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一種雞干擾素IFN?λ與IFN?α的融合蛋白的制作方法

文檔序號:11893656閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種雞干擾素λ與α融合蛋白,其特征在于:雞干擾素λ與α基因以同一載體在大腸桿菌中通過互補疏水性柔性氨基酸接頭融合表達而成,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如權(quán)利要求1所述的雞干擾素λ與α的融合蛋白,其特征在于:通過以下步驟所制而成:

A、引物設(shè)計

根據(jù)Genbank提供的雞IFN-λ的基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)與IFN-α的基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示),通過SignalP預(yù)測并除去信號肽,設(shè)計兩對引物,分別在上下游插入EcoR1與Hind3兩個酶切位點,為IFN-λ-F,IFN-λ-R1,IFN-α-F1,IFN-α-R。然后分別在IFN-λ的下游以及IFN-α上游設(shè)計2個含有互補疏水性柔性氨基酸接頭的引物IFN-λ-R2與IFN-α-F2。序列如下:

IFN-λ-F的序列如SEQ ID NO:4所示;

CCGGAATTCCAGGTCACCCCGAAGAA

IFN-λ-R1的序列如SEQ ID NO:5所示;

CCCAAGCTTCTAAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

IFN-λ-R2的序列如SEQ ID NO:6所示;

CTCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

IFN-α-F1的序列如SEQ ID NO:7所示;CCGGAATTCTGCAACCACCTTC

IFN-α-F2的序列如SEQ ID NO:8所示;

TCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTGCAACCACCTTC

IFN-α-R的序列如SEQ ID NO:9所示;

CCCAAGCTTCTAAGTGCGCGTGTTGCC

B、基因克隆與鑒定

用SPF雞胚自制雞胚成纖維(CEF)細胞,使用新城疫GM毒株攻毒后,抽提RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)得到擴增雞IFN-λ與IFN-α基因的模板cDNA,使用IFN-λ-F,IFN-λ-R1,IFN-α-F1,IFN-α-R引物擴增出雞IFN-λ與IFN-α去信號肽的基因片段。

接下來用SOE-PCR方法將雞IFN-λ與IFN-α基因融合:第一步,分別用IFN-λ-F,IFN-λ-R2與IFN-α-F2,IFN-α-R引物擴增出含有l(wèi)inker的兩個基因片段;第二步,以第一步膠回收產(chǎn)物為模板,不加引物,PCR擴增10-15個循環(huán);第三步,以第二步PCR產(chǎn)物為模板,用IFN-λ-F和IFN-α-R擴增PCR,得到的產(chǎn)物即chIFN-λ+α基因片段。

C、一種雞IFN-λ與IFN-α融合蛋白原核表達載體的構(gòu)建

將chIFN-λ+α融合基因連接至pMD-19T載體,16℃連接4h以上,轉(zhuǎn)化至含氨芐瓊脂平板,挑取單克隆菌放入LB培養(yǎng)基中搖菌,菌液PCR鑒定出陽性克隆,測序正確后擴大培養(yǎng),提取質(zhì)粒pMD-19T-chIFN-λ+α。

分別將pMD-19T-chIFN-λ+α與pET32a空載體用EcoR1與Hind3快切酶雙酶切,膠回收后用T4連接酶,常溫連接30min以上,轉(zhuǎn)化至含氨芐瓊脂平板,挑取單克隆菌放入LB培養(yǎng)基中搖菌,菌液PCR鑒定出陽性克隆,測序正確后擴大培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒pET32a-chIFN-λ+α。

3.權(quán)利要求1或2所述的雞干擾素λ與α的融合蛋白制備雞的抗病毒藥物方面的應(yīng)用。

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