專利名稱：MaAQP1蛋白在植物耐逆性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種MaAQPl蛋白在植物耐逆性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香蕉前期植株較小，根系淺生，易受旱，其葉面積大，蒸騰量大，早在其發(fā)生萎蔫之前，就已表現(xiàn)出缺水現(xiàn)狀。尤其是在高溫季節(jié)，香蕉受到干旱后，葉片失水，相對(duì)含水量下降，水分脅迫導(dǎo)致香蕉葉片的細(xì)胞質(zhì)膜透性增大，極大地傷害香蕉正常的生理代謝活動(dòng)，造成香蕉減產(chǎn)，品質(zhì)下降等。香蕉栽培生產(chǎn)中，耗水量大，缺水會(huì)減少香蕉果實(shí)數(shù)量且使香蕉變小，掛果期受旱，會(huì)影響果實(shí)膨大。因此，對(duì)香蕉抗逆品種的改良是十分重要而且緊迫的。水是細(xì)胞中最基本和重要的成分，細(xì)胞通過細(xì)胞膜進(jìn)出水分，專門的膜通道促進(jìn)了水分進(jìn)出分子膜的效率。1988年，Peter Agre等在分離人紅細(xì)胞中1 蛋白時(shí)，在紅細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)^kD的跨膜多肽，這種多肽非常豐富，分布廣泛，也見于人類腎臟、大腦和植物體中。Peter Agre等證明該蛋白只能讓水通過，稱為CHIP^ (通道形成完整膜蛋白， Channel-forming intagral membrane protein) M 而 it.flfM^J 并 7^ + !,^;, 其原因在于大多數(shù)高等植物體內(nèi)并不存在像腎臟一樣的器官或位點(diǎn)來轉(zhuǎn)運(yùn)水分，且生物膜本身的透性也足以滿足植物細(xì)胞內(nèi)的水分運(yùn)動(dòng)。但隨著一些技術(shù)的進(jìn)步，1993年，Maurel 等經(jīng)爪蟾卵母細(xì)胞異源表達(dá)系統(tǒng)第一次分離出擬南芥液泡膜上的水通道蛋白TIP，基于其專一的水轉(zhuǎn)運(yùn)功能，采用了 aquaporin (水通道蛋白或水孔蛋白)一詞。CHIP^也于1997 年被基因組命名委員會(huì)命名為AQP1。隨后，在許多動(dòng)植物及微生物中相繼發(fā)現(xiàn)的類似的專一性運(yùn)輸水的通道蛋白被統(tǒng)稱為水通道蛋白(aquaporins，AQPs)。除了水，水通道蛋白還能使小分子如甘油，尿素以及一些離子在膜上進(jìn)行滲透。在植物中，許多水通道蛋白已經(jīng)被識(shí)別和研究。大多數(shù)水通道蛋白在受到環(huán)境脅迫如干旱等時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)，并且分布在各種組織和器官中，存在于生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，揭示了它們?cè)谡麄€(gè)生命活動(dòng)中具有重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物方法。本發(fā)明提供的方法，為將MaAQPl蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，獲得具有如下 1)-3)中至少一種特征的轉(zhuǎn)基因植物1)所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的根長(zhǎng)大于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植物的根的根毛數(shù)目大于所述目的植物；所述MaAQPl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。所述MaAQPl蛋白的編碼基因的核苷酸序列為如下1)或2):1)序列表中的序列1;2)序列表中序列1自5’末端第1-855位核苷酸。
所述耐逆性為耐鹽性和/或耐旱性。所述耐鹽性通過增加根長(zhǎng)和/或提高存活率體現(xiàn)；所述耐旱性通過增加根長(zhǎng)、降低失水率和/或提高存活率體現(xiàn)。所述根為主根；所述MaAQPl蛋白的編碼基因通過表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。所述表達(dá)載體為將所述MaAQPl蛋白的編碼基因插入pCAMBIA1304的NcoI和SpeI 酶切位點(diǎn)間，得到的表達(dá)MaAQPl蛋白的載體。所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物。所述雙子葉植物為擬南芥。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)載體。本發(fā)明提供的表達(dá)載體，具體為將所述MaAQPl蛋白的編碼基因插入pCAMBIA1304 的NcoI和SpeI酶切位點(diǎn)間中，得到的表達(dá)MaAQPl蛋白的載體；所述MaAQPl蛋白的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇械男蛄?。所述MaAQPl蛋白、所述MaAQPl蛋白的編碼基因和/或所述的表達(dá)載體在植物育種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或所述MaAQPl蛋白或所述MaAQPl蛋白的編碼基因在培育耐逆性植物中的應(yīng)用； 所述植物為擬南芥；所述耐逆性為為耐鹽性和/或耐旱性也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將香蕉果實(shí)(Musa acuminate L. AAA group cv. Brazilian)的MaAQPl基因，導(dǎo)入野生型擬南芥中，得到轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因植物在高鹽和/或干旱脅迫條件下根長(zhǎng)、存活率均高于野生型擬南芥，為植物育種奠定了基礎(chǔ)，從而解決香蕉抗逆方面所面臨的問題。


圖1為MaAQPl轉(zhuǎn)基因株系的PCR檢測(cè)圖2為各株系的Southern blot檢測(cè)圖3為生長(zhǎng)15天的野生型和轉(zhuǎn)基因型圖4為生長(zhǎng)15天的野生型和轉(zhuǎn)基因型的根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)圖5為野生型和轉(zhuǎn)基因植株4-7天主根生長(zhǎng)速率圖6為顯微鏡下生長(zhǎng)4天野生型和轉(zhuǎn)基因株系的根毛形態(tài)圖7為生長(zhǎng)4天的野生型和轉(zhuǎn)基因型的根毛統(tǒng)計(jì)圖8為不同濃度NaCl對(duì)野生型、L16和L13根系生長(zhǎng)的影響
圖9為MaAQPl轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性圖10為野生型和MaAQPl轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的存活率圖11為野生型、L16和L13對(duì)不同濃度甘露醇的耐受性圖12為不同濃度甘露醇對(duì)野生型、L16和L13根長(zhǎng)的影響圖13為MaAQPl過表達(dá)植株的抗旱性圖14為野生型和MaAQPl轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下的存活率圖15為野生型和MaAQPl轉(zhuǎn)基因植株的葉片失水率測(cè)定圖16為轉(zhuǎn)基因擬南芥MaAQPl在干旱脅迫下的表達(dá)
圖17為轉(zhuǎn)基因擬南芥MaAQPl在Nacl脅迫下的表達(dá)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)MaAQPl基因擬南芥的獲得一、MaAQPl基因的發(fā)現(xiàn)從香蕉果實(shí)成熟早期階段的抑制差減雜交文庫(kù)(SSH)中獲得一個(gè)屬于水通道蛋白家族基因的cDNA片段，并用RACE技術(shù)在香蕉果實(shí)中克隆到了該水通道蛋白基因的全長(zhǎng)， 命名為MaAQPl，其核苷酸序列為序列表中的序列1。二、MaAQPl植物表達(dá)載體的構(gòu)建以植物表達(dá)載體pCAMBIA1304為基礎(chǔ)構(gòu)建MaAQPl基因的表達(dá)載體，具體如下提取香舊果實(shí)(Musa acuminate L. AAA group cv. Brazilian)(巴西舊)的 RNA， 反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，以 ATGGAAGGGA AAGAGGAAG 和TCTCTCAGGGCCTGCTCTTG 為引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。將得到的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，結(jié)果為該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列1 自5’末端第1-855位核苷酸，其基因即為MaAQPl，其編碼的蛋白的氨基酸的序列為序列表中的序列2，該蛋白命名為MaAQPl。序列表中的序列1由865個(gè)核苷酸組成，序列表中的序列2由286個(gè)氨基酸組成。將上述PCR產(chǎn)物用NcoI和SpeI酶切，得到酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304(周雪莉，王園，劉菊華，金志強(qiáng)，遲光紅，徐碧玉。香蕉 MuMADSI基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位，生命科學(xué)研究，2009，13 (5) :418-421。公眾可從中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所獲得。)進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果為，該質(zhì)粒為將序列表中的序列1自5’末端第 1-855位核苷酸插入pCAMBIA1304的NcoI和SpeI酶切位點(diǎn)之間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為pCAMBIA1304-MaAQPl，序列1自5’末端第1-855位核苷酸插入的是35S啟動(dòng)子后nos 終止子前的多克隆位點(diǎn)間。三、重組農(nóng)桿菌的獲得將上述獲得的pCAMBIA1304-MaAQPl導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌C58 (盛長(zhǎng)忠、王淑芳、張心平、王勇、田俊英，土壤農(nóng)桿菌C58遺傳轉(zhuǎn)化東北紅豆杉的初步研究，南開大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，1999，32(4) :27-32。公眾可從中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所獲得。)中， 得到重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為pCAMBIA1304-MaAQPl，將含有該質(zhì)粒的農(nóng)桿菌命名為C58/pCAMBIA1304-MaAQPl。四、轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥的獲得1、擬南芥的培養(yǎng)Sf^MMlt^f (Arabidopsis thaiiana, Columbia ecotype) 1 g Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio university, Ohio state, USA))禾中子撒播在花缽中， 并在表面鋪一層細(xì)砂，將其放置在4°C，濕潤(rùn)、黑暗條件下春化處理3天，保濕待種子萌發(fā)。 擬南芥在本實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱中的培養(yǎng)房中培養(yǎng)。以蛭石為基質(zhì)，溫度控制在23°C，營(yíng)養(yǎng)生
5長(zhǎng)期每日光照時(shí)間為8h，生殖生長(zhǎng)期每日為光照為16h，光照強(qiáng)度為20001χ，培養(yǎng)室相對(duì)濕度為80%。當(dāng)幼苗長(zhǎng)出真葉后，可進(jìn)行移植。移栽后保濕一星期左右，直至幼苗長(zhǎng)出新葉。每隔4d澆適量的擬南芥營(yíng)養(yǎng)液，待花苔長(zhǎng)至5cm及側(cè)苔抽出時(shí)，可用于轉(zhuǎn)化，即為受體擬南芥。2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥將上述獲得的C58/pCAMBIA1304-MaAQPl，加到含有Kan和Rif抗生素的LB培養(yǎng)基中，28°C振蕩10h，加入擬南芥轉(zhuǎn)基因浸潤(rùn)液(l/2MS，50g/L Sucrose)中，將受體擬南芥倒置浸染到菌液中，采用花序浸染法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到3420個(gè)TO代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥種子。3、擬南芥的抗性篩選將TO代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥的種子以75%乙醇+0.02% Triton XlOO溶液浸泡 IOmin,移除乙醇溶液，重復(fù)3次，將種子吹打到無菌濾紙上，風(fēng)干；將晾干的種子撒播在選擇培養(yǎng)基(1/2MS, 1. 5% Sucrose, 0. 7% Agra, 25 μ g/mL hygromycin B)上；4°C黑暗處理3d 后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)房中，在23°C條件下生長(zhǎng)，IOd后選擇能正常生長(zhǎng)的幼苗移栽到花缽中，得到 35株Tl代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥，計(jì)算Tl代種子中能正常生長(zhǎng)的幼苗和致死幼苗的比例，即為 1 80。從收獲Tl代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥收獲種子，播種，得到T2代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥。4.轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代純合系培養(yǎng)選擇T2代分離比符合3 1的幼苗移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中，保濕一星期后每隔5天以適量的 1/2 的擬南芥營(yíng)養(yǎng)液 OM KNO3, 2M Ca (NO3)2，2M MaSO4. 7H20, IM NH4NO3, IM KH2PO4, 0. 02M FeSO4. 7Η20，0· 02Μ Na2EDTA,0. 05Μ H3BO3,0. OlM MnCl2. 4Η20，0· OlM Na2MOO4)澆灌，待其長(zhǎng)大，收獲種子進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析，得到四株Τ3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥。5、Τ3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥的分子檢測(cè)設(shè)計(jì)3對(duì)引物分別驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因株系(1)能夠擴(kuò)增MaAQPl開放閱讀框內(nèi)cDNA序列與pCAMBIA1304中一段序列的引物 (AtAQP 1) (PI :CCTTGTCCACCTGGCTAC ；P2 TCTCTCAGGGCCTGCTCTTG ；)(2)能夠擴(kuò)增表達(dá)載體上GFP部分序列的引物(AtGFP) (PI :ATGTGTAATCCCAGCAGC ； P2 CAAGGAGGACGGAAACAT)；(3)能夠擴(kuò)增GFP及插入MaAQPl開放閱讀框序列的引物(GFP) (Pl CAGTTGCGCAGCCTGAATG P2 TTGGCCACGGAACAGGTAGT)。DMaAQPl轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測(cè)提取各株系T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥葉片基因組DNA，以AtAQPl為引物對(duì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以野生型擬南芥為陰性對(duì)照，以pCAMBIA1304-MaAQPl為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果如圖1所示， 其中，L1-L12均為T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥，WT為野生型擬南芥，得到3(^bp的為陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥，得到四株陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥。2)MMaAQPl轉(zhuǎn)基因擬南芥的Southern blot檢測(cè)分別提取編號(hào)為L(zhǎng)13，L16，L6，L8，L1-5的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥的葉片的全基因組DNA進(jìn)行Southern印跡檢測(cè)，經(jīng)MaAQPl基因特異探針(以pCAMBIA1304_MaAQPl 質(zhì)粒為模板，以AtGFP為引物進(jìn)行擴(kuò)增得到的產(chǎn)物)雜交、顯色，以野生型擬南芥為對(duì)照，結(jié)果如圖2所示，CK為陽(yáng)性對(duì)照pCAMBIA1304-MaAQPl，WT為野生型擬南芥，可以看出，編號(hào)為 L13，L16，L6，L8，L1-5的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥均有目的片段，但是大小不一，可能是在轉(zhuǎn)基因植株中既包括多拷貝插入的，也包括單拷貝插入的。采用相同的方法，將空載體PCAMBIA1304導(dǎo)入野生型擬南芥中，得到TO代轉(zhuǎn)空載體擬南芥，傳代，直到得到T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥。提取T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥的DNA，用 AtAQPl作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未得到目的片段，說明其為T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)MaAQPl基因擬南芥的功能研究一、根的生長(zhǎng)特性將野生型擬南芥(WT)、編號(hào)為L(zhǎng)13，L16，L6，L8，L1-5的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥種子播撒在MS培養(yǎng)基中并垂直培養(yǎng)，在23°C，》i光照、1 黑暗的條件下生長(zhǎng)。以T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥為對(duì)照。每個(gè)株系50株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。15d后觀察各株系和野生型的外部性狀如圖3所示，其中，A為野生型擬南芥和編號(hào)為L(zhǎng)13，L16，L6，L8，L1-5的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥主根差異，B為野生型擬南芥和陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥(轉(zhuǎn)基因型)側(cè)根差異；各轉(zhuǎn)基因株系的主根均要比野生型的長(zhǎng)，且轉(zhuǎn)基因株系除了主根外，基本上不長(zhǎng)其他的側(cè)根，而野生型則均長(zhǎng)有主根以及側(cè)根。同時(shí)在15d后統(tǒng)計(jì)具體的根長(zhǎng)(以主根記)，如圖4所示，從圖中看出，WT 的根長(zhǎng)為 3. 2cm, L13, L16, L6，L8，L1-5 的根長(zhǎng)分別為 4. 48cm, 5. 28cm, 6. 10cm, 5. 55cm, 5. 40cm,可以看出，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)比野生型的長(zhǎng)2-3cm左右。在生長(zhǎng)的15天內(nèi)，觀察主根長(zhǎng)度及其生長(zhǎng)速度(生長(zhǎng)速度=Ln-Ln-l/t η為天數(shù)， t = 24h)的變化，結(jié)果如圖5所示，WT 在生長(zhǎng) 4、5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)為 5. 09mm、7mm、10· 5mm、14. 5mm、18. 9mm、 23. 6mm>28. Imm ；L13 在生長(zhǎng) 4、5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)為 5. 29mm、7. 5mm、11. 3mm、15. 6mm、20. 4mm、
25.4mm、30. 6mm ；L16 在生長(zhǎng) 4、5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)為 5. 16mm、7. 9mm、12. 3mm、16. 6mm、21. 6mm、 27. lmm>32. 5mm ；L6 在生長(zhǎng) 4、5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)為 5. 16mm、8. lmm、12. 2mm、16. 8mm、21. 7mm、
26.9mm、32. 3mm ；L8 在生長(zhǎng) 4、5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)為 5. 13mm、8mm、12· 1mm、16. 4mm、21. 4mm、 26. 6mm、32. 4mm ；Ll-5 在生長(zhǎng) 4、5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)為 4. 88mm、8mm、12mm、16. 5mm、21. 6mm、 26. 9mm、32. 2mm ；WT 在生長(zhǎng) 5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)增長(zhǎng)速率為 0. 07mm/h、0. 15mm/h、0. 165mm/h、 0. 18mm/h、0. 2mm/h、0. 19mm/h ；L13 在生長(zhǎng) 5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)增長(zhǎng)速率為 0. 09mm/h、0. 16mm/h、0. 18mm/h、 0. 19mm/h、0. 21mm/h、0. 22mm/h ；L16 在生長(zhǎng) 5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)增長(zhǎng)速率為 0. llmm/h、0. 18mm/h、0. 18mm/h、 0. 21mm/h、0. 23mm/h、0. 22mm/h ；
L6 在生長(zhǎng) 5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)增長(zhǎng)速率為 0. 13mm/h、0. 17mm/h、0. 19mm/h、 0. 2mm/h、0. 22mm/h、0. 22mm/h ；L8 在生長(zhǎng) 5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)增長(zhǎng)速率為 0. 12mm/h、0. 17mm/h、0. 18mm/h、 0. 21mm/h、0. 22mm/h、0. 24mm/h ；Ll-5 在生長(zhǎng) 5、6、7、8、9、10 天的根長(zhǎng)增長(zhǎng)速率為 0. 13mm/h、0. 17mm/h、0. 19mm/h、 0. 21mm/h、0. 22mm/h、0. 22mm/h ；可以看出，從培養(yǎng)第5d開始，轉(zhuǎn)基因株系和野生型的根長(zhǎng)開始出現(xiàn)差距，直到第 10d，野生型的根長(zhǎng)約為2. 7cm，而轉(zhuǎn)基因株系根長(zhǎng)則達(dá)到3-3. 3cm左右。為進(jìn)一步觀察轉(zhuǎn)基因株系和野生型之間根部的差異，在生長(zhǎng)第4d后于顯微鏡下觀察根毛的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果如圖6所示，解剖鏡下40X物鏡觀察，轉(zhuǎn)基因株系(編號(hào)為L(zhǎng)13 陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥)的根毛與野生型(WT)的相比，在根的伸長(zhǎng)區(qū)部位，根毛較多而且密集。并統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)4天的野生型和轉(zhuǎn)基因型的主根根毛數(shù)目統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖7所示，WT、 編號(hào)為L(zhǎng)13，L16，L6，L8，L1-5的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥在生長(zhǎng)4天的根毛數(shù)目為31、 41、51、52、50、45 ；可以看出，各轉(zhuǎn)基因株系的根毛是野生型的1.5倍左右。T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥結(jié)果無顯著差異。二、轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥耐逆性鑒定1)L16、L13 對(duì) NaCl 的抗性測(cè)試野生型擬南芥(WT)、編號(hào)為L(zhǎng)16和L13的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥的種子分別播撒在含0、50、100、150、200mM NaCl 的培養(yǎng)基(1/2MS, 1. 5% Sucrose, 0. 7% Agra,PH 5. 7) 上培養(yǎng)(23°C，8小時(shí)光照)15天，每個(gè)株系的種子為50粒，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。 以T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥為對(duì)照。統(tǒng)計(jì)各株系根長(zhǎng)(主根)狀況如圖8所示，訂在含0、50、100、150、2001111 NaCl的培養(yǎng)基的根長(zhǎng)(主根)分別為3、2· 5、2· 3、 0. 8、0cm ；L16在含0、50、100、150、200mM NaCl的培養(yǎng)基的根長(zhǎng)(主根)分別為4. 1、3. 8、 3. 5、2· 5、0. 8cm ；1^13在含0、50、100、150、2001111 NaCl 的培養(yǎng)基的根長(zhǎng)(主根)分別為 3· 9、3· 5、3、 2. 1、0. 7cm ；可以看出，在培養(yǎng)基中NaCl的濃度為50mM和IOOmM時(shí)，各株系的生長(zhǎng)均未受到顯著影響。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到150mM時(shí)，野生型和MaAQPl轉(zhuǎn)基因植株開始表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)狀況，野生型和L16和L13的根部均變短，但是野生型的根部變化幅度要比L16和L13的變化幅度大，且子葉變小，L16和L13均有4片子葉，而野生型的僅有兩片子葉。而在200mM NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)15d時(shí)，野生型種子只伸出很短的胚根，而MaAQPl轉(zhuǎn)基因籽苗根長(zhǎng)達(dá)至Ij 0. 5cm。將生長(zhǎng)4周的野生型擬南芥(WT)、編號(hào)為L(zhǎng)16和L13的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥用含 350mM NaCl 的營(yíng)養(yǎng)液(2M KNO3, 2M Ca (NO3) 2，2M MaSO4. 7H20, IM NH4NO3, IM KH2PO4, 0. 02M FeSO4. 7Η20，0· 02Μ Na2EDTA, 0. 05Μ H3BO3,0. OlM MnCl2. 4Η20，0· OlM Na2MOO4)澆灌 15d 后，野生型擬南芥(WT)、編號(hào)為L(zhǎng)16和L13的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥，以正常處理(用不含350mM NaCl的營(yíng)養(yǎng)液澆灌)的植株作為對(duì)照。觀察各株系生長(zhǎng)狀況如圖9所示，正常處理(用不含350mM NaCl的營(yíng)養(yǎng)液澆灌) 的各植株生長(zhǎng)無顯著差異。含350mM NaCl處理后，野生型擬南芥(WT)的葉片幾乎全部由黃轉(zhuǎn)綠，而L16和L13則仍保持較強(qiáng)生命力。其中L16部分植株的葉片邊緣變黃，部分葉片開始出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，L13的生長(zhǎng)則沒有受到明顯的影響。統(tǒng)計(jì)存活率，結(jié)果如圖10所示，正常處理(對(duì)照)下，野生型擬南芥(WT)、編號(hào)為L(zhǎng)16和L13的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl 擬南芥的存活率分別為100%、100%、100% ；350mM NaCl處理15d后，野生型擬南芥(WT)、編號(hào)為L(zhǎng)16和L13的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn) MaAQPl擬南芥的存活率分別為58%、81%、92% ；可以看出，用NaCl處理15d后，野生型的存活率已降至58%，而L16和L13的存活率則分別保持在83%和91%，證明MaAQPl轉(zhuǎn)基因植株比野生型具有更強(qiáng)的耐鹽能力。T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥結(jié)果無顯著差異。2)L16、L13對(duì)對(duì)干旱的耐受性野生型擬南芥(WT)、編號(hào)為L(zhǎng)16和L13的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥的種子分別播撒在含0、100、200、300mM甘露醇(模擬干旱)的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)(23°C，8小時(shí)光照)15d， 觀察表型如圖11所示，可以看出，在含各種濃度的甘露醇中，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的子葉變小，且基本上只有兩片子葉，而對(duì)照組均有四片子葉。每個(gè)株系的種子為50粒，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。以T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥為對(duì)照。統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)(主根長(zhǎng)度)，結(jié)果如圖12所示，WT 在含 0、100、200、300mM 甘露醇中根長(zhǎng)為 3. 2,2. 3,1. 6,1. Icm ；L16 在含 0、100、200、300mM 甘露醇中根長(zhǎng)為 5. 2,4. 1,3. 6,3. Ocm ；L13 在含 0、100、200、300mM 甘露醇中根長(zhǎng)為 4. 4,3. 6,3. 0,2. 5cm ；可以看出，在含IOOmM甘露醇的培養(yǎng)基中，野生型和L16、L13的轉(zhuǎn)基因株系的根部并無太大變化，隨著甘露醇濃度的增加，各株系的根部均有所變短，且野生型和轉(zhuǎn)基因株系根部的長(zhǎng)度差異越來越大。當(dāng)甘露醇的濃度增加到200mM時(shí)，野生型的根部只有1. 6cm左右長(zhǎng)度，而轉(zhuǎn)基因株系根部仍有2. 9cm左右的長(zhǎng)度。隨著甘露醇濃度的升高，野生型和各轉(zhuǎn)基因株系根長(zhǎng)均有所減少，但是野生型的根長(zhǎng)減少幅度要比轉(zhuǎn)基因的大，表明了在甘露醇的脅迫下，MaAQPl轉(zhuǎn)基因株系比野生型具有更強(qiáng)的耐旱性。將在蛭石中生長(zhǎng)4周的野生型擬南芥(WT)、編號(hào)為L(zhǎng)16和L13的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn) MaAQPl擬南芥進(jìn)行控水處理(處理方法是停止?jié)菜?20天后，以正常澆水為對(duì)照，每個(gè)株系的種子為50粒，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。以T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥為對(duì)照。觀察表型，結(jié)果如圖13所示，可以看出，正常澆水各株系植物生長(zhǎng)無顯著差異。而控水處理后，野生型葉片已經(jīng)全部失綠，干枯死亡；而L16和L13的部分葉片邊緣雖然開始變黃，但還保持較強(qiáng)生命力。在控水處理20天后統(tǒng)計(jì)存活率，如圖14所示，WT、L16和L13在控水處理20天后的存活率分別為16%、88%和87%，證明MaAQPl轉(zhuǎn)基因植株比野生型具有更強(qiáng)的抗旱能力。在控水處理20天后檢測(cè)葉片的失水率(方法選取23°C，8h光照，16h黑暗條件下生長(zhǎng)4周的各株系健康植株，摘取相同部位的葉片各30片，每隔30min測(cè)定其鮮重；失水率=(Mn-Mn-30)/MnM為葉片重量，η為稱樣時(shí)間(min))，結(jié)果如圖15所示，WT 在葉片摘離植株 30、60、90、120、150、180、210、240、270、300min 的失水率分別為 5%、12%、17%、21%、25%、30%、33%、35%、38%、41% ；L16 在葉片摘離植株 30、60、90、120、150、180、210、240、270、300min 的失水率分別為 6%、10%、15%、17%、21%、25%、27%、30%、32%、34% ；L13 在葉片摘離植株 30、60、90、120、150、180、210、240、270、300min 的失水率分別為 4%,8%,12%,15%,17%,21%,22%,25%,27%,33% ；可以看出，在葉片摘離植株30min之內(nèi)，野生型和轉(zhuǎn)基因植株的失水率幾乎一致。 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型和L16，L13植株的失水速率逐漸增大，但野生型的失水幅度要較轉(zhuǎn)基因型大，而L13較L16緩慢。直至第270min，野生型葉片的失水率達(dá)到38. 2%，而1^13 的失水率為27. 2%, L16的葉片失水率為32. 5%，直至第300min達(dá)到34. 3%，此時(shí)L13與 L16的葉片失水率基本達(dá)到一致。說明MaAQPl轉(zhuǎn)基因植株葉片的保水能力較野生型強(qiáng)。T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥結(jié)果無顯著差異。三、MaAQPl在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)(各種處理?xiàng)l件下的表達(dá))1、轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫下MaAQPl的表達(dá)將生長(zhǎng)15天的野生型擬南芥(WT)、編號(hào)為L(zhǎng)16和L13的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥干旱脅迫(將生長(zhǎng)15天的擬南芥放置于干燥的濾紙上)，分別在脅迫0、2、4、他提取各株系RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA做為模板，以AtAQPl為引物(PI :CCTTGTCCACCTGGCTAC ； P2 :GCATCACCTTCACCCTCT)，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，以act in為內(nèi)參，內(nèi)參的引物為Pl CGGTGCCTTTGCTCTGT ；P2 :CTTCTTTCCGCTCGCTT ；每個(gè)株系的種子為50粒，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖16所示，可以看出，干旱脅迫濁時(shí)，在L16和L13中，MaAQPl的表達(dá)受到高度誘導(dǎo)，其表達(dá)量分別為59. 2和65，而隨著干旱脅迫時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)基因植株中基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。野生型擬南芥MaAQPl的表達(dá)量為0。2、轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫下MaAAPl的表達(dá)用Nacl脅迫(將生長(zhǎng)15天的擬南芥放置于泡于IOml各濃度Nacl溶液的濾紙上)野生型擬南芥(WT)、編號(hào)為L(zhǎng)16和L13的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)MaAQPl擬南芥0h、2h、6h、IOh; 每個(gè)株系的種子為50粒，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖17所示，L16和L13兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在 Nacl脅迫Mi時(shí)，L16和L13中MaAQPl的表達(dá)被高度誘導(dǎo)，表達(dá)量分別為25. 1和33. 3。在 Nacl脅迫池和IOh時(shí)，L13中MaAQPl的表達(dá)量基本一致。野生型擬南芥MaAQPl的表達(dá)量為0。
10
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物方法，為將MaAQPl蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮@得具有如下1)-3)中至少一種特征的轉(zhuǎn)基因植物1)所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的根長(zhǎng)大于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植物的根的根毛數(shù)目大于所述目的植物；所述MaAQPl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述MaAQPl蛋白的編碼基因的核苷酸序列為如下1)或2):1)序列表中的序列1；2)序列表中序列1自5’末端第1-855位核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐鹽性和/或耐旱性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述耐鹽性通過增加根長(zhǎng)和/或提高存活率體現(xiàn)；所述耐旱性通過增加根長(zhǎng)、降低失水率和/或提高存活率體現(xiàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述根為主根；所述MaAQPl蛋白的編碼基因通過表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述表達(dá)載體為將所述MaAQPl蛋白的編碼基因插入PCAMBIA1304中，得到的表達(dá)MaAQPl蛋白的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥。
9.一種表達(dá)載體，為將所述MaAQPl蛋白的編碼基因插入pCAMBIA1304中，得到的表達(dá) MaAQPl蛋白的載體；所述MaAQPl蛋白的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇械男蛄?。
10.所述MaAQPl蛋白、所述MaAQPl蛋白的編碼基因和/或權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體在植物育種中的應(yīng)用；或所述MaAQPl蛋白或所述MaAQPl蛋白的編碼基因在培育耐逆性植物中的應(yīng)用；所述植物為擬南芥；所述耐逆性為為耐鹽性和/或耐旱性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種MaAQP1蛋白在植物抗逆中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物方法，為將MaAQP1蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，獲得具有如下1)-3)中至少一種特征的轉(zhuǎn)基因植物1)所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的根長(zhǎng)大于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植物的主根根毛數(shù)目大于所述目的植物；所述MaAQP1蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將香蕉果實(shí)的MaAQP1基因，導(dǎo)入野生型擬南芥中，得到耐逆性高的轉(zhuǎn)基因植物，為植物育種奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102304521SQ20111025195
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者劉菊華, 張建斌, 徐碧玉, 許奕, 賈彩紅, 金志強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所