本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工，具體地講，對(duì)尼麥角林堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造所得到的衍生物的制備方法，及這類衍生物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著全球經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，工作、生活競(jìng)爭(zhēng)的加劇和外部環(huán)境壓力的加大，在人格因素、社會(huì)心理及慢性疾病等諸多亞健康因素的影響下，抑郁癥及精神與抑郁混合型疾病的發(fā)生和發(fā)展呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最新報(bào)告顯示，在全球已有超過3.5億人患有抑郁性疾病。而且治愈率與發(fā)病率的落差，導(dǎo)致了抑郁癥呈現(xiàn)出逐年增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。隨著抑郁癥群體的不斷擴(kuò)大，這一疾病已成為人類繼癌癥、卒中和慢性阻塞性肺病之后的第四大慢性疾病。
從天然來源的化合物中，麥角堿是作為5-羥色胺受體、多巴胺受體和腎上腺素受體的配體。麥角堿的四環(huán)結(jié)構(gòu)包含有單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺、多巴胺和去甲腎上腺素等的結(jié)構(gòu)特征，所以許多天然產(chǎn)生的和(半)合成的麥角堿在神經(jīng)傳遞的受體上顯示出激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑和抗激動(dòng)劑的活性。
天然產(chǎn)生的麥角生物堿的主要缺點(diǎn)是它們對(duì)每個(gè)單獨(dú)的5-HT受體亞型缺乏選擇性。有研究表明麥角林環(huán)中苯環(huán)上取代基的存在與否對(duì)麥角生物堿和多巴胺受體的相互作用有巨大的影響，空間位阻越大，親和力越低。苯環(huán)上引入具有較大位阻且代謝穩(wěn)定的基團(tuán)能有效地阻止麥角生物堿與多巴胺受體結(jié)合位點(diǎn)的接觸，故而增加對(duì)5-HT受體結(jié)合位點(diǎn)的親和力和選擇性。
研究發(fā)現(xiàn)，5-HT6受體僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要分布在紋狀體、伏核、嗅結(jié)節(jié)和大腦皮層，在杏仁核、下丘腦、小腦和海馬區(qū)也有分布。有證據(jù)顯示，5-HT6受體可調(diào)控部分神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，如乙酰膽堿、去甲腎上腺素、γ-氨基丁酸和多巴胺。5-HT6受體具有廣泛的生理學(xué)作用，有報(bào)道稱精神病、抑郁癥、肥胖、焦慮、認(rèn)知功能障礙、帕金森癥等均與5-HT6受體有關(guān)。部分安定藥物(氯氮平、奧氮平、喹硫平)和抗癡呆藥物(氯米帕明、阿米替林、多慮平)均為5-HT6受體的拮抗劑，但并無選擇性。嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，選擇性的5-HT6受體的激動(dòng)劑和拮抗劑均可增強(qiáng)其認(rèn)知功能，這可能會(huì)顯著改善選擇性血清素再攝取抑制劑的臨床效果。雖然目前已研制出許多選擇性5-HT6受體拮抗劑，但選擇性5-HT6受體激動(dòng)劑仍較少。
麥角生物作為高活性的藥物，具有很好的開發(fā)價(jià)值。且有研究表明，高度選擇性的單靶點(diǎn)藥物不能有效的調(diào)節(jié)復(fù)雜的人體系統(tǒng)。在抗精神病領(lǐng)域，選擇性多巴胺拮抗劑氟哌啶醇現(xiàn)已逐步被具有更廣泛受體親和性的非典型抗精神病藥物代替。研發(fā)適度調(diào)節(jié)多靶點(diǎn)具有更好療效和更少副作用的藥物已成為藥物化學(xué)的趨勢(shì)。由于麥角生物堿可與多受體作用，是設(shè)計(jì)與合成多靶點(diǎn)藥物的非常好的原料。尼麥角林N-1、N-6位甲基和C-10位甲氧基可顯著影響其對(duì)單胺受體的選擇性和親和力。其對(duì)α1腎上腺素能受體和血清素5-HT1A受體具有高親和力，對(duì)α2腎上腺素能受體和5-HT2受體具有中等親和力，對(duì)多巴胺D2、D1和毒蕈堿M1、M2受體幾乎無親和力。研究表明，正常劑量下服用尼麥角林是非常安全的，尚無報(bào)道表明尼麥角林會(huì)導(dǎo)致纖維化病變；且具有治療抑郁癥的潛的臨床應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明設(shè)計(jì)以10-甲氧基麥角醛或10-甲氧基麥角醇為關(guān)鍵中間體，以尼麥角林母體，對(duì)其C-8位側(cè)鏈進(jìn)行修飾。尼麥角林水解得10α-甲氧基-1-甲基-9，10-二氫麥角醇，后將其氧化成醛。合成路線如下所示。
關(guān)鍵中間體合成路線
本發(fā)明建立了適合10α-甲氧基-1-甲基-9，10-二氫麥角醇的溫和高效的氧化方法，即通過Swern氧化將麥角醇氧化成醛。然后通過對(duì)醇或醛的衍生化得到式I結(jié)構(gòu)的新化合物，最后對(duì)所得的式I結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行活性篩選。
本發(fā)明的目的是提供一類新的具有選擇性5-HT6激動(dòng)劑活性的麥角堿類衍生物及其制備方法。建立適合10α-甲氧基-1-甲基-9，10-二氫麥角醇的溫和高效的氧化方法，然后通過對(duì)醇或醛的衍生化得到式I結(jié)構(gòu)的化合物，并對(duì)式I結(jié)構(gòu)的新化合物進(jìn)行活性篩選，指出其在疾病的預(yù)防或治療上的用途。具有顯著的市場(chǎng)和社會(huì)價(jià)值。
附圖說明
圖1為(二、化合物活性測(cè)定：1.4拮抗劑制備)拮抗劑濃度連續(xù)稀釋示意圖
具體實(shí)施方式
本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。
一：化合物的制備
實(shí)施例1：麥角醇和醛的制備
1、10α-甲氧基-1-甲基-9，10-二氫麥角醇
取尼麥角林(1g，2.06mmol)置于反應(yīng)瓶中，加入30mL的12％氫氧化鉀的甲醇和水的溶液(KOH 3.6g，甲醇15mL，水15mL)，72℃加熱回流反應(yīng)0.5h，TLC[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶16，，Van Urk試劑顯色]監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。二氯甲烷萃取(10mL×3)，水洗(10mL×3)，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得白色固體，后丙酮結(jié)晶得白色粉末565mg。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.24～7.17(m，2H，H-14，H-13)，7.07～7.05(d，J＝6.8Hz，1H，H-12)，6.79(s，1H，H-2)，3.77(s，3H，N-1-CH3)，3.68～3.58(m，2H，H-17)，3.21～3.14(m，2H，H-4a，H-7a)，3.05～3.01(m，2H，H-4b，H-9a)，2.98(s，3H，OCH3)，2.97～2.96(m，1H，H-8)，2.45(s，3H，N-6-CH3)，2.32～2.28(m，1H，H-5)，1.98～1.93(t，1H，H-7b)，1.28～1.21(t，1H，H-9b)；13C NMR(CDCl3，100MHz)δ：135.2，130 3，126.5，123.3，121.5，115.1，110.6，108.9，73.8，70.4，66.5，60.8，49.6，44.1，34.6，32.9，30.3，22.5；ESI-MS m/z：301.37[M+H]+。
2、10α-甲氧基-1-甲基-9，10-二氫麥角醛
取干燥的反應(yīng)瓶，密封后反復(fù)抽真空充氮?dú)馊危糜?78℃恒溫浴槽中。加入無水二氯甲烷(1mL)和無水二甲基亞砜(0.4mL，5.36mmol)，當(dāng)混合液溫度降到-78℃后緩慢滴加三氟乙酸酐(0.6mL，4.31mmol)的無水二氯甲烷(1mL)溶液，滴加完畢后此溫度下攪拌10min。后緩慢滴加10α-甲氧基-1-甲基-9，10-二氫麥角醇(282mg，0.94mmol)的無水二氯甲烷(2mL)和無水二甲基亞砜(1mL)溶液，滴加完畢后保持溫度攪拌30min。加入二異丙基乙胺(2mL，11.50mmol)，保溫?cái)嚢?0min后，緩慢升至室溫，避光反應(yīng)3h，TLC[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶10，Van Urk試劑顯色]監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。加入飽和食鹽水(40mL)稀釋反應(yīng)液，二氯甲烷萃取(20mL×3)，飽和食鹽水洗滌(20mL×3)，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得二氫麥角醛粗產(chǎn)物406mg，棕色油狀物。液-質(zhì)聯(lián)用分析ESI-MS m/z：299.2[M+H]+，317.3[M+NH4]+。
3、10α-甲氧基-8β-(1-羥基)乙基-1，6-二甲基麥角林
取干燥的反應(yīng)瓶，密封后反復(fù)抽真空充氮?dú)馊?，置?40℃恒溫浴槽中，加入二氫麥角醛粗產(chǎn)物(170mg，0.57mmol)的無水四氫呋喃(16mL)溶液。當(dāng)反應(yīng)液溫度降至-40℃后緩慢滴加3.0M甲基碘化鎂四氫呋喃溶液(0.57mL)，滴畢后保溫反應(yīng)30min，后移至室溫避光攪拌反應(yīng)4h。TLC[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶10，Van Urk試劑顯色]監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。冰浴下滴加飽和氯化銨至反應(yīng)液變澄清，二氯甲烷萃取(10mL×3)，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得棕色油狀物。層析分離[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶13]得棕黃色固體28mg。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.24～7.17(m，2H)，7.11～7.05(m，1H)，6.78(s，1H)，3.77(s，3H)，3.74～3.72(m，1H)，3.29～3.16(m，2H)，3.04～3.02(m，2H)，2.98(s，3H)，2.48(s，3H)，2.34～2.30(m，1H)，2.07～2.03(m，1H)，1.38～1.25(m，5H)；HR-ESI-MS m/z：315.2072[M+H]+。
實(shí)施例2：麥角醛的醚類衍生化
1、10α-甲氧基-8β-(二乙氧基)甲基-1，6-二甲基麥角林(衍生物1)
取二氫麥角醛粗產(chǎn)物(120mg，0.40mmol)和乙醇(5mL)置于反應(yīng)瓶中，室溫?cái)嚢?，緩慢滴?mol/L的硫酸乙醇溶液(3.36mL)，TLC[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶8，Van Urk試劑顯色]監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，2h后反應(yīng)完全。冰浴下加飽和碳酸氫鈉溶液(20mL)稀釋反應(yīng)液，二氯甲烷萃取(10mL×3)，飽和食鹽水洗滌(10mL×3)，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得黃色油狀物，層析分離[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶13]得淡黃色油狀物42mg。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.23～7.17(m，2H，H-14，H-13)，7.10～7.08(d，J＝6.8Hz，1H，H-12)，6.78(s，1H，H-2)，4.32～4.30(d，J＝6.8Hz，1H，H-17)，3.77(s，3H，N-1-CH3)，3.75～3.69(m，2H，OCH2CH3)，3.61～3.54(m，2H，OCH2CH3)，3.20～3.15(m，1H，H-4a)，3.08～3.00(m，4H，H-7a，H-4b，H-9a，H-8)，2.98(s，3H，OCH3)，2.45(s，3H，N-6-CH3)，2.30～2.26(m，1H，H-5)，2.04～1.98(t，1H，H-7b)，1.31～1.27(t，1H，H-9b)，1.25～1.21(t，6H，OCH2CH3)；HR-ESI-MS m/z：373.2491[M+H]+。
2、10α-甲氧基-8β-([1，3]二硫戊環(huán))甲基-1，6-二甲基麥角林(衍生物2)
取二氫麥角醛粗產(chǎn)物(120mg，0.40mmol)和乙硫醇(5mL)置于反應(yīng)瓶中，室溫?cái)嚢?，滴加濃硫?滴，TLC[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶8，Van Urk試劑顯色]監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，至反應(yīng)完全。冰浴下加飽和碳酸氫鈉溶液(20mL)稀釋反應(yīng)液，二氯甲烷萃取(10mL×3)，飽和食鹽水洗滌(10mL×3)，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得黃色油狀物，層析分離[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶13]得淡黃色油狀物42.2mg。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.23～7.17(m，2H)，7.10～7.08(d，1H)，6.78(s，1H)，3.82(s，3H)，3.66(m，1H)，3.31(m，1H)，3.00～2.82(m，4H)，2.98(s，3H)，2.52～2.44(m，2H)，2.20(m，2H)，2.28(s，3H)，2.04～1.88(m，3H)；ESI-MS m/z：375.16[M+H]+。
實(shí)施例3：麥角醛的胺類衍生化
1、10α-甲氧基-8β-(異丙基氨基)甲基-1，6-二甲基麥角林(衍生物3)
二氫麥角醛粗產(chǎn)物(122mg，0.41mmol)、異丙胺(80μL，0.92mmol)和四氫呋喃(10mL)置于反應(yīng)瓶中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20min，冰浴下分批加入醋酸硼氫化鈉(125mg，0.60mmol)，升至室溫反應(yīng)4h，TLC[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶8，Van Urk試劑顯色]監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。加入飽和碳酸氫鈉溶液(15mL)淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取(10mL×3)，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得棕黃色油狀物。層析分離[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶10]得淡黃色油狀物45mg。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.23～7.17(m，2H)，7.08～7.06(d，1H)，6.78(s，1H)，3.77(s，3H)，3.20～3.12(m，2H)，3.04～3.00(m，2H)，2.98(s，3H)，2.90～2.83(m，1H)，2.61～2.54(m，2H)，2.44(s，3H)，2.31～2.27(m，1H)，1.92～1.86(t，1H)，1.29～1.15(m，2H)，1.10～1.09(d，6H)；HR-ESI-MS m/z：342.2545[M+H]+。
2、10α-甲氧基-8β-(4-甲基哌嗪基)甲基-1，6-二甲基麥角林(衍生物4)
二氫麥角醛粗產(chǎn)物(122mg，0.45mmol)、N-甲基哌嗪(100μL，0.91mmol)和四氫呋喃(10mL)置于反應(yīng)瓶中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20min，后冰水浴下分批加入醋酸硼氫化鈉(122mg，0.59mmol)。加完醋酸硼氫化鈉后至室溫反應(yīng)4h，TLC[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶8，Van Urk試劑顯色]監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。加入飽和碳酸氫鈉溶液(15mL)淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取(15mL×3)，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得棕黃色油狀物。層析分離[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶10]得淡黃色油狀物50mg。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.27～7.20(m，2H)，7.00～6.96(d，1H)，6.72(s，1H)，3.67(s，3H)，3.30(m，1H)，3.14～3.00(m，2H)，2.99(s，3H)，2.87～2.74(m，1H)，2.65～2.56(m，2H)，2.50～2.34(tt，8H)，2.32～2.27(s，s，6H)，2.27～2.14(m，1H)，2.02～1.96(m，1H)，1.63～1.57(m，2H)；ESI-MS m/z：382.25[M+H]+。
3、10α-甲氧基-8β-(4-氟芐甲氨基)甲基-1，6-二甲基麥角林(衍生物5)
二氫麥角醛粗產(chǎn)物(126mg，0.43mmol)、4-氟芐胺(55μL，0.60mmol)和四氫呋喃(10mL)置于反應(yīng)瓶中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20min，后冰水浴下分批加入醋酸硼氫化鈉(130mg)。加完醋酸硼氫化鈉后至室溫反應(yīng)5h，TLC[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶8，Van Urk試劑顯色]監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。加入飽和碳酸氫鈉溶液(15mL)淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取(10mL×3)，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得油狀物，加入甲胺醇溶液10ml，冰浴下分批加入醋酸硼氫化鈉(120mg)至室溫反應(yīng)5h，TLC[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶8，Van Urk試劑顯色]監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。加入飽和碳酸氫鈉溶液(15mL)淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取(10mL×3)，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得棕色油狀物。層析分離[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶10]得黃色油狀物52mg。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.23～7.21(m，2H)，7.08～7.0(m，3H)，6.88～6.8(m，3H)，3.80(s，3H)，3.65(s，2H)，3.25～3.16(m，1H)，3.04～3.00(m，2H)，2.95(s，3H)，2.90～2.85(m，1H)，2.73～2.64(m，2H)，2.53(s，3H)，2.42(s，3H)，2.35～2.21(m，1H)，2.03～2.00(m，1H)，1.52～1.45(m，2H)；HR-ESI-MS m/z：422.2538[M+H]+。
實(shí)施例4：麥角醇的酯類衍生化
1、10α-甲氧基-1，6-二甲基麥角林-8β-間三氟甲基苯甲酸酯(衍生物6)
取3-三氟甲基苯甲酸(100mg，0.64mmol)、10α-甲氧基-1-甲基-9，10-二氫麥角醇(70mg，0.16mmol)和無水四氫呋喃(10mL)置于反應(yīng)瓶中，室溫?cái)嚢?，后加入二環(huán)己基碳二亞胺(36.1mg，0.18mmol)。TLC[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶16，Van Urk試劑顯色]監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，10h后停止反應(yīng)。反應(yīng)液冷至0℃，過濾，35℃下減壓濃縮蒸干濾液，二氯甲烷(30mL)溶解殘余物，依次用飽和碳酸氫鈉(10mL×3)和水(10mL×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得黃色油狀物。層析分離[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)＝1∶20]得淡黃色油狀物54mg。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：8.06～8.02(m，2H)，7.59～7.52(m，1H)，7.35～7.22(m，2H)，7.04～6.88(m，2H)，6.67(s，1H)，4.01～3.96(m，2H)，3.75(s，3H)，3.67～3.60(m，1H)，3.45～3.33(m，2H)，3.01(s，3H)，2.44(s，3H)，1.69～1.55(m，5H)；ESI-MS m/z：473.21[M+H]+
二、化合物活性測(cè)定：
由美國(guó)DiscoverX公司的β-Arresn assay高通量熒光測(cè)試，發(fā)現(xiàn)樣品S-146-A(10uM)對(duì)DRD2，5-HT2A，5-HT5A受體沒有抑制作用，對(duì)DRD4，DRD5有微弱的抑制作用，但是顯示了對(duì)5-HT6受體有很強(qiáng)的激動(dòng)作用，比serotonin EC80的激動(dòng)作用還要強(qiáng)33％。由于5-HT6受體對(duì)5-HT親和力是最高的，提示S-146-A有較強(qiáng)的受體亞型選擇性。5-HT受體和多巴胺受體亞型眾多，與抑郁癥、精神分裂癥等疾病有密切關(guān)系。采用美國(guó)DiscoveRx公司的Pathβ-Arrestin Assay高通量熒光測(cè)試技術(shù)進(jìn)行受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，測(cè)試衍生物1對(duì)多巴胺D2S、D4和D5受體，及5-HT2A、5-HT5A和5-HT6受體的作用。
1.實(shí)驗(yàn)方法
1.1細(xì)胞解凍
首先將AssayCompleteTM復(fù)活培養(yǎng)液(下稱復(fù)活培養(yǎng)液)置于37℃水浴中回溫15分鐘。后將Path Hunter β-Arrestin GPCR細(xì)胞凍管從-80℃冰箱或液氮中取出并迅速轉(zhuǎn)移到干冰中解凍1min，在無菌條件下將凍管放入37℃水浴中短暫振搖，直至細(xì)胞團(tuán)塊已完全解凍僅剩余小冰晶。70％乙醇擦拭凍管外部，將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15mL的無菌離心管中，加滿回溫的復(fù)活培養(yǎng)液，300×g離心力下離心4min使細(xì)胞成團(tuán)，吸出并棄去上清液，后加入15mL復(fù)活培養(yǎng)液并使細(xì)胞重懸。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T 75培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24h。24h將復(fù)活培養(yǎng)液換成細(xì)胞培養(yǎng)液，并在第一個(gè)24h到48h時(shí)加入抗生素。
1.2細(xì)胞傳代培養(yǎng)
若培養(yǎng)瓶中有多于75％的細(xì)胞融合則開始傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱移至組織培養(yǎng)罩中，吸出培養(yǎng)瓶中的上清液。加入10mL磷酸緩沖液(PBS)，振搖沖洗，后吸出PBS棄去。加入1.5mL細(xì)胞分離劑，并輕輕振搖以確保完全覆蓋培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至細(xì)胞已完全分離。加入8～10mL細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面的細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中。300×g離心力下離心4min使細(xì)胞沉聚，吸出并棄去上清液，后加入15mL復(fù)活培養(yǎng)液并使細(xì)胞重懸，稀釋三倍并分裝到新的培養(yǎng)瓶中。每2～3天重復(fù)上述過程一次。
1.3細(xì)胞接種
收集對(duì)數(shù)期重懸貼壁細(xì)胞，在最適密度時(shí)向白色384孔板的每孔中加入20μL細(xì)胞，37℃、5％CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。
1.4拮抗劑制備(圖1)
在一塊新的孔板上用細(xì)胞分析緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，相鄰兩孔的稀釋倍數(shù)為3倍。在孔板上標(biāo)注1～7號(hào)。在2～7號(hào)孔中加入60μL細(xì)胞分析緩沖液。1號(hào)孔中加入90μL最大工作濃度的拮抗劑/細(xì)胞分析緩沖液，后取出30μL加入到2號(hào)孔中，混合均勻；從2號(hào)孔取30μL加入到3號(hào)孔中，混合均勻，重復(fù)上述過程到5號(hào)孔，6號(hào)和7號(hào)孔為陰性對(duì)照，不加入拮抗劑。
1.5拮抗劑和激動(dòng)劑的加入
取5μL連續(xù)稀釋的拮抗劑加入分析板的相應(yīng)孔中，每孔細(xì)胞數(shù)量為5000個(gè)。37℃下培養(yǎng)分析板30分鐘，后1～6號(hào)孔中均加入5μL EC80濃度的激動(dòng)劑來激活細(xì)胞。后37℃或室溫下培養(yǎng)90或180min。
1.6信號(hào)檢測(cè)
分析板的所有孔中均加入12.5或15μL(50％v/v)的Path Hunter檢測(cè)試劑。室溫避光下培養(yǎng)分析板1小時(shí)，PerkinElmer EnvisionTM儀器讀取化學(xué)熒光信號(hào)。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
對(duì)部分合成的醚、胺、酯7個(gè)麥角堿衍生物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表-1所示。
表-1麥角堿衍生物受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
表中數(shù)據(jù)可知，衍生物1(10μM)對(duì)DRD2S，5-HT2A，5-HT5A受體沒有抑制作用；對(duì)DRD4，DRD5有微弱的抑制作用；對(duì)5-HT6受體有很強(qiáng)的激動(dòng)作用，比serotonin EC80的激動(dòng)作用還要強(qiáng)33％。由于serotonin EC80已基本接近其最大激動(dòng)作用，但衍生物1還可進(jìn)一步激活受體，表明衍生物1是較好的激動(dòng)劑或正向調(diào)節(jié)劑，且具有較強(qiáng)的受體亞型選擇性，具有抗抑郁活性。