專利名稱：雞干擾素γ及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域中功能基因的克隆、重組表達和純化等技術，特別是雞干擾素γ及其制備方法和用途。
背景技術：
目前，禽類養(yǎng)殖業(yè)已成為我國畜牧業(yè)養(yǎng)殖的第一大產業(yè)，養(yǎng)殖方式從傳統(tǒng)的粗放經營向高密度、集約化養(yǎng)殖高速發(fā)展。但是伴隨高成本、集約化的養(yǎng)殖的高速發(fā)展，病害問題不可避免的成為限制畜禽產業(yè)快速發(fā)展的第一大瓶頸和不可逾越的障礙。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年因各類禽病引起的死亡率高達15-20％，經濟損失達數(shù)十億元。同時，我國加入WTO后，市場對畜禽產品的需求也逐漸從數(shù)量型轉向質量型，對畜禽產品的質量要求達到了前所未有的程度，因禽類病害、藥物殘留、以及不符合衛(wèi)生標準的禽類食品不僅影響我國禽類養(yǎng)殖產業(yè)發(fā)展、產品的出口創(chuàng)匯，甚至威脅到了人的身體健康。近來爆發(fā)的禽流感、非典型性新城疫以及其它有關病害，幾乎使禽類養(yǎng)殖遭受滅頂之災。
對禽類養(yǎng)殖危害最大的是傳染病，尤其是病毒病，約占病害總量的70％。對禽類傳染病的預防與治療途徑主要為疫苗和抗生素。但是，由于養(yǎng)殖環(huán)境惡劣，病原變異，藥物的殘留以及機體抵抗力下降等原因，使得傳統(tǒng)的免疫和預防途徑受到了巨大挑戰(zhàn)。大部分抗生素類藥物和傳統(tǒng)的口服化藥，由于藥物殘留問題，給人體健康帶來的負面影響，已面臨全面停藥并即將退出歷史舞臺的危險；而傳統(tǒng)的疫苗，由于它的高特異性，無法抵擋病原的變異和新型病害的出現(xiàn)給禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來新的沖擊，禽類養(yǎng)殖即將面臨孤立無援的窘境。
干擾素(Interferon)是一類由病毒誘導機體產生的，具有干擾病毒在感染和非感染組織中復制的一類小分子蛋白。干擾素分為I型和II型干擾素兩大類，其中I型干擾素(IFNα和IFNβ)的主要作用為干擾病毒在體內復制，保護非感染組織免受病毒侵擾的能力。II型干擾素又稱為干擾素γ(IFNγ)，它除可用于抑制病毒的自我復制外，更具有很強的免疫調節(jié)能力，包括活化B細胞，增強抗體的免疫保護力；刺激T細胞產生相關的細胞因子，調節(jié)機體的免疫進程；誘導巨噬細胞的吞噬和趨化能力；促進吞噬細胞脫顆粒，誘導呼吸代謝爆發(fā)以及修復損傷等多種功能，它對機體的免疫保護和對病毒病的防治效果明顯優(yōu)于I型干擾素。
但是，干擾素與其它細胞因子一樣，在體內的表達量低，在體內的濃度約10-12mol/L；半衰期短，經病毒感染或誘導后約6h達到高峰，24h后濃度即顯著下降。因此，采用生化分離的方法，由細胞或機體直接獲得的干擾素成本極其昂貴，極大地限制了它的開發(fā)和臨床上應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于采用基因重組技術，對雞干擾素γ基因進行克隆，將獲得的基因在體外進行重組與表達，實現(xiàn)雞的IFNγ在體外的批量生產與純化制備，以克服現(xiàn)有技術中干擾素生產成本昂貴的缺點，充分利用重組雞干擾素γ為工業(yè)服務。
本發(fā)明的整體構思是雞干擾素γ的cDNA序列為1 CTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCAAGT1 L N L V Q L Q D D I D K L K A D F N S S61 CATTCAGATGTAGCTGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAG21 H S D V A D G G P I I V E K L K N W T E121 AGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAA41 R N E K R I I L S Q I V S M Y L E M L E181 AACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAA61 N T D K S K P H I K H I S E E L Y T L K241 AACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCCCCCG81 N N L P D G V K K V K D I M D L A K P P301 ATGAACGACTTGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAG
101 M N D L R I Q R K A A N E L F S I L Q K361 CTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGC121 L V D P P S F K R K R S Q S Q R R C N C以上序列為雞干擾素γ的核苷酸序列和氨基酸序列，其中第1、3、5、7、9、11、13行為核苷酸序列，第2、4、6、8、10、12、14行為氨基酸序列。
雞干擾素γ的制備方法由如下工藝步驟組成A、雞重組干擾素的重組載體構建、轉化與篩選，其中包括a、重組載體的構建根據(jù)雞干擾素基因成熟肽的cDNA序列，利用一對特異性引物rCIFF 5’CAG CAT GCC TAA ATC TTG TTC AAC TTC 3’和rCIFR 5’CCA AGC TTA GCA ATT GCA TCT CCT CT 3’，在這對引物的兩端引入兩個不同的限制性內切酶位點如SphI和HindIII，在經聚肌胞(polyIC)或病毒感染的雞內臟cDNA文庫中進行PCR擴增反應，擴增產物經兩個不同的限制性內切酶SphI和HindIII消化后，亞克隆到含6個組氨酸(6His)標記的表達質粒載體，表達質粒載體選用pQE系列(Qiagen)、pET系列或pMET系列；b、轉化和篩選利用化學轉化或電轉化的方法，將a步驟中已構建的表達載體，轉化或轉染到原核或真核宿主體內，分別以載體引物和基因特異性引物進行PCR雙向篩選；獲得的陽性克隆進行質粒純化，限制性內切酶消化驗證；并經序列測定等鑒定后，所篩選得到的陽性克隆作為工程菌株；B、表達產物的誘導表達與分離純化，其中采用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或甲醇等試劑為誘導劑對b步驟中所獲得的工程菌種進行誘導與表達，經裂解液裂解后用金屬親和層析和單克隆抗體純化；C、終止和保存。
1雞干擾素γ的用途是制備疫苗的免疫增強劑、病害防治藥物、飼料添加劑、醫(yī)藥制劑。
本發(fā)明制備方法中具體工藝條件和工藝步驟是PCR擴增反應的反應液應包括如下單位體積的組份
cDNA 1-5ul10x PCR buffer2.5ul25mM Mg2+1.5ul2.5mM DNTP1ul10pM rCIFF/rCIFR 1ulTaq polymerase 5u/ul 0.2ul加水至25ulPCR擴增反應包括25-35個循環(huán)，每個循環(huán)包括cDNA變性，退火和延伸三個反應過程，其中cDNA變性的反應條件是反應溫度92-98℃，孵育時間0.5-1分鐘；退火降低溫度，使引物與模板退火結合，反應溫度為55-64℃、反應時間為0.5-1分鐘；延伸當模板與引物退火后，提高溫度使退火引物延模板方向延伸，使目的基因充分擴增，反應溫度為68℃-72℃，反應時間為45秒-3分鐘；終止和保存步驟中，終止是反應完成后，將新合成樣品暫時保存于4-10℃的低溫環(huán)境下；長期保存是將擴增產物保存于-20℃--80℃?zhèn)溆谩?br> 亞克隆是用限制性內切酶SphI和HindIII對獲得的PCR產物或克隆的質粒及表達載體進行限制性消化，將消化后的含特異性限制性內切酶位點的基因擴增產物和表達載體經純化后，用T4DNA連接酶連接，并轉化到原核或真核表達載體中。
擴增產物經兩個不同的限制性內切酶SphI和HindIII消化反應中，反應液包括如下組份PCR產物或質粒DNA 0.1ug-2ug10X buffer 2ul限制性內切酶Sph I1ul限制性內切酶Hind III 1ul將上述組份加水至20ul，于37℃孵育0.5-6小時。
連接是將消化后的目的基因和表達載體純化后，按照1-8至8-1的比例混合，加入T4DNA連接酶，于溫度為4-16℃、時間為0.5-24小時進行連接，連接反應中各組份的用量為2X含T4DNA連接酶快速連接緩沖液 5μl經消化后的表達載體150ng經消化后的目的基因片斷50ng將上述組份加水至10μlB步驟中金屬親和層析選用Ni-NTA(Qiagen)金屬親和純化膠體，單克隆抗體選用6His單克隆抗體或純化后雞干擾素的單克隆抗體。
本發(fā)明取得的實質性特點和顯著的技術進步在于本發(fā)明將雞干擾素γ基因克隆到原核表達載體，并在體外進行純化，該技術包括重組表達載體的構建、表達產物的分離純化等技術環(huán)節(jié)，能獲得高純度體外表達的雞干擾素γ基因；采用該方法制備的產品可用于制備病害防治藥物、免疫增強劑、餌料添加劑等，也可用于禽類免疫機制的理論研究。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發(fā)明做進一步描述雞干擾素γ的cDNA序列如前述。
雞干擾素γ的制備方法由如下工藝步驟組成A、雞重組干擾素的重組載體構建、轉化與篩選，其中包括a、重組載體的構建根據(jù)雞干擾素基因成熟肽的cDNA序列，利用一對特異性引物rCIFF 5’CAG CAT GCC TAA ATC TTG TTC AAC TTC 3’和rCIFR 5’CCA AGC TTA GCA ATT GCA TCT CCT CT 3’，在這對引物的兩端引入兩個不同的限制性內切酶位點SphI和HindIII，在經聚肌胞(polyIC)進行PCR擴增反應，擴增產物經兩個不同的限制性內切酶SphI和HindIII消化后，亞克隆到含6個組氨酸(6His)標記的表達質粒載體，表達質粒載體選用pQE系列(Qiagen)、pET系列或pMET系列；b、轉化和篩選利用傳統(tǒng)氯化鈣法，將a步驟中已構建的表達載體，轉化到原核宿主體內，原核宿主選用大腸桿菌，分別以載體引物和基因特異性引物進行PCR雙向篩選；獲得的陽性克隆進行質粒純化，限制性內切酶消化驗證；并經序列測定等鑒定后，所篩選得到的陽性克隆作為工程菌株；B、表達產物的分離純化，其中采用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為誘導劑對b步驟中所獲得的工程菌種進行誘導與表達，經裂解液裂解后用金屬親和層析和單克隆抗體純化；C、終止和保存。
其中，PCR擴增反應的反應液應包括如下單位體積的組份cDNA 1-5ul10x PCR buffer 2.5ul25mM Mg2+1.5ul2.5mM DNTP 1ul10pM rCIFF/rCIFR 1ulTaq polymerase 5u/ul 0.2ul加水至 25ulPCR擴增反應包括30個循環(huán)，每個循環(huán)包括cDNA變性，退火和延伸三個反應過程，其中cDNA變性的反應條件是反應溫度94℃，孵育時間0.5分鐘；退火降低溫度，使引物與模板退火結合，反應溫度為60℃、反應時間為30秒；延伸當模板與引物退火后，提高溫度使退火引物延模板方向延伸，使目的基因充分擴增，反應溫度為70℃，反應時間為60秒；終止和保存步驟中，終止是反應完成后，將新合成樣品保存于4℃的低溫環(huán)境下；保存是將擴增產物保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 亞克隆是用限制性內切酶SphI和HindIII對獲得的PCR產物或克隆的質粒及表達載體進行限制性消化，將消化后的含特異性限制性內切酶位點的基因擴增產物和表達載體經純化后，用T4DNA連接酶連接，并轉化到原核表達載體中。
擴增產物經兩個不同的限制性內切酶SphI和HindIII消化反應中，反應液包括如下組份PCR產物或質粒DNA 0.15ug10X buffer 2ul限制性內切酶Sph I1ul限制性內切酶Hind III 1ul將上述組份加水至20ul，于37℃孵育3小時進行消化。。
連接是將消化后的目的基因和表達載體純化后，加入T4DNA連接酶，按照如下要求配制，于溫度為16℃、連接過夜，連接反應中各組份的用量為含T4DNA連接酶快速連接緩沖液2X 5μl經消化后的表達載體 150ng經消化后的目的基因片斷 50ng將上述組份加水至10μlB步驟中金屬親和層析選用Ni-NTA(Qiagen)金屬親和純化膠體，單克隆抗體選用6His單克隆抗體或純化后雞干擾素的單克隆抗體。
雞干擾素γ用于制備疫苗的免疫增強劑。
權利要求
1.雞干擾素γ，其特征在于它的cDNA序列為1 CTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCAAGT1 L N L V Q L Q D D I D K L K A D F N S S61 CATTCAGATGTAGCTGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAG21 H S D V A D G G P I I V E K L K N W T E121 AGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAA41 R N E K R I I L S Q I V S M Y L E M L E181 AACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAA61 N T D K S K P H I K H I S E E L Y T L K241 AACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCCCCCG81 N N L P D G V K K V K D I M D L A K P P301 ATGAACGACTTGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAG101 M N D L R I Q R K A A N E L F S I L Q K361 CTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGC121 L V D P P S F K R K R S Q S Q R R C N C以上序列為雞干擾素γ的核苷酸序列和氨基酸序列，其中第1、3、5、7、9、11、13行為核苷酸序列，第2、4、6、8、10、12、14行為氨基酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的雞干擾素γ的制備方法，其特征在于它由如下工藝步驟組成A、雞重組干擾素的重組載體構建、轉化與篩選，其中包括a、重組載體的構建根據(jù)雞干擾素基因成熟肽的cDNA序列，利用一對特異性引物，并在這對引物的兩端引入兩個不同的限制性內切酶位點如(SphI，KpnI，PstI，XhoI)和(KpnI，PstI，HindIII)，以下以SphI和HindIII為例進行說明，引物rCIFF 5’-CAG CAT GCC TAA ATC TTG TTC AAC TTC-3’和引物rCIFR 5’-CCA AGC TTA GCA ATT GCA TCT CCT CT-3’的兩端分別含有SphI和HindIII限制性內切酶識別位點為G CAT GC和A AGC TT，在經聚肌胞(polyIC)或病毒感染的雞內臟cDNA文庫中進行PCR擴增反應，擴增產物經兩個不同的限制性內切酶SphI和HindIII消化后，亞克隆到含6個組氨酸(6His)標記的表達質粒載體，表達質粒載體選用pQE系列(Qiagen)、pET系列或pMET系列等；b、轉化和篩選利用化學轉化或電轉化的方法，將a步驟中已構建的原核或真核表達載體，轉化或轉染到原核或真核宿主體內，分別以載體引物和基因特異性引物進行PCR雙向篩選；獲得的陽性克隆進行質粒純化，限制性內切酶消化驗證；并經序列測定等鑒定后，所篩選得到的陽性克隆作為工程菌株；B、表達產物的分離純化，其中采用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或甲醇為誘導劑對b步驟中所獲得的工程菌種進行誘導與表達，經裂解液裂解后用金屬親和層析和單克隆抗體純化；C、終止和保存。
3.根據(jù)權利要求2所述的雞干擾素γ的制備方法，其特征在于PCR擴增反應的反應液應包括如下單位體積的組份cDNA 1-5ul10×PCR buffer 2.5ul25mM Mg2+1.5ul2.5mM DNTP 1ul10pM rCIFF/rCIFR 各1ulTaq polymerase 5u/ul 0.2ul加水至 25ul
4.根據(jù)權利要求2或3所述的雞干擾素γ的制備方法，其特征在于PCR擴增反應包括25-35個循環(huán)，每個循環(huán)包括cDNA變性，退火和延伸三個反應過程，其中cDNA變性的反應條件是反應溫度92-98℃，孵育時間0.5-1分鐘；退火降低溫度，使引物與模板退火結合，反應溫度為55-64℃、反應時間為0.5-1分鐘；延伸當模板與引物退火后，提高溫度使退火引物延模板方向延伸，使目的基因充分擴增，反應溫度為68℃-72℃，反應時間為45秒-3分鐘。
5.根據(jù)權利要求2所述的雞干擾素γ的制備方法，其特征在于所述的終止和保存步驟中，終止是反應完成后，將新合成樣品暫時保存于4-10℃的低溫環(huán)境下；長期保存是將擴增產物保存于-20℃--80℃?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權利要求2所述的雞干擾素γ的制備方法，其特征在于所述的亞克隆是用限制性內切酶SphI和HindIII對獲得的PCR產物或克隆的質粒及表達載體進行限制性消化，將消化后的含特異性限制性內切酶位點的基因擴增產物和表達載體經純化后，用T4 DNA連接酶連接，并轉化到原核或真核表達載體中。
7.根據(jù)權利要求2或6所述的雞干擾素γ的制備方法，其特征在于所述的擴增產物經兩個特定的限制性內切酶SphI和HindIII消化反應中，反應液包括如下組份PCR產物或質粒DNA 0.1ug-2ug10X buffer 2ul限制性內切酶Sph I 1ul限制性內切酶Hind III 1ul將上述組份加水至20ul，于37℃孵育0.5-6小時。
8.根據(jù)權利要求6所述的雞干擾素γ的制備方法，其特征在于所述的連接是將消化后的目的基因和表達載體純化后，按照1-8∶1-8的比例混合，加T4 DNA連接酶，于溫度為4-16℃、時間為0.5-24小時進行連接，連接反應中各組份的用量為2X含T4 DNA連接酶快速連接緩沖液 5μl經消化后的表達載體 150ng經消化后的目的基因片斷 50ng將上述組份加水至10μl
9.根據(jù)權利要求2所述的雞干擾素γ的制備方法，其特征在于所述的B步驟中金屬親和層析選用Ni-NTA(Qiagen)金屬親和純化膠體，單克隆抗體選用6His單克隆抗體或純化后雞干擾素的單克隆抗體。
10.根據(jù)權利要求1所述的雞干擾素γ的用途，其特征在于它用于制備疫苗的免疫增強劑、病害防治藥物、飼料添加劑、醫(yī)藥制劑等。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術領域中功能基因的克隆、重組表達和純化等技術，特別是雞干擾素γ及其制備方法和用途。它采用雞重組干擾素的重組載體構建與篩選、表達產物的分離純化等制備方法制備雞干擾素γ。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術存在的雞干擾素γ生產成本昂貴的問題，具有采用該方法能夠獲得高純度體外表達的雞干擾素γ基因，所制備的產品可用于制備病害防治藥物、免疫增強劑、餌料添加劑等，也可用于禽類免疫機制的理論研究。
文檔編號A61K38/21GK1752210SQ20051001270
公開日2006年3月29日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權日2005年7月22日
發(fā)明者蔡中華, 邢克智, 高春萍 申請人:蔡中華, 邢克智, 高春萍