本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類新型的甾體皂苷類化合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所產(chǎn)生的防御反應(yīng)。大多數(shù)疾病都伴有炎癥的發(fā)生，炎癥會加重疾病的發(fā)生和發(fā)展，有些慢性炎癥會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，因此，對炎癥的控制和治療具有非常重要的意義。

天然藥物尤其是來源于植物的藥物具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性，一直是人類預(yù)防和治療疾病的主要來源。臨床上應(yīng)用的許多藥物都直接或間接來源于天然產(chǎn)物，天然產(chǎn)物不僅可以作為藥物半合成的前體物，而且可以作為藥物化學(xué)合成的的模板，為新藥設(shè)計提供新思路。天然產(chǎn)物已成為發(fā)現(xiàn)新藥物或先導(dǎo)化合物的主要源泉之一。

龍葵(Solanum nigrum L)為茄科(Solanaceace)茄屬(Solanum)具紫莖植物特征的一年至多年生草本植物，又名黑星星、黑天天、天泡果、老鴨眼睛、苦菜、苦葵等，遍布全國，常生于農(nóng)田、荒地、田邊及村莊附近。龍葵全草可入藥，以干燥、色綠、肥嫩者入藥為佳。龍葵性寒，味苦、微甘，有小毒，歸肺、腎二經(jīng)，有清熱解毒、活血化瘀、利水消腫、止咳祛痰的功效，主治瘡癰腫毒、細(xì)菌性痢疾、慢性支氣管炎、乳腺炎和癌癥等。

龍葵青果中的主要活性成分為甾體皂苷類成分?，F(xiàn)代藥理實驗研究表明龍葵青果具有較強的抗腫瘤、抗炎、抑菌等活性?，F(xiàn)有研究對龍葵青果化學(xué)成分研究仍不夠徹底，因而龍葵青果中甾體類化學(xué)成分值得進一步研究和開發(fā)利用。我們對龍葵青果的甾體皂苷類成分進行了系統(tǒng)分離，獲得了一類新型的甾體皂苷類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗炎、抗腫瘤活性未見有過報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一類新型的甾體皂苷類化合物及其在制備抗炎、抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一類新型的甾體皂苷類化合物，其結(jié)構(gòu)通式為：

式中，R₁為β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-半乳糖或β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-半乳糖或β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-α-L-鼠李糖-(1→4)-[α-L-鼠李糖-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖或α-L-鼠李糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖-(1→4)]-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-半乳糖或β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-半乳糖或β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖-(1→3)]-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-半乳糖；

R₂為α-OH或β-OH或＝O；

R₃為β-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖；

R₄和R5為H或R4與R5形成碳碳雙鍵；

R₆為-OH或H。

本發(fā)明所述的新型的甾體皂苷類化合物包括9種化合物，其來源是從龍葵青果中提取獲得，所述的提取方法為：

取干燥龍葵青果藥材6kg，用環(huán)己烷回流提取兩次，棄去環(huán)己烷提取液。脫脂處理后的藥材以10倍量的70％甲醇加熱回流提取3次，每次2小時，合并提取液減壓濃縮得到浸膏。將浸膏用水混懸，經(jīng)D101大孔樹脂柱(1300×100mm)，分別以水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇及100％甲醇洗脫，其中50％甲醇洗脫部分通過反復(fù)硅膠柱色譜、反相MPLC柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜及半制備反相HPLC柱色譜等手段，分離得到化合物1-9。并通過理化常數(shù)和現(xiàn)代波譜學(xué)手段(HRESIMS,1D-NMR,2D-NMR)鑒定以上9個化合物。

進一步地，所述的9種化合物的化學(xué)名稱如下表所示：

進一步地，所述的9種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下表所示：

本發(fā)明還提供了所述的甾體皂苷類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的甾體皂苷類化合物可以單獨使用或與其他藥物組合使用，添加藥學(xué)上可接受的載體，制成各種成品制劑。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明從龍葵青果中提取出9種新型的甾體皂苷類化合物，并通過理化常數(shù)和現(xiàn)代波譜學(xué)手段進行鑒定，所得的9種新型的甾體皂苷類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，為進一步研究和開發(fā)利用龍葵青果中甾體類化學(xué)成分的價值提供有力的參考資料。動物藥效學(xué)試驗表明，本發(fā)明提供的9種新型的甾體皂苷類化合物具有較好體外抗炎活性，對人急性髓性白血病細(xì)胞HL-60、人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937和人肝癌細(xì)胞HepG2 3個腫瘤株均具有不同程度的腫瘤抑制作用，表明其可以進一步作為新的抗炎、抗腫瘤藥物進行研究開發(fā)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明甾體皂苷類化合物對IL-6和IL-1β的的抑制作用，其中，Ctrl-：陰性對照；Ctrl+：陽性對照；1-9：化合物1-9，LPS：脂多糖；*表示與LPS組相比，P<0.05；**表示與LPS組相比，p<0.01。

圖2為本發(fā)明甾體皂苷類化合物對不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用，其中，1-9：化合物1-9。

具體實施方式

以下通過具體實施方式進一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實施例。

實施例1甾體皂苷類化合物的提取

取干燥龍葵青果藥材6kg，用環(huán)己烷回流提取兩次，棄去環(huán)己烷提取液。脫脂處理后的藥材以10倍量的70％甲醇加熱回流提取3次，每次2小時，合并提取液減壓濃縮得到浸膏。將浸膏用水混懸，經(jīng)D101大孔樹脂柱(1300×100mm)，分別以水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇及100％甲醇洗脫，其中50％甲醇洗脫部分通過反復(fù)硅膠柱色譜、反相MPLC柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜及半制備反相HPLC柱色譜等手段，分離得到化合物1-9。

實施例2化合物1的鑒定

通過理化常數(shù)和波譜學(xué)手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜)對化合物1進行鑒定，結(jié)果為如下：

化合物1為白色無定形粉末，對Anisaldehyde(A試劑)反應(yīng)顯黃色，對Ehrlish(E試劑)不顯色，酸水解檢出D-葡萄糖和D-半乳糖，提示該化合物為螺甾皂苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+NH₄]⁺m/z 1128.5492(calcd.for C₅₁H₈₆NO₂₆ 1128.5438)，提示其分子量為1110，結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C₅₁H₈₂O₂₆。

在¹H-NMR譜中，高場區(qū)給出甾體皂苷元上四個特征的甲基信號，其中兩個角甲基為單峰，另外兩個為雙峰，分別位于δ1.17(3H,s,Me-18)、0.64(3H,s,Me-19)、1.57(3H,d,J＝6.9Hz,Me-21)及1.19(3H,d,J＝7.2Hz,Me-27)，與18-Me的氫信號相比，19-Me的氫信號處于高場，說明苷元5位氫為α構(gòu)型。在糖端基氫區(qū)給出四個糖端基氫信號δ4.86(1H,d,J＝7.6Hz)、5.15(1H,d,J＝7.9Hz)、5.30(1H,d,J＝7.9Hz)和5.57(1H,d,J＝7.7Hz)，結(jié)合這些糖端基氫信號的J值與酸水解分析結(jié)果，說明分子中的D-葡萄糖和D-半乳糖均為β構(gòu)型。

¹³C-NMR(DEPT)中，δ181.1為一個酯羰基碳信號，δ110.7為螺甾類皂苷骨架上22位碳的特征信號。在糖端基信號區(qū)給出四個糖端基碳信號δ102.7、104.8、105.2和105.4，提示化合物1為四糖螺甾皂苷。比較該化合物苷元部分的碳譜數(shù)據(jù)與文獻報道的solanigroside D苷元部分的碳譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，除C環(huán)上C-11、C-12和C-13有差異外，其余基本一致。與solanigroside D比較，化合物1苷元的C-12向低場位移至79.6ppm，C-11和C-13也分別向低場位移了10.6和6.0ppm，推測在該化合物苷元的C-12位存在一個羥基，其二維圖譜也證實了上述推測。在ROESY譜中，12位的氫信號δ3.48(1H,dd,J＝11.0,4.5Hz)與δ1.02(1H,m,H-14)和2.28(1H,dd,J＝8.5,6.6Hz,H-17)相關(guān)，說明12位氫為α構(gòu)型，因而12位羥基為β構(gòu)型。從而確定該化合物的苷元為(25R)-5α-spirostan-3β,12β,23α-triol-26-one。

在HMBC譜中，葡萄糖的端基質(zhì)子信號δ5.57(1H,d,J＝7.7Hz)與內(nèi)側(cè)葡萄糖的C-2(δ81.8)相關(guān)，另一個葡萄糖端基質(zhì)子信號δ5.30(1H,d,J＝7.9Hz)與內(nèi)側(cè)葡萄糖的C-3(δ88.8)相關(guān)，另外內(nèi)側(cè)葡萄糖的端基質(zhì)子信號δ5.15(1H,d,J＝7.9Hz)與半乳糖的C-4(δ80.5)相關(guān)，半乳糖的端基質(zhì)子信號δ4.86(1H,d,J＝7.6Hz)與苷元C-3(δ77.8)相關(guān)，確定該化合物3位的糖鏈為D-Glc-(1→2)-[D-Glc-(1→3)]-D-Glc-(1→4)-D-Gal。通過¹H-NMR、¹³C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜可以對該化合物的碳及氫信號進行全面歸屬。

綜合以上信息，化合物1鑒定為

(25R)-5α-spirostan-3β,12β,23α-triol-26-one-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside。化合物1的¹H和¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表1，結(jié)構(gòu)式為：

實施例3化合物2的鑒定

通過理化常數(shù)和波譜學(xué)手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜)對化合物2進行鑒定，結(jié)果為如下：

化合物2為白色無定形粉末，對Anisaldehyde(A試劑)反應(yīng)顯黃色，對Ehrlish(E試劑)不顯色，酸水解檢出D-葡萄糖和D-半乳糖，提示該化合物為螺甾皂苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+NH₄]⁺m/z 1128.5497(calcd.for C₅₁H₈₆NO₂₆ 1128.5438)，提示其分子量為1110，結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C₅₁H₈₂O₂₆。

在¹H-NMR譜中，高場區(qū)給出甾體皂苷元上四個特征的甲基信號，其中兩個角甲基為單峰，另外兩個為雙峰，分別位于δ1.01(3H,s,Me-18)、0.66(3H,s,Me-19)、1.33(3H,d,J＝6.9Hz,Me-21)和1.20(3H,d,J＝7.2Hz,Me-27)，與18-Me的氫信號相比，19-Me的氫信號處于高場，說明苷元5位氫為α構(gòu)型。在糖端基氫區(qū)給出四個糖端基氫信號δ4.84(1H,d,J＝7.6Hz)、5.14(1H,d,J＝7.9Hz)、5.30(1H,d,J＝7.8Hz)和5.57(1H,d,J＝7.7Hz)，結(jié)合這些糖端基氫信號的J值與酸水解分析結(jié)果，說明分子中的D-葡萄糖和D-半乳糖均為β構(gòu)型。

¹³C-NMR(DEPT)中，δ181.1為一個酯羰基碳信號，δ110.5為螺甾類皂苷骨架上22位碳的特征信號。在糖端基信號區(qū)給出四個糖端基碳信號δ102.6、104.8、105.2和105.4，提示化合物2為四糖螺甾皂苷。該化合物苷元和糖鏈部分碳譜數(shù)據(jù)與化合物1的十分相似，除C環(huán)上C-12有差異外，其余基本一致，又因二者具有相同的分子式，推測二者具有相同的平面結(jié)構(gòu)，僅立體構(gòu)型有差異?；衔?苷元的C-12位于71.7ppm，與化合物1比較向高場位移了7.9ppm，推測在該化合物12羥基為α構(gòu)型。在ROESY譜中，12位氫信號δ3.93(1H,m)與δ1.01(3H,s,Me-18)和2.79(1H,p,J＝8.5,6.8Hz,H-20)相關(guān)，說明12位氫為β構(gòu)型，因而12位羥基為α構(gòu)型。綜合以上信息，化合物2鑒定為

(25R)-5α-spirostan-3β,12α,23α-triol-26-one-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside?；衔?的¹H和¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表1，結(jié)構(gòu)式為：

實施例4化合物3的鑒定

通過理化常數(shù)和波譜學(xué)手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜)對化合物3進行鑒定，結(jié)果為如下：

化合物3為白色無定形粉末，對Anisaldehyde(A試劑)反應(yīng)顯黃色，對Ehrlish(E試劑)不顯色，酸水解檢出D-葡萄糖和D-半乳糖，提示該化合物為螺甾皂苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+NH₄]⁺m/z 1126.5308(calcd.for C₅₁H₈₄NO₂₆ 1126.5282)，提示其分子量為1108，結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C₅₁H₈₀O₂₆。

在¹H-NMR譜中，高場區(qū)給出甾體皂苷元上四個特征的甲基信號，其中兩個角甲基為單峰，另外兩個為雙峰，分別位于δ1.15(3H,s,Me-18)、0.64(3H,s,Me-19)、1.50(3H,d,J＝7.0Hz,Me-21)和1.20(3H,d,J＝7.2Hz,Me-27)，與18-Me的氫信號相比，19-Me的氫信號處于高場，說明苷元5位氫為α構(gòu)型。在糖端基氫區(qū)給出四個糖端基氫信號δ4.86(1H,d,J＝7.6Hz)、5.15(1H,d,J＝7.9Hz)、5.31(1H,d,J＝7.8Hz)和5.58(1H,d,J＝7.7Hz)，結(jié)合這些糖端基氫信號的J值與酸水解分析結(jié)果，說明分子中的D-葡萄糖和D-半乳糖均為β構(gòu)型。

¹³C-NMR(DEPT)中，δ213.0與181.1為羰基碳信號，δ110.6為螺甾類皂苷骨架上22位碳的特征信號。在糖端基信號區(qū)給出四個糖端基碳信號δ102.7、104.8、105.2和105.4，提示化合物3為四糖螺甾皂苷。該化合物苷元和糖鏈部分碳譜數(shù)據(jù)與化合物2的十分相似，除C環(huán)上C-11、C-12和C-13有差異外，其余基本一致。在HMBC譜中，δ2.33(H-11)、2.18(H-11)、1.29(H-14)、2.87(H-17)及1.15(Me-18)與δ213.0相關(guān)，說明化合物3苷元12位為羰基。通過¹H-NMR、¹³C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜可以對該化合物的碳及氫信號進行全面歸屬。綜合以上信息，化合物3鑒定為

(25R)-5α-spirostan-3β,23α-diol-12,26-dione-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside?；衔?的¹H和¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表1，結(jié)構(gòu)式為：

實施例5化合物4的鑒定

通過理化常數(shù)和波譜學(xué)手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜)對化合物4進行鑒定，結(jié)果為如下：

化合物4為白色無定形粉末，對Anisaldehyde(A試劑)反應(yīng)顯黃色，對Ehrlish(E試劑)不顯色，酸水解檢出D-葡萄糖和D-半乳糖，提示該化合物為螺甾皂苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+NH₄]⁺m/z 964.4782(calcd.for C₄₅H₇₄NO₂₁ 964.4753)，提示其分子量為946，結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C₄₅H₇₀O₂₁。

在¹H-NMR譜中，高場區(qū)給出甾體皂苷元上四個特征的甲基信號，其中兩個角甲基為單峰，另外兩個為雙峰，分別位于δ1.16(3H,s,Me-18)、0.67(3H,s,Me-19)、1.51(3H,d,J＝6.9Hz,Me-21)和1.21(3H,d,J＝7.1Hz,Me-27)，與18-Me的氫信號相比，19-Me的氫信號處于高場，說明苷元5位氫為α構(gòu)型。在糖端基氫區(qū)給出三個糖端基氫信號δ4.88(1H,d,J＝7.7Hz)、5.15(1H,d,J＝7.8Hz)和5.23(1H,d,J＝7.5Hz)，結(jié)合這些糖端基氫信號的J值與酸水解分析結(jié)果，說明分子中的D-葡萄糖和D-半乳糖均為β構(gòu)型。

¹³C-NMR(DEPT)中，δ213.1與181.1為羰基碳信號，δ110.6為螺甾類皂苷骨架上22位碳的特征信號。在糖端基信號區(qū)給出三個糖端基碳信號δ102.7、105.5和107.3，提示化合物4為三糖螺甾皂苷。該化合物苷元部分碳譜數(shù)據(jù)與化合物3的基本一致，提示二者含有相同的苷元(25R)-5α-spirostan-3β,23α-diol-12,26-dione?；衔?的糖鏈部分的核磁數(shù)據(jù)與文獻報道的(25R)-5α-spirostan-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside的糖鏈部分?jǐn)?shù)據(jù)一致，提示二者具有相同的糖組成和連接順序。在HMBC譜中，外側(cè)葡萄糖的端基氫信號δ5.23(1H,d,J＝7.5Hz)與內(nèi)側(cè)葡萄糖的C-2(δ86.5)相關(guān)，內(nèi)側(cè)葡萄糖的端基質(zhì)子信號δ5.15(1H,d,J＝7.8Hz)與半乳糖的C-4(δ81.4)相關(guān)，半乳糖的端基質(zhì)子信號δ4.88(1H,d,J＝7.7Hz)與苷元的C-3(δ77.4)相關(guān)，進一步確定了糖鏈的連接順序和鏈接位點。通過¹H-NMR、¹³C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜可以對該化合物的碳及氫信號進行全面歸屬。綜合以上信息，化合物4鑒定為

(25R)-5α-spirostan-3β,23α-diol-12,26-dione-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside?；衔?的¹H和¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表1，結(jié)構(gòu)式為：

實施例6化合物5的鑒定

通過理化常數(shù)和波譜學(xué)手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜)對化合物5進行鑒定，結(jié)果為如下：

化合物5為白色無定形粉末，對Anisaldehyde(A試劑)反應(yīng)顯黃色，對Ehrlish(E試劑)顯粉紅色，酸水解檢出D-葡萄糖和L-鼠李糖，提示該化合物為呋甾皂苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+NH₄]⁺m/z 1244.6339(calcd.for C₅₇H₉₈NO₂₈ 1244.6275)，提示其分子量為1226，結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C₅₇H₉₄O₂₈。

在¹H-NMR譜中，高場區(qū)給出六個特征的甲基信號，包括甾體皂苷元上四個特征的甲基信號，分別位于δ0.99(3H,d,J＝6.6Hz)、1.38(3H,d,J＝7.1Hz)、1.00(3H,s)和1.09(3H,s)，以及兩個鼠李糖上甲基的特征信號，分別位于δ1.59(3H,d,J＝6.1Hz)和1.76(3H,d,J＝6.2Hz)，提示分子中含有兩分子鼠李糖殘基。由于27位甲基的化學(xué)位移(δ0.99)小于1.00ppm且26位兩個質(zhì)子的化學(xué)位移之差(0.33ppm)小于0.48ppm，說明該化合物為25R呋甾皂苷。

在¹³C-NMR譜中，δ111.7為呋甾皂苷C-22特征信號，δ100.6、102.0、102.3、105.2和107.6為糖端基碳信號，提示該化合物為五糖呋甾皂苷。該化合物的碳譜數(shù)據(jù)與文獻報道的(25R)-spirostan-5(6)-en-3β,17α-diol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside(solanigroside H)的碳譜數(shù)據(jù)基本一致，除了多出六個屬于葡萄糖的碳信號及F環(huán)有差別外，其余基本一致，提示該化合物為solanigroside H的F環(huán)開環(huán)后形成的產(chǎn)物。

在HMBC譜中，多出的葡萄糖端基質(zhì)子信號δ4.82(1H,d,J＝7.7Hz)與苷元C-26(δ75.6)相關(guān)，證明葡萄糖連接在化合物的C-26位。通過¹H-NMR、¹³C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜并結(jié)合文獻可以對該化合物的碳及氫信號進行全面歸屬。綜合以上信息，化合物5鑒定為

(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-5(6)-en-3β,17α,22α,26-tetraol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside。化合物5的¹H和¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表2，結(jié)構(gòu)式為：

實施例7化合物6的鑒定

通過理化常數(shù)和波譜學(xué)手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜)對化合物6進行鑒定，結(jié)果為如下：

化合物6為白色無定形粉末，對Anisaldehyde(A試劑)反應(yīng)顯黃色，對Ehrlish(E試劑)顯粉紅色，酸水解檢出D-葡萄糖和L-鼠李糖，提示該化合物為呋甾皂苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+NH₄]⁺m/z 1228.6338(calcd.for C₅₇H₉₈NO₂₇ 1228.6326)，提示其分子量為1210，結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C₅₇H₉₄O₂₇。

在¹H-NMR譜中，高場區(qū)給出六個特征的甲基信號，包括甾體皂苷元上四個特征的甲基信號，分別位于δ0.98(3H,d,J＝6.6Hz)、1.31(3H,d,J＝6.7Hz)、0.89(3H,s)和1.04(3H,s)，以及兩個鼠李糖上甲基的特征信號，分別位于δ1.62(3H,d,J＝6.2Hz)和1.76(3H,d,J＝6.2Hz)，提示分子中含有兩分子鼠李糖殘基。由于27位甲基的化學(xué)位移(δ0.98)小于1.00ppm且26位兩個質(zhì)子的化學(xué)位移之差(0.46ppm)小于0.48ppm，說明該化合物為25R呋甾皂苷。

在¹³C-NMR譜中，δ111.0為呋甾皂苷C-22特征信號，δ141.1和122.2為一對雙鍵碳信號，δ100.6、102.3、103.2、105.1和105.8為糖端基碳信號，提示該化合物為五糖呋甾皂苷。該化合物苷元部分碳譜數(shù)據(jù)與已知化合物

(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-5(6)-en-3β,22α,26-triol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside苷元部分的碳譜數(shù)據(jù)基本一致，可以確定該化合物的苷元為(25R)-furost-5(6)-en-3β,22α,26-triol。通過¹H-NMR、¹³C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜并結(jié)合文獻可以對該化合物的碳及氫信號進行全面歸屬。綜合以上信息，化合物6鑒定為

(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-5(6)-en-3β,22α,26-triol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside?；衔?的¹H和¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表2，結(jié)構(gòu)式為：

實施例8化合物7的鑒定

通過理化常數(shù)和波譜學(xué)手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜)對化合物7進行鑒定，結(jié)果為如下：

化合物7為白色無定形粉末，對Anisaldehyde(A試劑)反應(yīng)顯黃色，對Ehrlish(E試劑)顯粉紅色，酸水解檢出D-葡萄糖和D-半乳糖，提示該化合物為呋甾皂苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+NH₄]⁺m/z 1424.6948(calcd.for C₆₃H₁₁₀NO₃₄ 1424.6909)，提示其分子量為1406，結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C₆₃H₁₀₆O₃₄。

在¹H-NMR譜中，高場區(qū)給出甾體皂苷元上四個特征的甲基信號，其中兩個角甲基為單峰，位于δ0.86(3H,s,Me-18)和0.61(3H,s,Me-19)，另外兩個為雙峰，位于δ1.33(3H,d,J＝6.8Hz,Me-21)和0.97(3H,d,J＝6.6Hz,Me-27)。在糖端基氫信號區(qū)給出六個糖端基氫信號δ4.74(1H,d,J＝7.8Hz)、4.89(1H,d,J＝7.6Hz)、5.11(1H,d,J＝7.8Hz)、5.16(1H,d,J＝7.8Hz)、5.31(1H,d,J＝8.0Hz)和5.58(1H,d,J＝7.8Hz)，結(jié)合這些糖端基氫信號的J值與酸水解分析結(jié)果，說明分子中的D-葡萄糖和D-半乳糖均為β構(gòu)型。另外，由于27位甲基的化學(xué)位移小于1.00ppm且26位兩個質(zhì)子的化學(xué)位移之差(0.46ppm)小于0.48ppm，說明該化合物為25R呋甾皂苷。

¹³C-NMR中,δ111.0為呋甾皂苷C-22特征信號，δ102.7、104.8、105.1、105.2、105.4和105.8為糖端基碳信號，提示該化合物為六糖呋甾皂苷。該化合物苷元部分碳譜數(shù)據(jù)與已知化合物(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-5α-furost-3β,22α,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside基本一致，可以確定該化合物的苷元為(25R)-5α-furost-3β,22α,26-triol。對比它們糖鏈部分的碳譜數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，該化合物3-O-Gal-(4-1)-Glc的C-6向低場位移至70.4ppm，同時多出六個屬于葡萄糖的碳信號(δ105.8、75.5、78.8、71.9、77.5、62.6),推測多出的葡萄糖連接在該葡萄糖的6位。在HMBC譜中，多出的糖端基質(zhì)子信號δ5.11(1H,d,J＝7.8Hz)與內(nèi)側(cè)葡萄糖的C-6(δ70.4)相關(guān)，進一步證明了上述推測的正確性。葡萄糖端基質(zhì)子信號δ5.58(1H,d,J＝7.8Hz)與內(nèi)側(cè)葡萄糖的C-2(δ81.8)相關(guān)，另一葡萄糖端基質(zhì)子δ5.31(1H,d,J＝8.0Hz)與內(nèi)側(cè)葡萄糖的C-3(δ88.8)相關(guān)，從而確定內(nèi)側(cè)葡萄的C-2、C-3、C-6均連接有葡萄糖。此外，內(nèi)側(cè)葡萄糖的端基質(zhì)子信號δ5.16(1H,d,J＝7.8Hz)與半乳糖的C-4(δ80.5)相關(guān)，半乳糖的端基質(zhì)子信號δ4.89(1H,d,J＝7.6Hz)與苷元C-3(δ77.7)相關(guān)，從而確定該化合物3位的糖鏈為D-Glc-(1→6)-[D-Glc-(1→3)]-[D-Glc-(1→2)]-D-Glc-(1→4)-D-Gal。經(jīng)查證，該糖鏈為一未見報道的新糖鏈。結(jié)合TOCSY譜，可以進一步驗證糖殘基的信號歸屬。綜合以上信息，化合物7鑒定為

(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-5α-furost-3β,22α,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside?；衔?的¹H和¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表3，結(jié)構(gòu)式為：

實施例9化合物8的鑒定

通過理化常數(shù)和波譜學(xué)手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜)對化合物8進行鑒定，結(jié)果為如下：

化合物8為白色無定形粉末，對Anisaldehyde(A試劑)反應(yīng)顯黃色，對Ehrlish(E試劑)顯粉紅色，酸水解檢出D-葡萄糖、D-木糖和D-半乳糖，提示該化合物為呋甾皂苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+NH₄]⁺m/z 1394.6846(calcd.for C₆₂H₁₀₈NO₃₃ 1394.6804)，提示其分子量為1376，結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C₆₂H₁₀₄O₃₃。

在¹H-NMR譜中，高場區(qū)給出甾體皂苷元上四個特征的甲基信號，其中兩個角甲基為單峰，位于δ0.88(3H,s,Me-18)和0.61(3H,s,Me-19)，另外兩個為雙峰，位于δ1.31(3H,d,J＝6.8Hz,Me-21)和1.05(3H,d,J＝6.4Hz,Me-27)。在糖端基氫信號區(qū)給出六個糖端基氫信號δ4.84(1H,d,J＝7.7Hz)、4.88(1H,d,J＝7.5Hz)、5.19(1H,d,J＝7.8Hz)、5.23(1H,d,J＝7.7Hz)、5.28(1H,d,J＝7.7Hz)和5.56(1H,d,J＝7.3Hz)，結(jié)合這些糖端基氫信號的J值與酸水解分析結(jié)果，說明分子中的D-葡萄糖、D-木糖和D-半乳糖均為β構(gòu)型。

¹³C-NMR中,δ110.9為呋甾皂苷C-22特征信號，δ102.7、103.4、105.1、105.2、105.4和106.8為糖端基碳信號，提示該化合物為六糖呋甾皂苷。該化合物苷元部分的碳譜數(shù)據(jù)與化合物7基本一致，提示該化合物的苷元為(25R)-5α-furost-3β,22α,26-triol。該化合物苷元C-3、C-26位的糖鏈部分的碳譜數(shù)據(jù)分別與已知化合物

(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-5α-furost-3β,22α,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside苷元C-3位和已知化合物26-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl nuatigenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside苷元C-26位的糖鏈部分的數(shù)據(jù)相一致，提示化合物8的C-3、C-26位的糖鏈分別為D-Glc-(1→2)-[D-Xyl-(1→3)]-D-Glc-(1→4)-D-Gal和D-Glc-(1→2)-D-Glc,其HMBC譜也證實了上述推測。綜合以上信息，化合物8鑒定為

(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-5α-furost-3β,22α,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside。化合物8的¹H和¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表3，結(jié)構(gòu)式為：

實施例10化合物9的鑒定

通過理化常數(shù)和波譜學(xué)手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY譜)對化合物9進行鑒定，結(jié)果為如下：

化合物9為白色無定形粉末，對Anisaldehyde(A試劑)反應(yīng)顯黃色，對Ehrlish(E試劑)顯粉紅色，酸水解檢出D-葡萄糖、D-木糖和D-半乳糖，提示該化合物為呋甾皂苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+NH₄]⁺m/z 1394.6815(calcd.for C₆₂H₁₀₈NO₃₃ 1394.6804)，提示其分子量為1376，結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C₆₂H₁₀₄O₃₃。

在¹H-NMR譜中，高場區(qū)給出甾體皂苷元上四個特征的甲基信號，其中兩個角甲基為單峰，位于δ0.86(3H,s,Me-18)和0.61(3H,s,Me-19)，另外兩個為雙峰，位于δ1.32(3H,d,J＝6.7Hz,Me-21)和0.96(3H,d,J＝6.7Hz,Me-27)。在糖端基氫信號區(qū)給出六個糖端基氫信號δ4.72(1H,d,J＝7.7Hz)、4.87(1H,d,J＝7.3Hz)、5.09(1H,overlapping)、5.18(1H,d,J＝7.8Hz)、5.22(1H,d,J＝7.8Hz)和5.55(1H,d,J＝7.2Hz)，結(jié)合這些糖端基氫信號的J值與酸水解分析結(jié)果，說明分子中的D-葡萄糖、D-木糖和D-半乳糖均為β構(gòu)型。另外，由于27位甲基的化學(xué)位移小于1.00ppm且26位兩個質(zhì)子的化學(xué)位移之差(0.46ppm)小于0.48ppm，說明該化合物為25R呋甾皂苷。

¹³C-NMR中,δ110.9為呋甾皂苷C-22特征信號，δ102.7、105.1、105.1、105.2、105.4和105.7為糖端基碳信號，提示該化合物為六糖呋甾皂苷。該化合物苷元部分碳譜數(shù)據(jù)與已知化合物(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-5α-furost-3β,22α,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside苷元部分的碳譜數(shù)據(jù)基本一致，可以確定該化合物的苷元為(25R)-5α-furost-3β,22α,26-triol。對比它們糖鏈部分的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，化合物9的3-O-Gal-(4-1)-Glc的C-6向低場位移至70.4ppm，同時多出六個屬于葡萄糖的碳信號(δ105.7、75.4、78.7、71.2、77.4、62.7),推測多出的葡萄糖連接在該葡萄糖的6位。在HMBC譜中，多出的糖端基質(zhì)子信號δ5.09與內(nèi)側(cè)葡萄糖的C-6(δ70.4)相關(guān)，進一步證明了上述推測的正確性。葡萄糖端基質(zhì)子信號δ5.55(1H,d,J＝7.2Hz)與內(nèi)側(cè)葡萄糖的C-2(δ81.6)相關(guān)，木糖端基質(zhì)子δ5.22(1H,d,J＝7.8Hz)與內(nèi)側(cè)葡萄糖的C-3(δ87.0)相關(guān)，從而確定內(nèi)側(cè)葡萄的C-2、C-3、C-6分別連接有葡萄糖、木糖和葡萄糖。此外，內(nèi)側(cè)葡萄糖的端基質(zhì)子信號δ5.18(1H,d,J＝7.8Hz)與半乳糖的C-4(δ80.2)相關(guān)，半乳糖的端基質(zhì)子信號δ4.87(1H,d,J＝7.3Hz)與苷元C-3(δ77.7)相關(guān)，從而確定該化合物3位的糖鏈為D-Glc-(1→6)-[D-Xyl-(1→3)]-[D-Glc-(1→2)]-D-Glc-(1→4)-D-Gal。經(jīng)查證，該糖鏈為一未見報道的新糖鏈。結(jié)合TOCSY譜，可以進一步驗證糖殘基的信號歸屬。綜合以上信息，化合物9鑒定為

(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-5α-furost-3β,22α,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside。化合物9的¹H和¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表3，結(jié)構(gòu)式為：

表1本發(fā)明化合物1-4的¹H-NMR和¹³C-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d₅)

表2：本發(fā)明化合物5和化合物6的¹H-NMR和¹³C-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d₅)

表3：本發(fā)明化合物7-9的¹H-NMR和¹³C-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d₅)

實施例11抗炎活性試驗

對本發(fā)明化合物進行體外抗炎活性試驗，采用LPS(脂多糖)誘導(dǎo)的RAW 264.7(小鼠巨噬細(xì)胞)細(xì)胞，建立體外炎癥模型。采用MTT和Griess實驗，考察本發(fā)明化合物對經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)后的RAW 264.7細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)NO的影響?？寡姿嶪ndomethacin(吲哚美辛)作為陽性對照。

(1)MTT實驗

RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入待測供試品，再培養(yǎng)24h后用MTT法測定樣品對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率。細(xì)胞增殖抑制率按下述公式計算，并用CalcuSyn軟件計算被測試樣品的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

細(xì)胞增殖抑制率＝(陰性對照組OD值平均值-樣品組OD值平均值)÷(陰性對照組OD值平均值-空白對照組OD值平均值)×100％。

(2)Griess實驗

RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入待測供試品，再培養(yǎng)24h后，吸取各孔培養(yǎng)液50μL，加入50μL Griess A試劑和50μL Griess B試劑混勻，用酶標(biāo)儀于546nm處測定OD值，按如下公式計算對NO產(chǎn)生的抑制率，并用CalcuSyn軟件計算被測試樣品的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

NO抑制率＝(模型對照組OD值平均值-樣品組OD值平均值)÷(模型對照組OD值平均值-陰性對照組OD值平均值)×100％。

實驗結(jié)果見表4。

同時采用IL-6和IL-1β試劑盒測定培養(yǎng)液中IL-6和IL-1β的含量，實驗結(jié)果見圖1.

表4本發(fā)明化合物對RAW 264.7細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)NO的抑制作用

從表4的實驗數(shù)據(jù)可知，化合物1-3、5、6、8、9具有較好體外抗炎活性，其中化合物1-3對炎癥介質(zhì)NO的抑制作用最為顯著，明顯優(yōu)于抗炎藥吲哚美辛的抑制效果。從圖1的實驗數(shù)據(jù)可知，化合物1,3,5在25μM時可以明顯抑制炎癥因子IL-6的產(chǎn)生，化合物1-5,9在25μM時可以顯著降低炎癥因子IL-1β的含量，上述結(jié)果表明這些化合物可以進一步作為新的抗炎藥物進行研究開發(fā)。

實施例12抗腫瘤活性試驗

本發(fā)明化合物對人體3個瘤株的體外抑瘤活性實驗，這3個瘤株包括HL-60(人急性髓性白血病細(xì)胞)，U937(人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞),HepG2(人肝癌細(xì)胞)三種人體腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性?？拱┧巆is-dichlorodiamineplatinum(II)(順鉑)作為陽性對照。

抑制腫瘤細(xì)胞增殖(MTT法)：將腫瘤細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后加入待測試樣品，再培養(yǎng)48h后用MTT法測定樣品對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率。細(xì)胞增殖抑制率按下述公式計算，并用CalcuSyn軟件計算被測試樣品的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

細(xì)胞增殖抑制率＝(陰性對照組OD值平均值-樣品組OD值平均值)÷(陰性對照組OD值平均值-空白對照組OD值平均值)×100％，實驗結(jié)果見圖2。

從圖2的實驗數(shù)據(jù)可知，化合物1-9在濃度為50μM時對HL-60、U937和HepG2三種不同的腫瘤細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，表明化合物1-9可以進一步作為新的抗腫瘤藥物進行研究開發(fā)。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實施方式不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。