本發(fā)明屬于藥物合成技術(shù)領(lǐng)域，涉及一組具有抗癌活性吡唑基甾體衍生物的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

一直以來癌癥是人類健康的最大威脅，雖然現(xiàn)在的預(yù)防及治療手段有所發(fā)展但是每年死于癌癥的病人仍在增加。現(xiàn)有藥物的治療方法已經(jīng)不能滿足病癥治療的需要，迫切需要篩選出新型的抗癌藥來應(yīng)對多變的病癥?；阽摅w類藥物的毒性低，利用率高，不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的甾體類藥物被開發(fā)出來。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一組具有抗癌活性吡唑基甾體衍生物的制備方法及應(yīng)用。

其具體技術(shù)方案為：

一組具有抗癌活性吡唑基甾體衍生物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

一種本發(fā)明所述具有抗癌活性吡唑基甾體衍生物的制備方法，包括以下步驟：

(1)將6.32g孕烯醇酮溶解于有150mL冰醋酸的250mL茄型燒瓶中，攪拌待完全溶解，然后分批加入苯肼，攪拌超聲至溶解，量取3.46mL三乙胺常溫下慢慢滴入反應(yīng)體系中，半小時(shí)后滴畢，常溫?cái)嚢?h待有固體析出，抽濾，并用冰醋酸洗滌，烘干得目標(biāo)化合物2和87.8g，此產(chǎn)物無需分離可直接用于下一步反應(yīng)；

(2)首先制備visemier試劑：取充分干燥的圓底燒瓶，向內(nèi)加入20mL干燥過的DMF溶液，攪拌下向內(nèi)慢慢滴加三氯氧磷溶液4.65mL，50mmol，半小時(shí)后滴畢，整個(gè)期間溫度需保持在0℃。混合液繼續(xù)攪拌反應(yīng)20min待用。將底物甾體苯腙10mmol溶解于30mL無水DMF中，0℃下，將此慢慢滴入所準(zhǔn)備的visemier試劑中，此過程需30min，滴畢后繼續(xù)攪拌24h，檢測反應(yīng)至完全。此時(shí)將反應(yīng)體系倒入飽和的碳酸氫鈉溶液中，攪拌至有固體析出，抽濾得到目標(biāo)產(chǎn)物的粗品然后溶解于二氯甲烷中萃取三次，所得有機(jī)相合并干燥，過濾、柱分，石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1，得到目標(biāo)化合物3和9純品3g；

(3)取吡唑基孕烯醇5mmol，溶于20mL四氫呋喃和20mL甲醇的混合溶液中，然后加入碳酸鉀5.5mmol，759mg，超聲攪拌至完全溶解，加熱回流2h，檢測反應(yīng)至完全，進(jìn)而用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，利用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，柱分得到目標(biāo)化合物4和10 4.8mmol；

(4)取去甲?；倪吝蚧邢┐?.5mmol溶于10mL四氫呋喃和10mL甲醇的混合溶液中，然后分批加入硼氫化鈉38mg，1mmol，室溫反應(yīng)1h后，檢測反應(yīng)完畢用冰醋酸淬滅，然后用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)，相柱分，石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1，得目標(biāo)產(chǎn)物60.48mmol；

(5)取25mL的干燥圓底燒瓶，將1mmol去甲?；倪吝蚧邢┐既苡诔?，2-二氯乙烷15mL中，攪拌下加入苯胺衍生物1.1mmol，而后分批加入三乙酰基硼氫化鈉， 常溫?cái)嚢?h，檢測反應(yīng)，待反應(yīng)完全后加入飽和的碳酸氫鈉溶液淬滅，然后用二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相，柱分，二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，得到胺化還原產(chǎn)物5a-e和11a-e 0.75mmol。

本發(fā)明所述具有抗癌活性吡唑基甾體衍生物在制備治療人肺腺癌、子宮頸癌、人乳腺癌藥物過程中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1本發(fā)明的三種吡唑基甾體衍生物是全新的化合物，其制備方法也是在合成此類化合物中首次成功應(yīng)用。

2本發(fā)明的三種衍生物對三種腫瘤細(xì)胞(A549(人肺腺癌細(xì)胞)、Hela(子宮頸癌細(xì)胞系)、MCF7(人乳腺癌細(xì)胞))以及293T細(xì)胞的增殖都具有良好的抑制活性，其IG₅₀介于0.53uM-7.51uM之間。

3本發(fā)明的路線新穎而且產(chǎn)率高易于分離是制備此類化合物的最優(yōu)路線。

附圖說明

圖1是吡唑基甾體衍生物的制備路線a，其中，(a)Phenylhydrazine，AcOH，rt；(b)POCl₃，DMF，0℃；(c)K₂CO₃，THF/H₂O，rt；(d)R-NH₂，DCE，NaBH(AcO)₃，rt；(e)MeOH/THF，NaBH₄，rt；

圖2是吡唑基甾體衍生物的制備路線b，其中，(f)Phenylhydrazine，AcOH，rt；(g)POCl₃，DMF，0℃～40℃；(h)K₂CO₃，THF/H₂O，rt；(i)R-NH₂，DCE，NaBH(AcO)₃，rt。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

先將異孕烯醇酮1，5，16-雙烯孕酮與苯肼乙酸的催化下生成苯腙2和8，然后在三氯氧 磷的催化下發(fā)生關(guān)環(huán)反應(yīng)得到具有吡唑環(huán)的化合物3和9，然后水解得到去甲?；幕衔?和10，在硼氫化鈉的還原下到6。中間產(chǎn)物4和10在三乙酰氧基硼氫化鈉的催化下和胺類發(fā)生胺化還原反應(yīng)得到5a-e和11a-e，5a-e和11a-e具體見表1。

表1

實(shí)施例1

化學(xué)合成制備式(I)的吡唑基甾體衍生物

(1)將6.32g(20mmol)孕烯醇酮溶解于有150mL冰醋酸的250mL茄型燒瓶中，攪拌待完全溶解，然后分批加入苯肼(22mmol)，攪拌超聲至溶解，量取3.46mL(25mmol)三乙胺常溫下慢慢滴入反應(yīng)體系中，半小時(shí)后滴畢，常溫?cái)嚢?h待有固體析出，抽濾，并 用冰醋酸洗滌，烘干得目標(biāo)化合物2和8約7.8g，此產(chǎn)物無需分離可直接用于下一步反應(yīng)。

(2)首先制備visemier試劑：取充分干燥的圓底燒瓶，向內(nèi)加入20mL干燥過的DMF溶液，攪拌下向內(nèi)慢慢滴加三氯氧磷溶液(4.65mL，50mmol)，半小時(shí)后滴畢，整個(gè)期間溫度需保持在0℃?；旌弦豪^續(xù)攪拌反應(yīng)20min待用。將底物甾體苯腙(10mmol)溶解于30mL無水DMF中，0℃下，將此慢慢滴入所準(zhǔn)備的visemier試劑中，此過程需30min，滴畢后繼續(xù)攪拌24h，檢測反應(yīng)至完全。此時(shí)將反應(yīng)體系倒入飽和的碳酸氫鈉溶液中，攪拌至有固體析出，抽濾得到目標(biāo)產(chǎn)物的粗品然后溶解于二氯甲烷中萃取三次，所得有機(jī)相合并干燥，過濾、柱分(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)得到目標(biāo)化合物3和9純品約3g。

(3)取吡唑基孕烯醇5mmol，溶于20mL四氫呋喃和20mL甲醇的混合溶液中，然后加入碳酸鉀(5.5mmol，759mg)，超聲攪拌至完全溶解。加熱回流2h，檢測反應(yīng)至完全，進(jìn)而用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，利用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，柱分得到目標(biāo)化合物4和10約4.8mmol。

(4)取去甲?；倪吝蚧邢┐?.5mmol溶于10mL四氫呋喃和10mL甲醇的混合溶液中，然后分批加入硼氫化鈉(38mg，1mmol)，室溫反應(yīng)1h后，檢測反應(yīng)完畢用冰醋酸淬滅，然后用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)，相柱分(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得目標(biāo)產(chǎn)物6約0.48mmol。

(5)取25mL的干燥圓底燒瓶，將1mmol去甲?；倪吝蚧邢┐既苡诔?，2-二氯乙烷15mL中，攪拌下加入苯胺衍生物1.1mmol，而后分批加入三乙?；饸浠c，常溫?cái)嚢?h，檢測反應(yīng)，待反應(yīng)完全后加入飽和的碳酸氫鈉溶液淬滅，然后用二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相，柱分(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)得到胺化還原產(chǎn)物5a-e和11a-e約0.75mmol。

實(shí)施例2

化合的結(jié)構(gòu)鑒定，所合成的三個(gè)化合物其結(jié)構(gòu)通過¹H-NMR、¹³C-NMR、高分辨質(zhì)譜(HRMS)確認(rèn)。

¹H-NMR、¹³C-NMR以及HRMS數(shù)據(jù)如下：

17β-(1-phenyl-4-((methylamino)methyl)-3-pyrazolyl)androst-3β-ol(5a)

5a，white solid，Yield：88％，mp 204-206℃；¹H-NMR(CDCl₃&CD₃OD，500MHz)：δ(ppm)8.09(s，1H)，7.67(d，2H，J＝8.5Hz)，7.43(t，2H，J＝7.0Hz)，7.26(t，1H，J＝7.5Hz)，3.90-3.80(m，2H)，3.58-3.53(m，1H)，2.74(t，1H，J＝9.5Hz)，2.53(s，3H，CH₃)，2.47-2.40(m，1H)，2.01-1.93(m，1H)，1.78-1.70(m，4H)，1.56-1.54(m，3H)，1.40-1.10(m，12H)，1.00-0.93(m，2H)，0.81(s，3H，CH₃)，0.73-0.67(m，1H)，0.64(s，3H，CH₃)；¹³C-NMR(CDCl₃&CD₃OD，125MHz)：δ(ppm)152.48，140.02，129.29，129.29，127.45，126.18，118.91，118.91，115.61，70.81，56.33，54.53，48.39，44.91，44.79，44.33，38.56，37.74，37.02，35.99，35.53，33.17，32.07，31.04，28.65，26.66，24.43，21.07(CH₃)，13.33(CH₃)，12.22(CH₃)；HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₀H₄₄N₃O⁺(M+H)⁺462.34789，found 462.34738.

17β-(1-phenyl-4-((ethylamino)methyl)-3-pyrazolyl)androst-3β-ol(5b)

5b，white solid，Yield：80％，mp 246-248℃；¹H-NMR(DMSO-d，500MHz)：δ(ppm)8.66(s，1H)，7.72-7.70(m，2H)，7.50(t，2H，J＝7.0，8.5Hz)，7.30(t，1H，J＝7.5Hz)，4.43(s，br，1H)，4.01-3.92(m，2H)，2.98(dq，2H，J＝2.0，7.5Hz)，2.92(t，1H，J＝9.5Hz)，2.40-2.33(m，1H)，1.96-1.91(m，1H)，1.70-1.60(m，4H)，1.53-1.41(m，3H)，1.37-1.06(m，12H)，1.24(t，3H，J＝7.5Hz)，0.96-0.88(m，2H)，0.74(s，3H，CH₃)，0.71-0.65(m，1H)，0.55(s，3H，CH₃)；¹³C-NMR(DMSO-d，125MHz)：δ(ppm)152.71，139.98，130.13，130.13，129.58，126.65，118.52，118.52，114.09，69.79，56.18，54.58，47.58，44.98，44.67，42.06，40.32，38.67，37.95，37.21，36.08，35.69，32.32，31.86，28.88，26.62，24.57，21.16，13.85(CH₃)，12.65(CH₃)，11.57(CH₃)；HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₁H₄₆N₃O⁺(M+H)⁺476.36354，found 476.36313.

17β-(1-phenyl-4-((propylamino)methyl)-3-pyrazolyl)androst-3β-ol(5c)

5c，light brown solid，Yield：76％，mp 160-162℃；¹H-NMR(DMSO-d，500MHz)：δ(ppm)8.28(s，1H)，7.74-7.73(m，2H)，7.45(t，2H，J＝7.5，8.0Hz)，7.30(t，1H，J＝7.5Hz)，3.90(s，br，1H)，3.63-3.61(m，2H)，3.38-3.32(m，1H)，2.81(t，1H，J＝10.0Hz)，2.56(t，2H，J＝7.5Hz)，2.37-2.30(m，1H)，1.68-1.58(m，4H)，1.55-1.32(m，5H)，1.28-1.04(m，10H)，0.94-0.90(m，2H)，0.87(t，3H，J＝7.5Hz)，0.74(s，3H，CH₃)，0.70-0.65(m，1H)，0.58(s，3H，CH₃)；¹³C-NMR(DMSO-d，125MHz)：δ(ppm)151.54，139.74，129.32，129.32，126.64，125.25，120.35，117.52，117.52，69.23，55.67，53.94，50.41，47.59，44.37，44.07，42.47，38.10，37.83，36.61，35.50，35.10，31.70，31.29，28.32，26.23，24.05，21.87，21.45，13.34(CH₃)，12.06(CH₃)，11.62(CH₃)；HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₂H₄₈N₃O⁺(M+H)⁺490.37919，found 490.37924.

17β-(1-phenyl-4-((isopropylamino)methyl)-3-pyrazolyl)androst-3β-ol(5d)

5d，white solid，Yield：83％，mp 216-218℃；¹H-NMR(CDCl₃&CD₃OD，500MHz)：δ(ppm)7.94(s，1H)，7.67-7.65(m，2H)，7.41(t，2H，J＝7.0，8.5Hz)，7.23(t，1H，J＝7.5Hz)，3.70(m，2H)，3.57-3.53(m，1H)，2.92-2.97(m，1H)，2.72(t，1H，J＝10.0Hz)，2.47-2.39(m，1H)，2.00-1.94(m，1H)，1.80-1.69(m，4H)，1.60-1.54(m，3H)，1.45-1.32(m，3H)，1.35-1.28(m，6H)，1.15(d，6H，J＝6.5Hz，2CH₃)，1.12-0.86(m，4H)，0.81(s，3H，CH₃)，0.74-0.69(m，1H)，0.66(s，3H，CH₃)；¹³C-NMR(CDCl₃&CD₃OD，125MHz)：δ(ppm)152.13，140.34，129.29，129.29，126.40，125.83，119.70，118.84，118.84，70.99，56.42，54.59，48.66，44.99，44.80，40.62，38.74，37.92，37.10，36.06，35.61，32.15，31.21，29.69，28.74，26.83，24.54，22.12(CH₃)，21.99(CH₃)，21.16，13.49(CH₃)，12.33(CH₃)；HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₂H₄₈N₃O⁺(M+H)⁺490.37919，found 490.37918.

17β-(1-phenyl-4-((butylamino)methyl)-3-pyrazolyl)androst-3β-ol(5e)

5e，white solid，Yield：83％，mp 138-140℃；¹H-NMR(DMSO-d&CDCl₃，500MHz)：δ(ppm)8.35(s，1H)，7.73(d，2H，J＝8.0Hz)，7.46(t，2H，J＝7.5，8.5Hz)，7.24(t，1H，J＝7.5Hz)，3.73(m，2H)，3.37-3.33(m，1H)，2.84(t，1H，J＝9.5Hz)，2.70(t，2H，J＝7.5Hz)，2.38-2.32(m，1H)，1.69-1.62(m，4H)，1.51-1.47(m，4H)，1.34-1.11(m，12H)，1.08-0.88(m，6H)，0.88(t，3H，J＝7.5Hz)，0.75(s，3H，CH₃)，0.70-0.66(m，1H)，0.58(s，3H，CH₃)；¹³C-NMR(DMSO-d&CDCl₃，125MHz)：δ(ppm)151.78，139.71，129.40，129.40，127.30，125.52，118.38，117.72，117.72，69.30，55.74，54.04，47.71，47.48，44.45，44.14，41.98，38.13，37.77，36.69，35.56，35.16，31.77，31.32，29.94，28.38，26.24，24.08，21.17，20.65，13.73(CH₃)，13.36(CH₃)，12.12(CH₃)；HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₃H₅₀N₃O⁺(M+H)⁺504.39484，found 504.39404.

17β-(1-phenyl-4-((methylamino)methyl)-3-pyrazolyl)androst-5，16-dienes-3β-ol(11a)

11a，white solid，Yield：80％，mp 108-110℃；¹H-NMR(CDCl₃&CD₃OD，500MHz)：δ(ppm)8.23(s，1H)，7.74-7.72(m，2H)，7.45(t，2H，J＝7.5Hz，8.5Hz)，7.28(t，1H，J＝7.5Hz)，5.93-5.92(m，1H)，5.40-5.39(m，1H)，4.00(m，2H)，3.52-3.46(m，1H)，3.36(s，1H)，2.58(s，3H)，2.41-2.25(m，4H)，2.17-2.06(m，1H)，1.88-1.75(m，3H)，1.72-1.64(m，2H)，1.58-1.26(m，5H)，1.15-0.87(m，9H)，1.15(s，3H，CH₃)，1.08(s，3H，CH₃)；¹³C-NMR(CDCl₃&CD₃OD，125MHz)：δ(ppm)148.34，147.13，141.57，139.99，129.87，129.59，129.59，127.72，126.56，121.39，118.72，118.72，114.74，71.49，57.02，50.88，48.56，43.84，42.12，37.41，36.96，35.47，33.04，32.59，31.82，31.41，30.67，21.15(CH₃)，19.43(CH₃)，16.35(CH₃)；HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₀H₄₀N₃O⁺(M+H)⁺458.31659，found 458.31656.

17β-(1-phenyl-4-((ethylamino)methyl)-3-pyrazolyl)androst-5，16-dienes-3β-ol(11b)

11b，white solid，Yield：79％，mp 106-108℃；¹H-NMR(CDCl₃&CD₃OD，500MHz)：δ(ppm)7.86(s，1H)，7.62-7.60(m，2H)，7.36-7.32(m，2H)，7.16(t，1H，J＝7.5Hz)，5.84(s，1H)，5.30(s，1H)，3.73-3.67(m，3H)，3.42-3.38(m，1H)，2.67-2.62(m，2H)，2.43-2.40(m，2H)，2.27-2.14(m，3H)，2.05-1.97(m，2H)，1.79-1.67(m，3H)，1.63-1.58(m，3H)，1.47-1.34(m，3H)，1.12-0.80(m，11H)，1.07(t，3H，CH₃，，J＝7.5Hz)，1.04(s，3H，CH₃)，1.00(s，3H，CH₃)； ¹³C-NMR(CDCl₃&CD₃OD，125MHz)：δ(ppm)147.78，147.67，141.51，140.22，129.43，129.43，128.95，126.11，125.97，121.38，120.18，118.46，118.46，71.43，56.95，50.84，48.40，43.86，43.51，42.09，37.36，36.90，35.59，32.45，31.79，31.37，30.63，21.14，19.38(CH₃)，16.29(CH₃)，14.56(CH₃)；HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₁H₄₂N₃O⁺(M+H)⁺472.33224，found 472.33211.

177-(1-phenyl-4-((propylamino)methyl)-3-pyrazolyl)androst-5，16-diennes-3β-ol(11c)

11c，white solid，Yield：62％，mp 130-132℃；¹H-NMR(CDCl₃&CD₃OD，500MHz)：δ(ppm)8.06(s，1H)，7.72-7.70(m，2H)，7.43(t，2H，J＝7.5Hz，8.5Hz)，7.25(t，1H，J＝7.5Hz)，5.93-5.92(m，1H)，5.39(d，1H，J＝5.0Hz)，3.90-3.83(m，2H)，3.52-3.47(m，2H)，2.69(t，2H，J＝7.5Hz)，2.48-2.46(m，1H)，2.34-2.22(m，3H)，2.15-2.06(m，2H)，1.87-1.75(m，3H)，1.68-1.40(m，9H)，1.14-1.04(m，8H)，1.14(s，3H，CH₃)，1.08(s，3H，CH₃)，0.95(t，3H，J＝7.5Hz)； ¹³C-NMR(CDCl₃&CD₃OD，125MHz)：δ(ppm)147.96，147.51，141.51，140.13，129.46，129.46，129.23，127.70，126.12，121.39，118.53，118.53，118.33，71.49，56.98，50.84，50.47，48.43，43.35，42.14，37.35，36.90，35.53，32.49，31.79，31.43，30.62，21.92，21.12，19.41(CH₃)，16.33(CH₃)，11.59(CH₃)；HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₂H₄₄N₃O⁺(M+H)⁺486.34789，found 486.34793.

17β-(1-phenyl-4-((isopropylamino)methyl)-3-pyrazolyl)androst-5，16-dienes-3β-ol(11d)

77d，white solid，Yield：73％，mp 202-204℃；¹H-NMR(CDCl₃&CD₃OD，500MHz)：δ(ppm)8.57(s，1H)，7.76-7.74(m，2H)，7.43(t，2H，J＝7.5Hz，8.5Hz)，7.27(t，1H，J＝7.5Hz)，5.89-5.88(m，1H)，5.39(d，1H，J＝5.0Hz)，4.13-4.06(m，2H)，3.52-3.46(m，1H)，3.36(s，1H)，3.27-3.22(m，1H)，2.36-2.25(m，4H)，2.17-2.05(m，2H)，1.86-1.75(m，3H)，1.71-1.62(m，3H)，1.56-1.49(m，3H)，1.37(d，3H，J＝6.5Hz)，1.34(d，3H，J＝6.5Hz)，1.15-1.03(m，8H)，1.15(s，3H，CH₃)，1.07(s，3H，CH₃)；¹³C-NMR(CDCl₃&CD₃OD，125MHz)：δ(ppm)147.96，146.53，141.06，139.38，129.72，129.07，129.07，128.19，126.14，120.87，118.30，118.30，112.51，71.04，56.64，50.36，48.60，48.05，41.67，38.41，36.90，36.45，34.82，32.10，31.31，30.96，30.15，20.60，19.25，18.96(CH₃)，18.83(CH₃)，15.91(CH₃)；HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₂H₄₄N₃O⁺(M+H)⁺486.34789，found 486.34750.

177-(1-phenyl-4-((butylamino)methyl)-3-pyrazolyl)androst-5，16-dienes-3β-ol(11e)

11e，glasslike solid，Yield：89％，mp 100-102℃；¹H-NMR(CDCl₃&CD₃OD，500MHz)：δ(ppm)7.95(s，1H)，7.71-7.69(m，2H)，7.43(t，2H，J＝7.5Hz，8.5Hz)，7.24(t，1H，J＝7.5Hz)，5.93-5.94(m，1H)，5.40(d，1H，J＝5.0Hz)，3.82-3.74(m，2H)，3.50-3.48(m，1H)，3.37(s，1H)，2.67(t，2H，7.5Hz)，2.51-2.49(m，1H)，2.35-2.26(m，3H)，2.14-2.07(m，2H)，1.89-1.80(m，3H)，1.72-1.67(m，3H)，1.52-1.26(m，8H)，1.15-1.05(m，8H)，1.14(s，3H，CH₃)，1.05(s，3H，CH₃)，0.94(t，3H，J＝7.5Hz)；¹³C-NMR(CDCl₃&CD₃OD，125MHz)：δ(ppm)147.82，147.70，141.50，140.23，129.44，129.44，128.96，126.19，125.97，121.41，120.11，118.48，118.48，71.49，56.97，50.85，49.07，48.40，44.08，42.11，37.35，36.90，35.59，32.46，31.80，31.60，31.40，30.63，21.14，20.52，19.40(CH₃)，16.32(CH₃)，13.95(CH₃)；HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₃H₄₆N₃O⁺(M+H)⁺500.36354，found 500.36353.

實(shí)施例3

本發(fā)明式(I)的吡唑基甾體衍生物的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性

采用RSB法測定本發(fā)明式(I)的吡唑基甾體衍生物對A549(人肺腺癌細(xì)胞)、Hela(子宮頸癌細(xì)胞系)、MCF7(人肝癌細(xì)胞)、293T細(xì)胞系四種細(xì)胞的增殖抑制活性。

具體方法：準(zhǔn)確稱量待測化合物1-3mg，以DMSO為溶劑，配制成濃度為10mMol/L的溶液，室溫下靜置半小時(shí)待樣品完全溶解后保存待用。取處于對數(shù)生長期的A549、Hela、293T、MCF7細(xì)胞，清洗并用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)并稀釋至適當(dāng)濃度，將細(xì)胞懸液均勻的加入96孔板中，每孔100ul，每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置陰性對照和陽性對照孔。取一定量的事先配置好的待測化合物加入到96孔板中，化合物從50uM起，3倍梯度稀釋，共9個(gè)梯度，然后將處理好的細(xì)胞置于5％二氧化碳濃度，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)時(shí)間過后，終止培養(yǎng)，移去上清液，每個(gè)孔加入冷的10％TCA100ul，4℃條件下固定2h，用二次蒸餾水反復(fù)沖洗5次，50℃烘箱中烘干約半小時(shí)。待其干燥后，加入冰醋酸配制的SRB溶液100ul，室溫染色半小時(shí)后用1％冰醋酸沖洗5次以除去非特異性結(jié)合的染料，此步需要操作迅速以防止已經(jīng)與蛋白特異性結(jié)合的染料分解。50℃烘箱烘干半小時(shí)，加150ul Tris溶液溶解拍打混勻，酶標(biāo)儀A540nm測定吸光度，計(jì)算其抑制率，用EXCEl計(jì)算其IC₅₀，結(jié)果見表2。

表2部分化合物抗細(xì)胞增殖活性IC₅₀(μmol/L)

表2的結(jié)果說明吡唑基甾體衍生物對A549(人肺腺癌細(xì)胞)、Hela(子宮頸癌細(xì)胞系)、MCF7(人乳腺癌細(xì)胞)、293T細(xì)胞四種腫瘤細(xì)胞有很好的細(xì)胞毒性。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。