專利名稱：一種循環(huán)血dna提取方法和相關(guān)的循環(huán)血dna提取試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA提取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及循環(huán)血DNA提取技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種循環(huán)血DNA提取方法和相關(guān)的循環(huán)血DNA提取試劑盒。
背景技術(shù)：
人血漿中存在游離基因組DNA，這些DNA分子是在細(xì)胞凋亡或死亡后釋放到外周血中的，檢測分析游離gDNA有很重要的臨床意義許多疾病狀態(tài)下，比如中風(fēng)、心肌梗塞、 糖尿病及許多惡性腫瘤患者血漿游離gDNA會顯著升高。因此血漿游離gDNA濃度可以作為疾病進(jìn)展的一個臨床指標(biāo)，對于惡性腫瘤患者血漿中游離gDNA的檢測分析更具有重要意義，因為這些gDNA分子直接來自腫瘤細(xì)胞，對其進(jìn)行基因分析可以獲得腫瘤惡性程度的全部信息，可以為腫瘤的診斷和治療提供重要的依據(jù)。由于在孕婦外周血中存在胎兒的游離 gDNA,因此，血漿游離gDNA分析還可以作為產(chǎn)前診斷的重要方法。由于血漿游離gDNA片段小，含量低，在提取過程中容易丟失，其濃度在ng/mL水平，無法用紫外分光光度法檢測。需要很高的提取效率和穩(wěn)定的得率才能應(yīng)用于定量和相關(guān)檢測。傳統(tǒng)的苯酚/氯仿抽提法操作者需要接觸苯酚、氯仿這些有害物質(zhì)，影響人體健康。也有專利采用硅柱吸附法，其原理是利用DNA分子一定鹽濃度下能與收集硅柱可逆吸附來提取純化DNA。但是該方法抽提效率較低，操作繁瑣，需要專用的DNA吸附柱，無法反復(fù)利用，成本高。因此，需要一種循環(huán)血DNA提取方法，其抽提效率高、操作簡便、成本低廉、安全環(huán)保。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供一種循環(huán)血DNA提取方法和相關(guān)的循環(huán)血DNA提取試劑盒，該循環(huán)血DNA提取方法設(shè)計巧妙，抽提效率高、操作簡便、 成本低廉、安全環(huán)保，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種循環(huán)血DNA提取方法，其特點是，采用酸化預(yù)處理的硅珠濁液提取循環(huán)血DNA，例如血漿中游離基因組DNA、病毒DNA等寸。所述硅珠濁液可以采用任何合適的方法制備，較佳地，所述硅珠濁液是將硅珠震蕩分散在液體中然后經(jīng)過所述酸化預(yù)處理形成。液體可以是任何合適的液體，比如水，或者常規(guī)的DNA提取緩沖液等等。所述酸化預(yù)處理可以采用任何合適的方式，較佳地，所述酸化預(yù)處理通過加入酸實現(xiàn)。酸通常是無機(jī)酸，例如鹽酸、硝酸等等，也可以是有機(jī)酸，例如醋酸、甲酸等等。更佳地，所述酸是鹽酸。所述硅珠濁液的PH值小于7即可，較佳地，所述硅珠濁液的pH值為2. 0。
3
為了避免蛋白污染，較佳地，在所述血漿中還加入蛋白酶K。為了將細(xì)胞中的DNA完全釋放出來，較佳地，在所述血漿中還加入裂解緩沖液。所述裂解緩沖液可以是DNA提取所用的常見的裂解緩沖液，更佳地，所述是 0. 2MTris-HCl,0. 5% SDS, pH 7. 0。采用酸化預(yù)處理的硅珠濁液提取循環(huán)血DNA之后，還可以進(jìn)行常規(guī)DNA提取后續(xù)步驟進(jìn)行純化，例如采用洗滌緩沖液洗滌，乙醇重新沉淀等等，這些均是現(xiàn)有技術(shù)，這里不再贅述。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種循環(huán)血DNA提取試劑盒，其特點是，包括用于配制上述的循環(huán)血DNA提取方法中使用的硅珠濁液的硅珠。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種循環(huán)血DNA提取試劑盒，其特點是，包括用于上述的循環(huán)血DNA提取方法的硅珠濁液。本發(fā)明的有益效果具體如下本發(fā)明的循環(huán)血DNA提取方法采用酸化預(yù)處理的硅珠濁液提取循環(huán)血DNA，安全無毒，操作者不需接觸苯酚，氯仿等有害物質(zhì)，操作簡便，主要儀器只需一架臺式離心機(jī)，抽提效率高，對循環(huán)血中的短DNA抽提效率顯著優(yōu)于過柱法，純化效率可達(dá)70 %以上，足以滿足常規(guī)分子生物學(xué)需求，成本低廉，不需要專用的DNA吸附柱，因此，設(shè)計巧妙，抽提效率高、操作簡便、成本低廉、安全環(huán)保，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
具體實施例方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實施例詳細(xì)說明。應(yīng)理解，實施例僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例11 試劑1. 1 二氧化硅粉末SiR室溫保存。1. 2 IN HCl室溫保存。用12N濃鹽酸配制。1. 3裂解緩沖液0. 2M Tris-HCl,0. 5% SDS, pH 7. 0。室溫保存。1.4 蛋白酶 K-20°C 凍存，30U/mg。1. 5洗滌緩沖液50% 乙醇，70mM NaCl，IOmM Tris，2. 5mM EDTA。室溫保存。1· 670% 乙醇室溫保存。1. 7TE 緩沖液.室溫保存。稱取1. 21g Tris堿，0. 37g EDTA 二鈉鹽，加純凈水400毫升，劇烈攪拌，用NaOH調(diào)pH至8. 0，定容至500毫升，高溫高壓滅菌。1. 8純凈水2儀器與耗材
2. 1移液管、槍頭1-200 μ L。2. 2 離心管1. 5_50mL。2. 3 計時器.2. 4磁力攪拌器2. 5渦旋振蕩器2. 6手持離心機(jī)2. 7臺式離心機(jī)2. 8 量筒50mL2. 9水浴鍋2. 10空氣培養(yǎng)箱2. 11 溫度計2. 12離心管加熱模塊2. 13真空采血管2. 14EDTA 抗凝管3實驗步驟3. 1硅珠濁液制備3. 11稱取0. 6克SiO2，在50毫升純水中震蕩分散后靜置M小時。3. 1. 2移去上清，補(bǔ)水到50毫升，震蕩分散后靜置M小時。3. 1. 3移去上清，向剩余濁液中加入IN鹽酸至pH達(dá)到2。121°C濕熱滅菌15分鐘， 室溫避光保存。3. 2血漿制備3. 2. 1用真空采血管采集10毫升靜脈血，可在EDTA抗凝管中保存4小時。3. 2. 2將血液轉(zhuǎn)移到50毫升離心管中，1，500g離心10分鐘。3. 2. 3將黃褐色的上清轉(zhuǎn)移到15毫升離心管中，再次1，500g離心lOmin。3. 2. 4將約2. 5毫升上清轉(zhuǎn)移到15毫升離心管中，_80°C凍存。3. 3抽提血漿循環(huán)DNA3. 3. 1向50毫升離心管中加入4毫升血漿，4毫升裂解緩沖液，100微升200微克 /微升蛋白酶K，10微升硅珠濁液。顛倒混勻5次，室溫IOOrpm搖床振蕩混合20分鐘。3. 3. 29，OOOg離心3分鐘，丟棄上清。3. 3. 3加入1毫升洗滌緩沖液重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到1. 5毫升離心管中，12，OOOg離心 1分鐘，丟棄上清。3. 3. 4加入lmL70%乙醇，充分重懸沉淀，12，OOOg離心lmin，丟棄上清，重復(fù)洗滌1次。3. 3. 5吸走全部上清，在56°C離心管加熱模塊上烘烤3分鐘。3. 3. 6加入50微升TE緩沖液，吹打重懸，震蕩20秒后65°C水浴15分鐘。3. 3. 714，OOOg離心3分鐘，轉(zhuǎn)移到新的1. 5mL離心管中，4°C保存。
4.熒光定量PCR檢測提取的DNA的質(zhì)量采用Bioline公司PCR試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行QPCR檢測抽提的Cir-DNA的品質(zhì)，用CFFl 引物擴(kuò)增一段長約150bp的gDNA片段。配制定量PCR體系2X SensiMix SYBR 10 μ L(Bioline 公司)5μΜ CFFl 弓丨物 5μ LCFFl-F 引物5’ -TAAGAGTAATAATGGATGGATGATG-3’ 酸序列)CFFl-R 引物5，-CCTCCCATCTCCCTTCC-3，(見 SEQddH20 4 μ Lcir-DNA 1 μ L共 20 μ L 體系·定量PCR循環(huán)條件95 "C IOmin.{95 "C 15sec58°C 60sec重復(fù)40個循環(huán)}{95 "C 15sec60 °C 15sec%°C I5Sec 2%升溫速度}實施例2在硅珠濁液預(yù)處理酸化時加入硝酸調(diào)節(jié)pH實施例3在硅珠濁液預(yù)處理酸化時加入醋酸調(diào)節(jié)pH對比例1過柱法提取與實施例1相同來源的血漿中的游離基因組DNA，具體采用Epigentek 公司的FitAmp Plasma Serum DNA Isolation Kit進(jìn)行。熒光定量PCR中模板采用過柱法提取的血漿中游離基因組DNA。初始血量10mL，從中提取到約5mL的血漿，從中取4mL血漿硅珠法，從中取0. 4mL 血漿過柱法，結(jié)果表明實施例1-3的硅珠法和對比例1的過柱法均提取到了 DNA。實施例1-3提取的Cir-DNA的Ct值在21. 7附近，Cir-DNA的融鏈曲線為雙峰，峰值Tm分別為73. 4°C、79. 0°C，三重復(fù)結(jié)果相似。對比例1提取的Cir-DNA的Ct值在29. 6附近，Cir-DNA的融鏈曲線為三峰，峰值 Tm 分別為 74. 0°C, 79. 4 °C, 83. 2 "C。因此，從Ct值看來，硅珠法獲得的Cir-DNA的擴(kuò)增結(jié)果約比過柱法低8個Ct值， 按1個Ct值為2倍計算，另外考慮到實施例的結(jié)果是從10倍的血漿量中(硅珠法初始血漿量4mLvs過柱法初始血漿量0. 4mL)獲得了約200倍(Δ Ct = 8，2"8 = 256)，所以推測同樣血漿量的話，硅珠法較過柱法能夠獲得高10倍、1個數(shù)量級的游離DNA產(chǎn)量。從融鏈曲線來看，過柱法比硅珠法多一個峰，因此，整體上過柱法提到的DNA片段
(見SEQ ID NO :1所示的核苷 ID NO 2所示的核苷酸序列)
至2.0，其余同實施例1。 至2.0，其余同實施例1。
6可能比硅珠法提到的要更長。綜上，本發(fā)明的循環(huán)血DNA提取方法設(shè)計巧妙，抽提效率高、操作簡便、成本低廉、 安全環(huán)保，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖
應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種循環(huán)血DNA提取方法，其特征在于，采用酸化預(yù)處理的硅珠濁液提取循環(huán)血DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)血DNA提取方法，其特征在于，所述硅珠濁液是將硅珠震蕩分散在液體中然后經(jīng)過所述酸化預(yù)處理形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)血DNA提取方法，其特征在于，所述酸化預(yù)處理通過加入酸實現(xiàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的循環(huán)血DNA提取方法，其特征在于，所述酸是鹽酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)血DNA提取方法，其特征在于，所述硅珠濁液的pH值為2. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)血DNA提取方法，其特征在于，在所述血漿中還加入蛋白酶K。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)血DNA提取方法，其特征在于，在所述血漿中還加入裂解緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的循環(huán)血DNA提取方法，其特征在于，所述裂解緩沖液是 0. 2MTris-HCl,0. 5% SDS, pH 7. 0。
9.一種循環(huán)血DNA提取試劑盒，其特征在于，包括用于配制根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)血DNA提取方法中使用的硅珠濁液的硅珠。
10.一種循環(huán)血DNA提取試劑盒，其特征在于，包括用于根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)血 DNA提取方法的硅珠濁液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種循環(huán)血DNA提取方法，其采用酸化預(yù)處理的硅珠濁液提取循環(huán)血DNA。較佳地，硅珠濁液是將硅珠震蕩分散在液體中然后經(jīng)過酸化預(yù)處理形成，酸化預(yù)處理通過加入酸實現(xiàn)，硅珠濁液的pH值為2.0，在血漿中還加入蛋白酶K，在血漿中還加入裂解緩沖液。還提供了相關(guān)的循環(huán)血DNA提取試劑盒。本發(fā)明的循環(huán)血DNA提取方法設(shè)計巧妙，抽提效率高、操作簡便、成本低廉、安全環(huán)保，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N15/10GK102286468SQ20111025204
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者趙翊均 申請人:江蘇百帝生物科技有限公司