品進(jìn)行定量分析。3.特異性評價(jià)利用建立的檢測體系對轉(zhuǎn)ATIII基因羊血液基因組(試驗(yàn)編號A22)、非轉(zhuǎn)基因羊血液基因組(轉(zhuǎn)基因羊養(yǎng)殖基地外采集)和小鼠血液基因組等進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以驗(yàn)證其特異性。實(shí)施例4樣品檢測利用一次性注射器，采用頸靜脈取血的方法采集山羊血液樣品。共采集野生型山羊血樣9個(gè)(山羊編號為11、64、82、83、86、87、2-5、3-10)；采集轉(zhuǎn)乙肝表面抗原基因羊血樣10個(gè)(編號為H11、H16、H17、H26、H42、H48、H50、 H55、H65、H66)；采集轉(zhuǎn)β-干擾素轉(zhuǎn)基因羊血樣10個(gè)(編號為Β5、Β10、Β17、Β18、Β19、Β20、 Β21、Β22、Β23、Β24)；采集轉(zhuǎn)ATIII 基因羊血樣 8 個(gè)(編號為 Α08、Α23、Α38、Α39、Α41、Α43、Α46、Α54)；采用腿靜脈采血方法，采集狗靜脈血樣4個(gè)；采用翅靜脈采血方法，采集雞血樣8個(gè)、鵝血樣8個(gè)。提取血液基因組，做模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以評價(jià)ATIII基因是否發(fā)生漂移。結(jié)果與分析1人ATIII標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建以轉(zhuǎn)ATIII基因羊(試驗(yàn)編號Α22)血液基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到1300bp的片段參見附圖1，膠回收后克隆到PMD18T載體中。轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，挑取2個(gè)單克隆，PCR 鑒定均為陽性(結(jié)果未給出)，進(jìn)一步測序證明序列完全正確。2引物和探針濃度的優(yōu)化以相同量的陽性核酸為模板，引物和探針的濃度分別選取了 100、150、200、250和 300ηΜ五個(gè)濃度梯度，反應(yīng)條件為二溫循環(huán)(95°C IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，40cycle)，利用矩陣法對引物和探針的濃度進(jìn)行優(yōu)化，以閾值(Ct值)最小的條件為最佳反應(yīng)條件。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，當(dāng)引物和探針的濃度增加，Ct值相應(yīng)減小，而引物和探針的濃度在250 和300nM時(shí)Ct值沒有明顯變化。因而我們選擇引物為300nM、探針為250nM作為后續(xù)的試驗(yàn)條件。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線及熒光定量PCR靈敏度以十倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(1到lX109cOpy/y 1，共十個(gè)梯度)為模板進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線參見附圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線參見附圖3。結(jié)果表明，F(xiàn)Q-PCR的靈敏度可以達(dá)到lcopy/μ 1，但是當(dāng)濃度為lcopy/μ 1時(shí)，Ct 值的重復(fù)性較差；標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3. 072，R2為0. 992。附圖4定量PCR的特異性試驗(yàn)中，1 以轉(zhuǎn)ATIII基因羊血液基因組為模板；2 以非轉(zhuǎn)基因羊血液基因組為模板；3 以小鼠血液基因組為模板。為了研究FQ-PCR檢測人ATIII基因的特異性，同時(shí)檢測了轉(zhuǎn)ATIII基因羊血液基因組(試驗(yàn)編號A22)、非轉(zhuǎn)基因羊血液基因組和小鼠血液基因組，每個(gè)反應(yīng)加入IOng基因組DNA。如附圖4所示，只有轉(zhuǎn)ATIII基因的羊血液基因組中能檢測到ATIII的表達(dá)，證明了 FQ-PCR的特異性。附圖5中顯示，定量PCR檢測野生型山羊、β-干擾素和乙肝表面抗原轉(zhuǎn)基因羊血液樣品中ATIII基因利用QIAGEN離心柱血液基因組提取試劑盒提取血液基因組，提取的基因組利用紫外分光光度計(jì)測定0擬eOnm/OD^Onm，確定基因組DNA的純度和濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。檢查結(jié)果表明，提取的基因組DNA無RNA、蛋白污染，無降解。利用上面建立的轉(zhuǎn)基因羊血液中人ATIII實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，檢測血液基因組中ATIII基因DNA的含量。檢測結(jié)果顯示，野生型山羊血液中、β-干擾素和乙肝表面抗原轉(zhuǎn)基因羊血液中均未檢測到ATIII基因；同法，附圖6中顯示，定量PCR檢測狗、雞和鵝血樣中也未檢測到ATIII基因的存在；同法，附圖7中顯示，所有ATIII轉(zhuǎn)基因羊血樣中均檢測到ATIII基因。結(jié)果表明，ATIII轉(zhuǎn)基因羊的外源基因(人ATIII基因)在種內(nèi)和種間均未發(fā)生基因橫向轉(zhuǎn)移。參考文獻(xiàn)(References)[1]Adow D A, Zwahlen C. 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權(quán)利要求
1.一種人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法，其特征是包括如下步驟引物及Taqman探針設(shè)計(jì)，血液基因組DNA的制備，ATIII基因的擴(kuò)增，ATIII基因的克隆，熒光定量PCR檢測和敏感性評價(jià)及定量分析；其中，(1)引物及Taqman探針設(shè)計(jì)①利用PrimerPrimer 5. 0軟件分析人ATIII基因的序列NM_000488，設(shè)計(jì)并合成用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的人ATIII特異性引物F5’ -gtgataggaactgtaacct-3' ；R 5' -cggccagcaatcacaacag-3',②利用AppliedBiosystems公司的Primer Express 3· O軟件設(shè)計(jì)Taqman探針和引物F :5’ -TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3，，R 5' -GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3，，Taqman探針5，-(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)-3，，③利用BLAST在線軟件分析設(shè)計(jì)引物和探針序列的特異性；(2)血液基因組DNA的制備血樣采用EDTA抗凝，血液置于1. 5ml離心管中4°C保存?zhèn)溆?；利用QIAGEN離心柱血液基因組提取試劑盒提取血液基因組；(3)ATIII基因的擴(kuò)增①以編號A22的轉(zhuǎn)ATIII基因羊血液基因組為模板；②PCR擴(kuò)增體系如下DNA 模板 10ng，IOXEx Taq bufer 2. 5 μ 1, dNTP 2. 5mM 5 μ 1，引物 F ΙΟρΜ，引物 R ΙΟρΜ, Taq 酶 0· 2μ 1，ddH20 補(bǔ)到 25 μ 1。反應(yīng)條件為 94 °C 5min ； 95 °C 30S，55°C 30S, 72°C 1. 5min，25個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；擴(kuò)增片段大小為1263bp,以瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增效果并回收；G)ATIII基因的克隆利用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒將ATIII基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，膠回收產(chǎn)物連接到 PMD18T載體中，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，挑取單克隆，PCR鑒定，并測序鑒定；(5)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度的計(jì)算將上述質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測定260nm與^Onm波長下的OD值，判斷其純度，然后轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)；(6)熒光定量PCR檢測；(7)敏感性評價(jià)及定量分析；(8)特異性評價(jià)。
2.按照權(quán)利要求1所述的人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法， 其特征是所述的與標(biāo)準(zhǔn)品對照計(jì)算每微升質(zhì)粒拷貝數(shù)的方法是①制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；標(biāo)準(zhǔn)品作10倍梯度稀釋，_20°C保存?zhèn)溆茫虎跇悠焚|(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測定260nm與^Onm波長下的OD值，然后按照下面的公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)每微升質(zhì)?？截悢?shù)=(質(zhì)量 / 分子量)X (6. 02 X IO23)=[質(zhì)粒濃度(ng/Ι μ 1) X 1 μ ] X 10"9/2404697] X ( 6. 02 X IO23個(gè)/mol)，其中:6. 02 X IO23是阿佛加德羅常數(shù)；2404697是標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的分子量。
3.按照權(quán)利要求1所述的人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法， 其特征是所述的熒光定量PCR檢測的方法是25 μ 1 反應(yīng)體系包括 TaqMan Universal PCR Master Mix 緩沖液 12. 5 μ 1，血樣 DNA 模板10ng，引物為300nM、探針為250nM，體系用ddH20補(bǔ)齊；特異性反應(yīng)條件為二溫循環(huán)，即95°C IOmin ；95°C 15s,60°C lmin，40個(gè)循環(huán)；弓丨物和探針的用量為矩陣法優(yōu)化得到的結(jié)果。
4.按照權(quán)利要求1所述的人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法， 其特征是所述的敏感性評價(jià)及定量分析的方法是RNA標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)1/10系列稀釋，利用建立的檢測體系對不同濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以確定檢測靈敏度；同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)品檢測擴(kuò)增曲線獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，對檢測樣品進(jìn)行定量分析。
5.按照權(quán)利要求1所述的人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法， 其特征是所述的特異性評價(jià)的方法是利用建立的檢測體系對編號為A22的ATIII轉(zhuǎn)基因羊血液基因組，非轉(zhuǎn)基因羊血液基因組，和其它對照動物血液基因組，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以驗(yàn)證其特異性。
6.按照權(quán)利要求1所述的人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法， 其特征是所述的采取動物血液基因組樣品的方法是采用頸靜脈取血的方法分別采集轉(zhuǎn)ATIII基因羊血液基因組血液樣品，轉(zhuǎn)乙肝表面抗原基因羊血液樣品，轉(zhuǎn)干擾素轉(zhuǎn)基因羊血液樣品，野生型山羊血液樣品，家養(yǎng)犬靜脈血液樣品，試驗(yàn)用小鼠靜脈血液樣品；以及采用翅靜脈采血法采取家養(yǎng)雞血液樣品和家養(yǎng)鵝血液樣品；提取各種動物血液基因組，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以驗(yàn)證人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法的特異性。
全文摘要
人抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊的外源基因漂移風(fēng)險(xiǎn)的分析方法。包括如下步驟引物及Taqman探針設(shè)計(jì)，血液基因組DNA的制備，ATIII基因的擴(kuò)增，ATIII基因的克隆，熒光定量PCR檢測和敏感性評價(jià)及定量分析。為了能夠靈敏的檢測到微量的ATIII基因，本研究建立了靈敏、特異的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測人ATIIII基因的技術(shù)方法，最低能檢測到1copy的ATIII基因，并且檢測特異性高。在此基礎(chǔ)上，開展了抗凝血酶III轉(zhuǎn)基因羊環(huán)境安全性評估的初步研究。完成了與ATIII轉(zhuǎn)基因羊密切接觸的同種和異種動物血液基因組中ATIII基因的檢測工作(共57個(gè)樣本)，結(jié)果表明人ATIII基因沒有在轉(zhuǎn)基因羊和非轉(zhuǎn)基因羊及其它動物間發(fā)生漂移，提示轉(zhuǎn)基因羊?qū)τ诃h(huán)境是安全的。
文檔編號C12Q1/68GK102321761SQ20111025214
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者袁三平, 趙雅琳, 鄒賢剛, 顧玉超 申請人:青島森淼實(shí)業(yè)有限公司