本發(fā)明涉及shRNA，尤其涉及能夠有效抑制牦牛CAPN1基因表達(dá)的shRNA。

背景技術(shù)：

牦牛是分布在以青藏高原為中心及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的牛種，為牧民提供奶、肉、毛、役、燃料等生產(chǎn)和生活資料，具有“高原之舟”的美稱。牦牛常年采食天然牧草，其肉的蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低，且富含不飽和脂肪酸及特殊的風(fēng)味物質(zhì)，是符合現(xiàn)代生活要求的綠色食品(閻萍，2012)，但是牦牛肉的嫩度等品質(zhì)也制約了其市場(chǎng)接受度。因此，牦牛肉嫩度改良研究成為牦牛遺傳育種領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。

鈣蛋白酶（calpain）是存在于脊椎動(dòng)物細(xì)胞中的一種蛋白水解酶，其在各組織中廣泛表達(dá)，主要參與神經(jīng)發(fā)育、肌肉生長(zhǎng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及膜蛋白裂解等生物學(xué)通路。Calpain1和Calpain2是最早發(fā)現(xiàn)的兩種鈣蛋白酶的同型異構(gòu)體，其中Calpain1是不均一的蛋白二聚體，大亞基由CAPN1基因編碼。當(dāng)大小亞基相結(jié)合時(shí)，鈣蛋白酶不具有活性。Ca²⁺ 激活 CAPN1后，其大小亞基分離，因此認(rèn)為小亞基有可能主要起調(diào)節(jié)的作用，大亞基起催化的作用。CAPN1的活性依賴于肌漿中的鈣離子濃度，正常細(xì)胞中，游離的鈣離子濃度很低，不能激活 CAPN1。當(dāng)畜禽屠宰后，肌漿網(wǎng)和線粒體開(kāi)始釋放鈣離子，從而促進(jìn)肌動(dòng)球蛋白的生成，使肌肉發(fā)生僵直。隨著細(xì)胞內(nèi)ATP耗盡和乳酸的累積，肌漿網(wǎng)被破壞，使大量的鈣離子游離到肌漿中，從而激活CAPN1的活性，開(kāi)始降解肌原纖維蛋白(Melody et al., 2004)。肌肉中CAPN1蛋白的上調(diào)可以促進(jìn)肌聯(lián)蛋白、肌腱線蛋白和粘著斑蛋白等肌原纖維蛋白的降解，從而提高肉的嫩度(Kemp et al., 2010)。CAST作為CAPN1抑制蛋白，與肉的嫩度負(fù)相關(guān)。

小發(fā)夾RNA（shRNA）是一種具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的小分子RNA，它通過(guò)RNAi途徑使特定基因的表達(dá)沉默。與 siRNA 干擾作用的短暫性不同，shRNA 可構(gòu)建成相應(yīng)的載體，將載體導(dǎo)入細(xì)胞之后，就可以在其U6或H1啟動(dòng)子的作用下持續(xù)表達(dá)shRNA。目前shRNA已成為研究基因功能的最有效的工具之一。針對(duì)牦牛CAPN1基因設(shè)計(jì)特異性的shRNA序列，構(gòu)建相應(yīng)的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，為今后深入研究牦牛CAPN1基因的功能奠定了基礎(chǔ)，可廣泛應(yīng)用于CAPN1基因相關(guān)的牦牛細(xì)胞，具有重要的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了三種有效抑制牦牛CAPN1基因表達(dá)的shRNA，該shRNA為shCAPN1-1025、shCAPN1-1822和shCAPN1-1981，它們都包含21nt的siRNA正義鏈，7nt的loop環(huán)，21nt的siRNA反義鏈和終止信號(hào)。三條shRNA對(duì)CAPN1基因的mRNA抑制效率達(dá)80%以上。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供有效抑制牦牛CAPN1基因表達(dá)的shRNA，所述shRNA為以下（1）-（3）中的任意一條，每一條shRNA分子由上下游兩條DNA互補(bǔ)單鏈組成：

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述shRNA在有效抑制牦牛CAPN1基因表達(dá)中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述應(yīng)用是將一條shRNA分子中的兩條互補(bǔ)單鏈經(jīng)退火形成雙鏈的shRNA分子后，連接到慢病毒干擾載體上，構(gòu)建得到shRNA慢病毒重組載體；然后將shRNA慢病毒重組載體與CAPN1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述慢病毒干擾載體為miRZip慢病毒干擾載體。

作為優(yōu)選，所述shRNA慢病毒重組載體的具體構(gòu)建方法為：

（1）取100pmol的兩條互補(bǔ)單鏈核苷酸各2μl，加入2μl 10×退火緩沖液和14μl滅菌超純水，反應(yīng)程序：95℃ 5min 72℃ 10min，在室溫下放置 60min；然后取5ul加水95ul作為退火產(chǎn)物工作濃度；

（2）將miRZip慢病毒干擾載體經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后回收線性化質(zhì)粒，與步驟（1）得到的退火產(chǎn)物4℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素100μg/μl的LB平板篩選，將篩選陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序正確后，提取純化重組質(zhì)粒。

作為優(yōu)選，將shRNA慢病毒重組載體與CAPN1表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的具體方法為：

將shRNA慢病毒重組載體2μg與2μg的CAPN1表達(dá)質(zhì)?；旌?，加入生理鹽水混勻，室溫孵育5min，再加入6μl濃度為1mg/ml的聚乙烯亞胺，混勻后，室溫孵育10min；最后加入293T細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，充分的搖勻后放入37℃、5％CO₂、95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；感染6小時(shí)后，吸走孔內(nèi)的培養(yǎng)基，換成新鮮的2ml含10％胎牛血清的 DMEM完全培養(yǎng)基，放入37℃、5％CO₂、95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，收集細(xì)胞。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種有效抑制牦牛CAPN1基因表達(dá)的方法，是將一條shRNA分子中的兩條互補(bǔ)單鏈經(jīng)退火形成雙鏈的shRNA分子后，連接到慢病毒干擾載體上，構(gòu)建得到shRNA慢病毒重組載體；然后將shRNA慢病毒重組載體與CAPN1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；作為優(yōu)選，所述慢病毒干擾載體為miRZip慢病毒干擾載體。

作為優(yōu)選，所述shRNA慢病毒重組載體的具體構(gòu)建方法為：

（1）取100pmol的兩條互補(bǔ)單鏈核苷酸各2μl，加入2μl 10×退火緩沖液和14μl滅菌超純水，反應(yīng)程序：95℃ 5min 72℃ 10min，在室溫下放置 60min；然后取5ul加水95ul作為退火產(chǎn)物工作濃度；

（2）將miRZip慢病毒干擾載體經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后回收線性化質(zhì)粒，與步驟（1）得到的退火產(chǎn)物4℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素100μg/μl的LB平板篩選，將篩選陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序正確后，提取純化重組質(zhì)粒。

作為優(yōu)選，將shRNA慢病毒重組載體與CAPN1表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的具體方法為：

將shRNA慢病毒重組載體2μg與2μg的CAPN1表達(dá)質(zhì)粒混合，加入生理鹽水混勻，室溫孵育5min，再加入6μl濃度為1mg/ml的聚乙烯亞胺，混勻后，室溫孵育10min；最后加入293T細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，充分的搖勻后放入37℃、5％CO₂、95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；感染6小時(shí)后，吸走孔內(nèi)的培養(yǎng)基，換成新鮮的2ml含10％胎牛血清的 DMEM完全培養(yǎng)基，放入37℃、5％CO₂、95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，收集細(xì)胞。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明所述抑制牦牛CAPN1基因表達(dá)的shRNA能有效抑制牦牛CAPN1基因mRNA的表達(dá)量。將所述抑制牦牛CAPN1基因表達(dá)的shRNA構(gòu)建于慢病毒載體上，得到的重組質(zhì)粒既適合于體內(nèi)研究，還適合于體外研究，因此，該重組質(zhì)粒對(duì)于深入研究牦牛CAPN1基因的功能及分子育種均具有重要的科學(xué)意義及應(yīng)用前景。同時(shí)，與人工合成的siRNA分子比較而言，CAPN1-shRNA慢病毒干擾載體在基因轉(zhuǎn)移效率和基因沉默的持續(xù)性及穩(wěn)定性上具有顯著的優(yōu)越性，彰顯了該技術(shù)的進(jìn)步。

附圖說(shuō)明

附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為抑制牦牛CAPN1基因表達(dá)的shRNA慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為靶質(zhì)粒與干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后熒光觀察結(jié)果圖，圖中：A：shCAPN1-1025干擾載體和PCDH-CMV-CAPN1-EF1-copGFP表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞， B: shCAPN1-1822干擾載體和PCDH-CMV-CAPN1-EF1-copGFP表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，C: shCAPN1-1981干擾載體和PCDH-CMV-CAPN1-EF1-copGFP表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，D: 空載體和PCDH-CMV-CAPN1-EF1-copGFP表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

圖3 CAPN1-shRNA對(duì)CAPN1基因干擾的定量結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售。

主要試劑和儀器、設(shè)備：

限制性內(nèi)切酶；

T4連接酶(NEB)；

DH5α感受態(tài)細(xì)胞；

shRNA慢病毒載體：miRZip(SBI公司)；

pCDH-EF1-copGFP載體：全稱pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP cDNA Cloning and Expression Vector（SBI公司）；

DNA回收試劑盒（中美泰和）；

質(zhì)粒提取試劑盒（中美泰和）；

DMEM完全培養(yǎng)基；

1×PBS；

Trypsin-EDTA ；

轉(zhuǎn)染試劑Polyethylenimine(Polyscience, Cat # 23966)；

樣本（293T細(xì)胞 ?；颍?4個(gè)

BestarTM qPCR RT Kit：德國(guó)DBI公司；

Bestar? SybrGreen qPCR mastermix：德國(guó)DBI公司；

96孔板：美國(guó)life公司；

引物合成：美國(guó)life公司；

ABI7500熒光定量PCR儀（life technology公司）；

TGL-16M低溫冷凍離心機(jī)（湘儀）；

SW-CJ-1D單人凈化工作臺(tái)（瀘凈凈化）；

HR40-Ⅱ A2生物安全柜（Haier）；

Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)：Thermo Scientific公司。

實(shí)施例1

本發(fā)明的方法步驟如下：

一、牦牛CAPN1基因表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI中公布的牦牛CAPN1基因mRNA[XM_005894060]序列，人工合成CDs區(qū)（為序列表SEQ ID No.1），并在序列5’和3’端分別引入XbaI和NotI酶切位點(diǎn)。

1、制備pUC57-CAPN1載體

生物公司在合成序列后，把合成序列連接在了pUC57載體上，得到pUC57-CAPN1載體。

2、pUC57-CAPN1載體及pCDH-EF1-copGFP載體雙酶切

在2個(gè)無(wú)菌的0.2 ml EP反應(yīng)管，分別取pUC57-CAPN1載體和pCDH-EF1-copGFP載體各15 μl，用XbaI和NotI內(nèi)切酶在37℃雙酶切3h，酶切體系如下：

10×Buffer 5 μl

載體/目的片段 15 μl

XbaI 1.5 μl

NotI 1.5 μl

ddH₂O 27 μl

總體積 50 μl。

3、酶切產(chǎn)物回收

膠電泳檢測(cè)酶切效果，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的目的基因片段條帶和線性化的載體，回收純化，具體步驟如下：

1) 酶切產(chǎn)物經(jīng)1% 凝膠電泳后，在紫外燈下，用手術(shù)刀分別切取含目的片段和載體的凝膠條帶至干凈的1.5 ml EP管中，按100 mg凝膠對(duì)應(yīng)100 μl溶液GB的比例向離心管中加入溶液GB；

2) 60℃水浴10 min至凝膠完全溶化，水浴期間振蕩混合3次；

3) 將溶液轉(zhuǎn)移至DNA純化柱中，靜置2 min，室溫12 000 rpm離心1 min，棄濾液；

4) 向柱上加入600 μl溶液PW，室溫12 000 rpm離心30 sec，棄濾液；

5) 重復(fù)上一操作一次；

6) 空柱12 000 rpm離心1 min以徹底去除純化柱中殘留的液體；

7) 將柱子置于新的1.5 ml EP管上，向柱中央加入35 μl 60℃預(yù)熱的無(wú)菌水，13 400g離心1 min以洗脫出DNA。

4、目的片段與載體連接，得到PCDH-CAPN1-EF1-copGFP。

向0.2 ml EP管中加入以下試劑：T4 DNA Ligase酶，購(gòu)于Thermo Fisher公司，具體反應(yīng)體系如下：

酶切回收的載體 3μl

酶切回收的目的基因片段 2μl

10× T4 Buffer 2μl

T4 連接酶 0.5μl

ddH₂O 12.5μl

總體積 20μl。

16℃連接過(guò)夜。

5、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

1) 冰浴中將10 μl連接產(chǎn)物分別加入至50 μl Top10感受態(tài)細(xì)胞中。輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30 min；

2) 42℃水浴熱休克90 s；

3) 快速將管轉(zhuǎn)移至冰浴中，冰浴2 min；

4) 分別加入300 μl LB培養(yǎng)基，混勻， 37℃、200 rpm振蕩培養(yǎng)1 h；

4) 于超凈工作臺(tái)中，將菌液均勻涂布于含Kan抗生素（100 μg/ml）的LB平板上，室溫下放置，至液體吸收；

6) 倒置平板，轉(zhuǎn)移入37℃生化培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

6、菌落PCR驗(yàn)證

挑取數(shù)個(gè)菌落，PCR檢測(cè)。

7、陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證

將菌落PCR鑒定得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序完成后，軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果，測(cè)序引物見(jiàn)表1。

表1 測(cè)序使用的引物

8、質(zhì)粒小提，應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒（中美泰和）按照說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行提取，具體步驟如下：

1) 用2 mL EP管收集3 μL經(jīng)步驟7測(cè)序正確的菌液，12 000 rpm離心1 min，去上清；

2) 加入250 μL 溶液I/RNase A混合液，重懸菌體；

3) 加入250 μL溶液II，溫和反復(fù)顛倒混勻6次，室溫放置2 min；

4) 加入350 μL溶液III，溫和反復(fù)顛倒混勻6次；

5) 13 000 rpm離心10 min，小心吸去上清至DNA純化柱中，靜置2 min；

6) 12 000 rpm離心1 min，棄濾液；

7) 加入500μL溶液W1至柱中，13000 rpm離心1 min，棄濾液；

8) 加入600μL溶液W2至柱中，12 000 rpm離心1 min，棄濾液。重復(fù)一次；

9) 空柱12 000 rpm離心2min；

10) 將柱取出置于新的1.5 ml EP管中，加入65 μl無(wú)菌水（60 °C預(yù)熱），靜置2 min，13 400 rpm離心1 min以洗脫出質(zhì)粒。

9、酶切鑒定所提取質(zhì)粒。其氨基酸序列為序列表中SEQ ID No.2。

二、牦牛CAPN1基因shRNA干擾載體的構(gòu)建

1. 本發(fā)明針對(duì)CAPN1基因的ORF序列，人工設(shè)計(jì)合成并篩選到選擇3個(gè)不同的靶位點(diǎn)作為靶序列（1105bp-1125bp，1822bp-1842bp和1981bp-2001bp），并將其設(shè)計(jì)為包含siRNA正義鏈、loop環(huán)（TCAAGAG）和siRNA反義鏈的shRNA結(jié)構(gòu)，分別命名為shCAPN1-1105、shCAPN1-1822和shCAPN1-1981，在正義鏈模板的5’端添加了GATC，與BamH I酶切后形成的粘端互補(bǔ)；反義鏈模板的5’端添加了AATT，與EcoR I酶切后形成的粘端互補(bǔ)。具體序列為：

2. 取100pmol的兩條互補(bǔ)單鏈核苷酸各2μl，加入2μl 10×退火緩沖液和14μl滅菌超純水，反應(yīng)程序：95℃ 5min 72℃ 10min，在室溫下放置 60min。取5ul加水95ul作為退火產(chǎn)物工作濃度用。

3. 將miRZip慢病毒干擾載體經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后回收線性化質(zhì)粒，與步驟2得到的退火產(chǎn)物4℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用LB平板氨芐青霉素100μg/μl進(jìn)行篩選，將上游載體檢測(cè)引物及下游shRNA寡核苷酸引物篩選陽(yáng)性克隆并送上海生工測(cè)序鑒定序列正確后，提取純化重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。

三、shRNA干擾載體與CAPN1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

1. 293T細(xì)胞傳代種板

1) 復(fù)蘇293T經(jīng)過(guò)一次傳代后，待細(xì)胞狀態(tài)較好時(shí)可用于轉(zhuǎn)染；

2) 將10%血清的DMEM完全培養(yǎng)基、1×PBS和0.25%Trypsin-EDTA預(yù)先平衡至室溫；

3) 吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用1×PBS洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的血清；

4) 吸去PBS，加入適量Trypsin-EDTA，輕輕旋轉(zhuǎn)，使Trypsin-EDTA均勻覆蓋培養(yǎng)器皿表面，消化1-2分鐘，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓，用手輕拍培養(yǎng)皿的壁，立即加入2ml的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化；

5) 用吸管吸取液體，輕輕吹打培養(yǎng)器皿表面，反復(fù)3-5次，使細(xì)胞徹底脫離瓶皿底壁，將細(xì)胞移入離心管中，再向培養(yǎng)瓶中加入1×PBS洗1次，并將洗液一并轉(zhuǎn)移至離心管中，離心（250g，4分鐘），吸去上清液；

6) 加入5ml的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，用吸管輕輕吹打收集的細(xì)胞懸液，取樣計(jì)數(shù)；

7) 參照計(jì)數(shù)結(jié)果，取2×10⁴cells/孔的密度接種至6孔板。

2. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

1) 待細(xì)胞完全貼壁后，長(zhǎng)至60%左右密度即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前，每孔細(xì)胞換成2ml新鮮的含10％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱孵育1h；

2) 將3條CAPN1-shRNA載體、shRNA空載體分別與CAPN1表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，三個(gè)干擾質(zhì)粒、shRNA空載體分別各取2μg，與2μg的CAPN1表達(dá)質(zhì)粒分別混合于1.5ml EP管中，加入200ul的生理鹽水輕輕混勻，室溫孵育5min，再加質(zhì)粒6ul的轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺（Polyethylenimine） (1mg/ml)，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫孵育10min。最后分別加入六孔板中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，充分的搖勻后放入37℃、5％CO₂、95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

3) 感染6小時(shí)后，吸走孔內(nèi)的培養(yǎng)基，換成新鮮的2ml含10％胎牛血清的 DMEM完全培養(yǎng)基，放入37℃、5％CO₂、95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 感染48小時(shí)后，于熒光顯微鏡下觀察感染效果；

5) 待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，即可收集進(jìn)行QPCR檢測(cè)。

四、shRNA對(duì)CAPN1基因轉(zhuǎn)錄水平抑制效果的評(píng)價(jià)

1、RNA的抽提

RNA 的提取按life technology公司提供的Triozol使用說(shuō)明進(jìn)行。程序如下：

1) 往細(xì)胞培養(yǎng)板中加入1ml TRIzol，反復(fù)吹打幾次后吸出，置于1.5ml離心管；

2) 加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管管蓋，上下顛倒混勻60s（請(qǐng)勿渦漩激烈振蕩），室溫靜置3min，12,000g，4℃離心 15min，置于冰上；

3) 溶液分為三層，RNA溶解在水相中，小心吸取 500μl水相至另一個(gè)新的RNase free的EP管中；

4) 加入500μl異丙醇，-20度放置1h，12,000g，4℃離心10min，離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，棄上清；

5) 加入1ml 75％乙醇，用手輕輕顛倒，12,000g離心5min，去上清；

6) 超凈工作臺(tái)上吹干樣品10min，加入適量DEPC水溶解RNA。 加入40μl DEPC水溶解沉淀。

2、RNA質(zhì)量檢測(cè)

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。

3、去基因組DNA和cDNA的合成

將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫10,000g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。把RNA在65℃條件下熱變性5分鐘后，立即置于冰上冷卻。然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑為：

5×RT Buffer 2ul

RT Enzyme Mix 0.5μl

Primer Mix 0.5μl

RNA 6μl

RNase-free Water 1μl

總體積 10μl。

反應(yīng)條件：37℃ 15min，98℃ 5min，4℃ hold，反應(yīng)結(jié)束后，-20℃保存。

4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

每個(gè)樣本分別設(shè)置3個(gè)目的基因和3個(gè)內(nèi)參基因的平行實(shí)驗(yàn)。

PCR反應(yīng)體系為：

Bestar? SybrGreen qPCR mastermix 10μl

Forward Primer(20μM) 0.25μl

Reverse Primer(20μM) 0.25 μl

50×ROX 0.04μl

cDNA 5μl

ddH₂O 4.46μl

反應(yīng)條件為：95℃ 2min；95℃ 10s，60℃ 34s，72℃ 30s，45個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后從60℃升高到98℃獲取熔解曲線。

使用的引物參見(jiàn)表2。

表2

在進(jìn)行定量PCR試驗(yàn)前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)檢測(cè)cDNA樣品的質(zhì)量。對(duì)cDNA樣品使用內(nèi)參基因ACTB進(jìn)行Real-time PCR試驗(yàn)，根據(jù)Ct值，評(píng)價(jià)cDNA樣品質(zhì)量。18＜Ct＜25的可直接進(jìn)行后期試驗(yàn)；若Ct≥30說(shuō)明cDNA樣品濃度偏低，需重新進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；若無(wú)擴(kuò)增結(jié)果，則cDNA質(zhì)量存在問(wèn)題，需重新進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

將cDNA模板從10倍到10⁵倍梯度稀釋，并以此為模板，對(duì)每對(duì)探針進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。以內(nèi)參基因ACTB的五個(gè)梯度反應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將其他各對(duì)引物的曲線斜率和R²與內(nèi)參基因進(jìn)行比較，保證擴(kuò)增效率一致。

5、熒光定量PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所述的熒光定量PCR數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化統(tǒng)計(jì)分析為以ACTB基因?yàn)閮?nèi)參基因校正不同樣品初始模板量以及反轉(zhuǎn)錄效率的差異，每次反應(yīng)，每個(gè)樣本的目的基因和內(nèi)參基因各重復(fù)三次，獲得平均Ct值，利用Excel軟件計(jì)算樣品ΔΔCt值，用法計(jì)算得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量和各shRNA片段抑制效率。干擾效率(%)=[(表達(dá)對(duì)照組表達(dá)量-shRNA組表達(dá)量)/表達(dá)對(duì)照組表達(dá)量]×100％。本發(fā)明的三條shRNA均對(duì)CAPN1有較好的抑制作用，其中，shRNA1105的抑制效率為85%，shRNA1822的抑制效率為92%，shRNA1981的抑制效率最高，達(dá)98%。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所

<120> 有效抑制牦牛CAPN1基因表達(dá)的shRNA及其應(yīng)用

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2151

<212> DNA

<213> CAPN1基因CDs區(qū)序列

<400> 1

atggccgagg agttcatcac tccggtgtac tgcaccgggg tgtctgcaca agtgcagaag 60

cagcgggcca aggagctggg cctgggccgc catgaaaatg ccatcaagta cctgggccag 120

gattacgagc agctgcgggt tcactgcctg caaagagggg cccttttccg tgacgaggct 180

ttccccccag tgccccagag cctgggcttc aaggagctgg gccccaactc ctccaaaacc 240

tatggcatca agtggaagcg tcccacggag ctgttctcaa acccccagtt catcgtggat 300

ggagccaccc gcacggacat ctgccagggc gcactggggg actgttggct cctggctgcc 360

atcgcctccc ttaccctcaa tgacaccctc ctgcaccgag tagttccaca tggccaaagc 420

ttccaggatg gctacgctgg catcttccat ttccagctgt ggcagtttgg tgagtgggtg 480

gatgtggtgg tggatgacct gctgcccacc aaggacggga agctggtgtt tgtgcactct 540

gcccaaggca acgagttctg gagcgccctg ctggagaagg cctatgccaa ggtgaacggc 600

agctacgagg ccctctcagg aggcagcacg tctgagggct ttgaggactt caccggcgga 660

gtcaccgagt ggtacgagct gcggaaggcg cccagcgacc tctacaacat catcctcaag 720

gccctggagc gtggctccct gctgggctgc tccatcgata tctccagcat tctggacatg 780

gaggctgtca ccttcaagaa gctagtgaag ggccacgcct actctgtgac cggggccaag 840

caggtgaact accagggcca gatggtgaac ctgatccgga tgcggaaccc ctggggcgag 900

gtggagtgga caggagcctg gagtgacggc tcctcggagt ggaacggcgt ggacccttac 960

atgcgggagc agctccgggt caagatggag gatggggagt tctggatgtc attccgagac 1020

ttcatgcgtg aattcacccg cctggagatc tgcaacctga cacccgatgc gctcaagagc 1080

cagaggttcc gcaactggaa caccaccctg tacgagggca cctggcggcg ggggagcacc 1140

gcggggggct gccgcaacta cccagccact ttctgggtga acccccagtt caagatccgg 1200

ctggaggaga cggatgaccc ggaccccgac aactacgggg gtcgcgagtc aggctgcagc 1260

ttcctgctcg ccctcatgca gaagcaccgc cgtcgggagc gccgtttcgg ccgtgacatg 1320

gagaccatag gcttcgctgt ctacgaggtc cctccggagc tggtgggcca gccagccgtg 1380

catctgaagc gggacttctt cctgtccaac gcctcccggg cccggtccga gcagttcatc 1440

aacctgcggg aggtcagcac ccgcttccgc ctgccgcctg gggagtatgt ggtggtgccc 1500

tccacctttg agcccaacaa ggaaggtgac tttgtgctgc gtttcttctc agagaagagc 1560

gcagggaccc aagagctgga tgaccaggtc caggccaatc tccccgacga gcaagtgctc 1620

tcagaagagg agattgatga gaacttcaag tccctcttca gacaactggc aggggaggac 1680

atggagatca gcgtcaagga gctgcggacc atcctcaaca ggatcatcag caaacacaaa 1740

gacctgcgga ccacgggctt cagcctggag tcctgccgca gcatggtcaa cctcatggat 1800

cgcgacggca atggcaaact gggcctggtg gagttcaaca tcctatggaa ccggatccgg 1860

aattacctgt ccatcttccg gaagtttgac ctggacaagt cgggcagcat gagtgcctat 1920

gaaatgcgga tggccattga gtttgcaggc ttcaagctca acaagaagct gtacgagctc 1980

attatcaccc gctactcgga gcccgacctg gccgtggact tcgacaactt cgtgtgctgc 2040

ctggtgcggc tggagaccat gttccggttt ttcaaaactc tggacactga tctggatgga 2100

gtggtgacct ttgacttgtt taagtggtta cagctgacca tgtttgcatg a 2151

<210> 2

<211> 716

<212> PRT

<213> 人工蛋白

<400> 2

Met Ala Glu Glu Phe Ile Thr Pro Val Tyr Cys Thr Gly Val Ser Ala

1 5 10 15

Gln Val Gln Lys Gln Arg Ala Lys Glu Leu Gly Leu Gly Arg His Glu

20 25 30

Asn Ala Ile Lys Tyr Leu Gly Gln Asp Tyr Glu Gln Leu Arg Val His

35 40 45

Cys Leu Gln Arg Gly Ala Leu Phe Arg Asp Glu Ala Phe Pro Pro Val

50 55 60

Pro Gln Ser Leu Gly Phe Lys Glu Leu Gly Pro Asn Ser Ser Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Gly Ile Lys Trp Lys Arg Pro Thr Glu Leu Phe Ser Asn Pro Gln

85 90 95

Phe Ile Val Asp Gly Ala Thr Arg Thr Asp Ile Cys Gln Gly Ala Leu

100 105 110

Gly Asp Cys Trp Leu Leu Ala Ala Ile Ala Ser Leu Thr Leu Asn Asp

115 120 125

Thr Leu Leu His Arg Val Val Pro His Gly Gln Ser Phe Gln Asp Gly

130 135 140

Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Gln Leu Trp Gln Phe Gly Glu Trp Val

145 150 155 160

Asp Val Val Val Asp Asp Leu Leu Pro Thr Lys Asp Gly Lys Leu Val

165 170 175

Phe Val His Ser Ala Gln Gly Asn Glu Phe Trp Ser Ala Leu Leu Glu

180 185 190

Lys Ala Tyr Ala Lys Val Asn Gly Ser Tyr Glu Ala Leu Ser Gly Gly

195 200 205

Ser Thr Ser Glu Gly Phe Glu Asp Phe Thr Gly Gly Val Thr Glu Trp

210 215 220

Tyr Glu Leu Arg Lys Ala Pro Ser Asp Leu Tyr Asn Ile Ile Leu Lys

225 230 235 240

Ala Leu Glu Arg Gly Ser Leu Leu Gly Cys Ser Ile Asp Ile Ser Ser

245 250 255

Ile Leu Asp Met Glu Ala Val Thr Phe Lys Lys Leu Val Lys Gly His

260 265 270

Ala Tyr Ser Val Thr Gly Ala Lys Gln Val Asn Tyr Gln Gly Gln Met

275 280 285

Val Asn Leu Ile Arg Met Arg Asn Pro Trp Gly Glu Val Glu Trp Thr

290 295 300

Gly Ala Trp Ser Asp Gly Ser Ser Glu Trp Asn Gly Val Asp Pro Tyr

305 310 315 320

Met Arg Glu Gln Leu Arg Val Lys Met Glu Asp Gly Glu Phe Trp Met

325 330 335

Ser Phe Arg Asp Phe Met Arg Glu Phe Thr Arg Leu Glu Ile Cys Asn

340 345 350

Leu Thr Pro Asp Ala Leu Lys Ser Gln Arg Phe Arg Asn Trp Asn Thr

355 360 365

Thr Leu Tyr Glu Gly Thr Trp Arg Arg Gly Ser Thr Ala Gly Gly Cys

370 375 380

Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Phe Trp Val Asn Pro Gln Phe Lys Ile Arg

385 390 395 400

Leu Glu Glu Thr Asp Asp Pro Asp Pro Asp Asn Tyr Gly Gly Arg Glu

405 410 415

Ser Gly Cys Ser Phe Leu Leu Ala Leu Met Gln Lys His Arg Arg Arg

420 425 430

Glu Arg Arg Phe Gly Arg Asp Met Glu Thr Ile Gly Phe Ala Val Tyr

435 440 445

Glu Val Pro Pro Glu Leu Val Gly Gln Pro Ala Val His Leu Lys Arg

450 455 460

Asp Phe Phe Leu Ser Asn Ala Ser Arg Ala Arg Ser Glu Gln Phe Ile

465 470 475 480

Asn Leu Arg Glu Val Ser Thr Arg Phe Arg Leu Pro Pro Gly Glu Tyr

485 490 495

Val Val Val Pro Ser Thr Phe Glu Pro Asn Lys Glu Gly Asp Phe Val

500 505 510

Leu Arg Phe Phe Ser Glu Lys Ser Ala Gly Thr Gln Glu Leu Asp Asp

515 520 525

Gln Val Gln Ala Asn Leu Pro Asp Glu Gln Val Leu Ser Glu Glu Glu

530 535 540

Ile Asp Glu Asn Phe Lys Ser Leu Phe Arg Gln Leu Ala Gly Glu Asp

545 550 555 560

Met Glu Ile Ser Val Lys Glu Leu Arg Thr Ile Leu Asn Arg Ile Ile

565 570 575

Ser Lys His Lys Asp Leu Arg Thr Thr Gly Phe Ser Leu Glu Ser Cys

580 585 590

Arg Ser Met Val Asn Leu Met Asp Arg Asp Gly Asn Gly Lys Leu Gly

595 600 605

Leu Val Glu Phe Asn Ile Leu Trp Asn Arg Ile Arg Asn Tyr Leu Ser

610 615 620

Ile Phe Arg Lys Phe Asp Leu Asp Lys Ser Gly Ser Met Ser Ala Tyr

625 630 635 640

Glu Met Arg Met Ala Ile Glu Phe Ala Gly Phe Lys Leu Asn Lys Lys

645 650 655

Leu Tyr Glu Leu Ile Ile Thr Arg Tyr Ser Glu Pro Asp Leu Ala Val

660 665 670

Asp Phe Asp Asn Phe Val Cys Cys Leu Val Arg Leu Glu Thr Met Phe

675 680 685

Arg Phe Phe Lys Thr Leu Asp Thr Asp Leu Asp Gly Val Val Thr Phe

690 695 700

Asp Leu Phe Lys Trp Leu Gln Leu Thr Met Phe Ala

705 710 715

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> CAPN1sh1上游序列

<400> 3

gatcggatgt cattccgaga cttcatcaag agtgaagtct cggaatgaca tccttttt 58

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> CAPN1sh1下游序列

<400> 4

aattaaaaag gatgtcattc cgagacttca ctcttgatga agtctcggaa tgacatcc 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> CAPN1sh2上游序列

<400> 5

gatcggatca tcagcaaaca caaagtcaag agctttgtgt ttgctgatga tccttttt 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> CAPN1sh2下游序列

<400> 6

aattaaaaag gatcatcagc aaacacaaag ctcttgactt tgtgtttgct gatgatcc 58

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> CAPN1sh3上游序列

<400> 7

gatcggaagt ttgacctgga caagttcaag agacttgtcc aggtcaaact tccttttt 58

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> CAPN1sh3下游序列

<400> 8

aattaaaaag gaagtttgac ctggacaagt ctcttgaact tgtccaggtc aaacttcc 58