重組雞干擾素α及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種重組雞干擾素α及其制備方法，所述雞干擾素α目的基因?yàn)樾蛄斜?00<1>所示序列，具體步奏如下：(1)獲取雞干擾素α基因；(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建；(3)基因工程菌株的構(gòu)建；(4)重組蛋白的表達(dá)；(5)重組雞干擾素α的發(fā)酵生產(chǎn)；(6)重組雞干擾素α的生物學(xué)活性測定；其制備方法將基因工程菌株作用于發(fā)酵合成，獲得的重組雞干擾素α是無毒、無害、無殘留的生物制品，具有明顯的抗病毒活性，為我國禽類健康保駕護(hù)航，為食品安全提供綠色保障。
【專利說明】重組雞干擾素a及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及禽畜藥物生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是重組雞干擾素a及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素（Interferon, IFN)是1957年，英國病毒生物學(xué)家Alick Isaacs和瑞±研 究人員JeanLindenmann在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)的，被病毒感染 的細(xì)胞產(chǎn)生一種能作用于其他細(xì)胞并干擾病毒復(fù)制的因子，故將其命名為干擾素。1963年 Lampson等純化了該種因子，證明其分子量為20?34KD的蛋白質(zhì)。之后研究者對人類及哺 乳類動(dòng)物的干擾素進(jìn)行了大量的研究，取得了突破性的進(jìn)展。研究表明干擾素是一類能誘 導(dǎo)人及動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的類激素蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié) 等生物學(xué)活性。1980年，國際干擾素命名委員會(huì)指出；干擾素是一類在同種細(xì)胞上具有廣 譜抗病毒功能的活性蛋白，其活性的發(fā)揮又受細(xì)胞基因的調(diào)節(jié)和控制，設(shè)及RNA和蛋白質(zhì) 的合成。干擾素在醫(yī)學(xué)上更為詳細(xì)的定義是由病毒和其他種類的干擾素誘導(dǎo)劑，刺激網(wǎng)狀 內(nèi)皮系統(tǒng)、巨瞻細(xì)胞、淋己細(xì)胞W及體細(xì)胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白。
[0003] 哺乳動(dòng)物干擾素分為I型和II型干擾素，I型干擾素又主要包括IFN-a、IFN-e、 IFN-?和IFN-T，他們具有相似的結(jié)構(gòu)并享用同一類受體。前S種主要是對病毒感染的應(yīng) 答產(chǎn)生的，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病毒蛋白。II型干擾素又稱免疫干擾素，即IFN-丫，是由活化 的T淋己細(xì)胞在誘生劑的作用下產(chǎn)生的，與I型干擾素不享用同一類受體，對免疫系統(tǒng)有 調(diào)節(jié)作用，是哺乳動(dòng)物主要的巨瞻細(xì)胞活化因子。IFN-a主要來源于B淋己細(xì)胞、巨瞻細(xì) 胞和NK細(xì)胞；IFN-0主要來源于成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞，部分來源于巨瞻細(xì)胞；IFN-丫則 主要由T淋己細(xì)胞產(chǎn)生，在一定條件下也可由NK細(xì)胞產(chǎn)生。雞及其他禽類干擾素系統(tǒng)與哺 乳動(dòng)物干擾素系統(tǒng)相類似，也分為I型干擾素和II型干擾素，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)雞I型干擾素包括 IFN- a、IFN- 0，II型包括IFN- 丫，目前在禽類中尚未發(fā)現(xiàn)IFN- ?和IFN- T。
[0004] 干擾素的相對分子質(zhì)量小，雞干擾素分子量為20?34KD的蛋白質(zhì)，具有蛋白質(zhì)通 性，對熱穩(wěn)定，2-8°C可保存很長時(shí)間，20°C可長期保存其活性，56°C則被破壞，P肥?10范 圍內(nèi)干擾素不被破壞，易被核酸酶中和，可被蛋白酶滅活。自然干擾素為一種糖蛋白，經(jīng)除 去糖分后，并不影響干擾素的抗病活性。干擾素作用廣譜，對多種病毒甚至細(xì)菌均有抑制作 用，但抑制力表現(xiàn)不同；抑制作用通常表現(xiàn)種屬特異性，即某一種屬細(xì)胞產(chǎn)生的IFN只能作 用于相同種屬的其它細(xì)胞，使其獲得免疫力，而對異種細(xì)胞沒有保護(hù)作用，但個(gè)別種屬之間 存在著交叉活性。
[0005] 雞干擾素a全基因?yàn)?82個(gè)堿基，編碼193個(gè)氨基酸，其中前31個(gè)氨基酸為信號(hào) 膚，后162個(gè)氨基酸為成熟蛋白，蛋白分子量約為19kDa。Sekellick等于1994年首次成功 克隆和表達(dá)了化IFN2a基因，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。國內(nèi)學(xué)者汪明等2000年克隆表達(dá)了肉 雞IFNa基因；同年，夏春等克隆了惠陽胡須雞和絲羽烏骨雞IFNa基因。
[0006] 干擾素自1957年被發(fā)現(xiàn)W來，陸續(xù)證實(shí)它具有抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲感染、免 疫調(diào)節(jié)、免疫佐劑、影響細(xì)胞調(diào)亡等作用。I型干擾素主要表現(xiàn)為抑制病毒復(fù)制，抑制細(xì)胞 增殖，加強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷病毒感染細(xì)胞的能力，增強(qiáng)MHC I類分子的表達(dá)而抑制MHC II類分 子的表達(dá)。II型干擾素又稱免疫干擾素，抗病毒活性較I型低，但它的免疫調(diào)節(jié)和抗細(xì)胞 增殖的作用較強(qiáng)，它是一種強(qiáng)的巨瞻細(xì)胞、NK細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞活化劑，能激活巨瞻細(xì)胞 并促進(jìn)其活性；能直接作用于T和B淋己細(xì)胞，促進(jìn)分化；能增強(qiáng)MHC I類分子和MHC II類 分子的表達(dá)。1999年Marcus等采用飲水給藥的方法進(jìn)行了重組化IFN-a抗新城疫病毒 (NDV)的研究，表明IFN抗病毒的顯著效果。另外的研究結(jié)果表明，重組化1FN-a對馬立克 氏病、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎、禽流感等病毒性疾病也具有良好效果，展現(xiàn)出廣 闊的應(yīng)用前景。2004年，李風(fēng)華等報(bào)道雞基因工程IFN對新城疫、傳染性法氏囊病、傳染性 支氣管炎、馬立克氏病等病毒病均有顯著療效。1999年P(guān)lachy等進(jìn)行了雞重組IFN防治 RSV腫瘤的研究，結(jié)果表明高劑量的rGGIFN-a不僅可W抑制腫瘤，還可W使一些雞的RSV 肉瘤完全消失。1996年，Weining等研究表明，重組IFN在通過調(diào)控MHC類抗原表達(dá)發(fā)揮 免疫調(diào)節(jié)功能方面表現(xiàn)出與哺乳動(dòng)物的一致性。重組雞a-干擾素（r化IFN-a)靜脈注射 4?6周齡SPF雞，2化后采血分離淋己細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)測定不同時(shí)間外周血中CD4+ 和CD8+T淋己細(xì)胞的百分率，結(jié)果顯示，r化IFN- a可W在48?72h內(nèi)明顯提高CD4+T淋己 細(xì)胞的百分率，證明r化IFN-a具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。
[0007] 臨床應(yīng)用上，干擾素有著抗生素?zé)o法替代的作用。目前我國已經(jīng)有商品化的人用 基因工程干擾素上市，但是動(dòng)物用的干擾素研究相對比較滯后，目前還沒有商品化的產(chǎn)品 上市。眾所周知，我國是禽類養(yǎng)殖大國，也是禽類產(chǎn)品的消費(fèi)大國，禽類養(yǎng)殖業(yè)的興衰直接 影響我國的國民經(jīng)濟(jì)。目前，高密度集約化大型籠養(yǎng)肉雞或蛋雞是目前主要的養(yǎng)雞模式，由 于密度過大，導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量下降，從而給多種病原特別是病毒的入侵制造了契機(jī)。病毒 打開雞機(jī)體的防御大口后，各種繼發(fā)的細(xì)菌性疾病隨之出現(xiàn)，造成了雞群大規(guī)模死亡。為了 提高存活率，增加養(yǎng)殖效益，養(yǎng)殖戶開始使用大量的抗生素作為飼料添加劑，從而達(dá)到降低 雞群的死亡率的目的。但是，隨著抗生素的濫用日益嚴(yán)重，導(dǎo)致禽類產(chǎn)品的藥物殘留嚴(yán)重超 標(biāo)，各種耐藥細(xì)菌不斷出現(xiàn)，對人類及動(dòng)物的健康和貿(mào)易出口帶來嚴(yán)重的危害。于是，尋找 一種安全有效的、無污染無殘留的"綠色動(dòng)物藥品"顯得迫在眉睫。
[000引而基因工程雞干擾素a是無毒、無害、無殘留的生物制品，具有明顯的抗病毒活 性，因此，有望將其應(yīng)用在禽類養(yǎng)殖業(yè)上，W期解決目前我國養(yǎng)殖業(yè)中存在的部分問題，為 我國禽類健康保駕護(hù)航，為食品安全提供綠色保障。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種重組雞干擾素a。
[0010] 本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述重組雞干擾素a的制備方法。
[0011] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0012] 一種重組雞干擾素a，其CDNA為序列表400<1〉所示序列，其蛋白活性的多膚氨基 酸為序列表400<2〉所示序列。
[0013] 上述重組雞干擾素a的制備方法，具體構(gòu)建步驟如下；
[0014] (1)獲取雞干擾素a基因；參照Gene Bank中已發(fā)表的雞干擾素a成熟膚基因 編碼序列，合成了雞干擾素a的cDNA序列，該序列通過重新優(yōu)化，替換稀有密碼子，調(diào)節(jié)AT 含量，可在大腸桿菌化21 0E3)中高效表達(dá)，優(yōu)化后的雞干擾素a成熟膚的基因序列為序 列表400<1〉所示序列；
[0015] (2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建；用酶切連接的方法分別將上述雞干擾素a基因與載體 祀T-21a(+)相連，得到攜帶雞干擾素a基因的重組表達(dá)載體祀T-21a(+)/化IFNa，并進(jìn)行 雙酶切驗(yàn)證；
[0016] (3)基因工程菌株的構(gòu)建：將上述驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌株 BL2UDE3)中，得到含有重組質(zhì)粒的基因工程菌株；
[0017] (4)重組蛋白的表達(dá)；發(fā)酵條件下使工程菌株在IPTG的誘導(dǎo)下合成雞干擾素a 蛋白；
[0018] (5)重組雞干擾素a的發(fā)酵生產(chǎn)；制備發(fā)酵種子液，將種子液接入發(fā)酵罐中，通過 補(bǔ)加碳源和誘導(dǎo)劑使其大量生產(chǎn)雞干擾素a，獲得的重組雞干擾素a經(jīng)提取、純化后制成 雞干擾素a產(chǎn)品；
[0019] 做重組雞干擾素a的生物學(xué)活性測定；根據(jù)微量細(xì)胞病變仰巧抑制法，采用 細(xì)胞系是雞成纖維細(xì)胞作為試驗(yàn)細(xì)胞系，檢測重組干擾素的抗病毒活性。
[0020] 優(yōu)選的，上述重組雞干擾素a的制備方法，所述步驟（2)中所用的原核表達(dá)載體 是大腸桿菌表達(dá)載體祀T-21a，構(gòu)建載體宿主細(xì)胞是大腸桿菌D冊a菌株，表達(dá)宿主細(xì)胞是 大腸桿菌化21值E3)菌株。
[0021] 優(yōu)選的，上述重組雞干擾素a的制備方法，所述步驟（3)中重組蛋白的表達(dá)；分別 挑取與祀T-21a表達(dá)載體連接的重組表達(dá)菌于含氨節(jié)青霉素100 y g/ml的LB培養(yǎng)基中擴(kuò) 增，在培養(yǎng)溫度為35?37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180?20化/min條件下，培養(yǎng)至菌液OD值為1左 右時(shí)，取出ImL菌液作為對照，剩下的部分加入終濃度為0. 5?2mM/mL的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)， 誘導(dǎo)時(shí)間為4?6小時(shí)，誘導(dǎo)結(jié)束后1200化/min離屯、2?5min收集菌體，并將誘導(dǎo)前后的 菌體煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測重組雞干擾素a蛋白的表達(dá)。
[0022] 優(yōu)選的，上述重組雞干擾素a的制備方法，所述步驟巧）中重組雞干擾素a的發(fā) 酵生產(chǎn)包括：
[0023] a.種子活化：將表達(dá)雞a干擾素的工程菌株大腸桿菌在固體LB培養(yǎng)基上活化， 然后挑取一單菌落至50血LB液體培養(yǎng)基中，在30?37°C，180?220巧m，培養(yǎng)12?24 小時(shí)；再將得到的種子液按體積比1%?5%的接種量接種至LB培養(yǎng)基中，在30?37°C， 180?220巧m，培養(yǎng)6?12小時(shí)，得到發(fā)酵種子液；
[0024] b.接種；向發(fā)酵罐中填充發(fā)酵培養(yǎng)基，然后按體積比5%?10%的接種量將上述 活化好的種子液接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中；
[0025] C.發(fā)酵；向發(fā)酵罐中通入空氣或者空氣/氧氣的混合氣體，通氣量為2?4m3/h， 發(fā)酵溫度30?37°C，攬拌轉(zhuǎn)數(shù)300?9(K)巧m，溶氧控制在20%?40%，抑控制在6. 8? 7. 4,發(fā)酵時(shí)間11?24小時(shí)，當(dāng)0D600皿=2?4時(shí)開始補(bǔ)料，補(bǔ)料的流加速度是100? 1000血A ;
[0026] d.誘導(dǎo)；當(dāng)0D600皿=4?6時(shí)開始添加IPTG誘導(dǎo)雞干擾素a的表達(dá)，誘導(dǎo)4? 6小時(shí)停罐。
[0027] 優(yōu)選的，上述重組雞干擾素a的制備方法，所述步驟巧）中重組雞干擾素a的純 化、提取工藝包括：
[002引 a.提取包涵體蛋白；4°C、600化pm/min、20min離屯、收集大腸桿菌菌體，菌體濕重 為77g/l，并在功率400瓦、工作3秒、間歇7秒、工作時(shí)間20?30分鐘條件下將lOg濕菌 體超聲重懸于PBS緩沖液中破碎，4°C、900化pm/min、15min高速冷凍離屯、，得到雞a干擾素 包涵體蛋白質(zhì)；
[0029] b.純化包涵體蛋白質(zhì)；首先按質(zhì)量體積比1 : 30將包涵體重懸于第一洗漆液中 高速冷凍離屯、；然后按質(zhì)量體積比1 : 30將包涵體重懸于第二洗漆液中高速冷凍離屯、；最 后按質(zhì)量體積比1 : 40將包涵體重懸于第=洗漆液中高速冷凍離屯、，所述高速冷凍離屯、的 條件均為4°C、10000巧m/min、15min，其中第一洗漆液的組分配比為化C1 137mmol/L、KC1 2. 7mmol/L、Na2HP〇4lOmmol/L、KH2P〇42mmol/L、l ?2%的化itonX-100、pH 8 ?9 ;第二洗漆 液為1?2mol/L尿素；第S洗漆液為0. 5?1. 5mol/L化C1 ;
[0030] C.溶解與復(fù)性包涵體蛋白質(zhì)；按質(zhì)量體積比為1 : 35將上一步離屯、后所得沉淀 用變性劑重懸，室溫放置至沉淀逐漸溶解后，4°C、85(K)巧m/min、15min高速冷凍離屯、，收集 上清液；4°C條件下，使上清液逐滴加入到上述制備的復(fù)性液中，體積比為1 : 80,同時(shí)攬拌 12?16h，所述變性劑的組分配比為每4?6M鹽酸脈中1?1. 5mM邸TA、30?40mM Tris、 6 ?8mM DTT、p服?9 ;
[0031] d.收獲復(fù)性重組雞a干擾素蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE進(jìn)行檢測。
[0032] 優(yōu)選的，上述重組雞干擾素a的制備方法，所述LB培養(yǎng)基的成分為蛋白腺lOg/L、 酵母粉5g/L、氯化鋼lOg/l，通過常規(guī)方法制備而成。
[0033] 優(yōu)選的，上述重組雞干擾素a的制備方法，所述所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為；葡 萄糖 5g/L、蛋白腺 5g/L、酵母粉 5g/L、KH2P〇42g/L、KaHPC^g/L、化2冊〇4 ? 12&0 7g/L、 (NH4)2S〇4l. 2g/L、NH4Cl 0. 2g/L、MnS〇4 .5&00. 001g/L、CoCl2 *6&0 0. 004g/L、Na2Mo〇4 ?2&0 0. 002g/L、&iCl2〇. 002g/L、CuS〇4 ? 5&0 0. OOlg/L、H3BO4O. 005g/L、FeS〇4 ? 7&0 0. 02g/L、 CaCl ? 2&00. 02g/L、M拆O4 ? 7&0 0. 3g/L、消泡劑0. 2g/l，通過常規(guī)方法制備而成。
[0034] 優(yōu)選的，上述重組雞干擾素a的制備方法，所述步驟化）中重組雞干擾素a的生 物學(xué)活性測定方法；將供試品用測定培養(yǎng)液稀釋成每1ml約含1000IU。在96孔細(xì)胞培養(yǎng) 板中，做4倍系列稀釋，共8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做2個(gè)孔。在無菌條件下操作。使雞胚 成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)基中貼壁生長。取培養(yǎng)的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次后消化和收集 細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液配制成每1ml含2. 5 X 105?3. 5 X 10 5個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔lOOul。于37°C、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)4?6小時(shí)。將配制完成的 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液移入接種雞胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔加入lOOul。于37°C、 5%二氧化碳條件下培養(yǎng)18?24小時(shí)。棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液。將保存的水泡性口 炎病毒（VSV，-70°C保存）用攻毒培養(yǎng)液稀釋至100CCID50,每孔lOOul。于37°C、5%二氧 化碳培養(yǎng)24小時(shí)。
[0035] 然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，每孔加染色液50ul，室溫放置30分鐘后，用流 水小屯、沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液lOOul，室溫放置3?5分鐘。混勻 后，用酶標(biāo)儀W 630nm為參比波長，在波長57化m處測定吸光度，記錄測定結(jié)果。
[0036] 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用計(jì)算機(jī)程序或四參數(shù)回歸計(jì)算法進(jìn)行處理。并按下式計(jì)算試驗(yàn)結(jié) 果：
[0037] 供試品生物學(xué)活性gu/ml)二Pr X
[003引式中；Pr為標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性，lU/ml ;
[0039] 化為供試品預(yù)稀釋倍數(shù)；
[0040] 化為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)；
[0041] Es為供試品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)；
[0042] 化為標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù)。
[0043] 本發(fā)明的有益效果；
[0044] 上述重組雞干擾素a，具有生產(chǎn)成本低、純度高、活性強(qiáng)的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于禽 類養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域，其制備方法W大腸桿菌為基礎(chǔ)，運(yùn)用基因工程重組技術(shù)構(gòu)建基因工程菌株， 通過基因合成獲得相關(guān)蛋白基因，并應(yīng)用微生物發(fā)酵技術(shù)，將基因工程菌株作用于發(fā)酵合 成，獲得的重組雞干擾素a是無毒、無害、無殘留的生物制品，對抑制病毒的復(fù)制和提高機(jī) 體免疫力方面有一定的功效，因此，有望將其應(yīng)用在禽類養(yǎng)殖業(yè)上，W期解決目前我國養(yǎng)殖 業(yè)中存在的部分問題，為我國禽類健康保駕護(hù)航，為食品安全提供綠色保障。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0045] 圖1為本發(fā)明的載體構(gòu)建示意圖；
[0046] 圖2為本發(fā)明祀T-21a(+)/化IFNa重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證電泳圖，其中；
[0047] M 為 DNA marker ;1-2 為祀T-21a(+)-ChIFNa/EcoR I /Sal I ;
[0048] 圖3為本發(fā)明的重組菌E. coli BL2UDE3)/pET-21a(+)-ChIFNa的蛋白表達(dá)電泳 圖，其中：
[0049] 泳道M為低分子量蛋白Marker ;泳道1為誘導(dǎo)前全菌裂解液；泳道2-3為誘導(dǎo)后 全菌裂解液；
[0050] 圖4為本發(fā)明的重組雞干擾素a蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖，其中：
[0化1] 泳道M為低分子量蛋白Marker ;泳道1、2為包涵體純化后的雞干擾素a蛋白。

【具體實(shí)施方式】
[0052] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。
[005引實(shí)施例1
[0化4] 一種重組雞干擾素a的制備方法，利用基因合成技術(shù)直接獲得雞干擾素a的 cDNA序列，應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，對雞干擾素a的化IFNa基因進(jìn)行高效表達(dá)，構(gòu)建包含 目的基因化IFN a的重組大腸桿菌，在IPTG的誘導(dǎo)下進(jìn)行發(fā)酵合成，最后通過提取、純化獲 得重組雞干擾素a的方法。本發(fā)明所用的目的基因是參照NCBI公布的雞干擾素a成熟 膚基因編碼序列（ACCESSION NUMB邸:DQ226094)合成的，本發(fā)明中重組載體的宿主細(xì)胞為 大腸桿菌化21 0E3)。所構(gòu)建的重組表達(dá)載體不僅包括編碼酶的DNA序列，還具有表達(dá)該基 因所需的控制元件。
[0化5] 具體構(gòu)建方法的步驟如下：
[0化6] 1、重組雞干擾素a基因的合成
[0化7] 參照雞干擾素a成熟膚基因編碼序列（ACCESSION NUMBER:DQ226094)，使用在 線優(yōu)化軟件重新優(yōu)化序列，替換稀有密碼子，調(diào)節(jié)AT含量，使其可在大腸桿菌化21 0E3) 中高效表達(dá)，然后將該優(yōu)化的基因序列交給上海英濰捷基公司合成，合成后的序列克隆至 pMDlS-T 載體。
[0化引 2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0化9] (1)將合成得到的含有雞干擾素a的化IFNa基因的菌株活化，利用質(zhì)粒小提試 劑盒提取D冊a/pMD18-T-ChIFNa的質(zhì)粒，pMD18-T-ChIFNa和祀T-21a(+)質(zhì)粒分別用 EcoR I和Sal I進(jìn)行雙酶化然后電泳、切膠回收酶切后的質(zhì)粒和目的基因，用DNA純化試 劑盒（TaKafe公司）對上述酶切后的片段進(jìn)行純化。所獲得的線性純化的祀T-21a(+)和 目的基因化IFNa即可用來構(gòu)建重組質(zhì)粒，載體構(gòu)建示意圖如圖1所示。
[0060] 似酶切后的載體pET-21a(+)和目的基因化IFNa在16°c下連接15h，所得連接 混合物采用DNA純化試劑盒（TaKaRa公司）進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大 腸桿菌D冊a。
[0061] 3、基因工程菌株的構(gòu)建：
[0062] (1)制備大腸桿菌D冊a的感受態(tài)細(xì)胞。將上述純化處理的連接產(chǎn)物化轉(zhuǎn)入大腸 桿菌D冊a感受態(tài)中，在含氨節(jié)青霉素濃度為100 y g/mL的LA平板上篩選轉(zhuǎn)化子。從平 板上挑取單一菌落，接種于含氨節(jié)青霉素濃度為100 y g/mL液體LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng) 1化，然后小量提取質(zhì)粒DNA，用EcoR I和Sal I進(jìn)行雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果見 圖2。
[0063] (2)制備大腸桿菌化21的感受態(tài)細(xì)胞。將酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒 pET-21a (+)-化IFN a化轉(zhuǎn)入大腸桿菌化21，得到含有雞干擾素a的重組工程菌 E. coli化2UDE3)/祀T21a(+)-ChIFNa。
[0064] 4、基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)：
[00化](1)從平板上挑取驗(yàn)證正確的單一菌落，接種于氨節(jié)青霉素（100 y g/mL)液體LB 培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)1化。
[0066] (2)按1 %的接種量接過夜培養(yǎng)物于50血含100 y g/mL氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基 中。
[0067] 做37°C振蕩培養(yǎng)，當(dāng)ODe。。為1左右時(shí)加入IPTG，終濃度至0. 5mM/血。
[0068] (4)在37°C下誘導(dǎo)化。誘導(dǎo)結(jié)束后1200化/min離屯、2min收集菌體，并將誘導(dǎo)前 后的菌體煮沸后進(jìn)行SDS-PA(iE電泳檢測蛋白的表達(dá)。
[0069] 巧)SDS-PAGE表達(dá)分析
[0070] ①凝膠制備，見下表1。
[0071] 表 1
[0072]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組雞干擾素 a，其特征在于：所述雞干擾素 a目的基因的CDNA為序列表 400〈1>所示序列，其蛋白活性的多肽氨基酸為序列表400〈2>所示序列。
2. 權(quán)利要求1所述的重組雞干擾素 a的制備方法，其特征在于：具體構(gòu)建步驟如下： (1) 獲取雞干擾素 a基因：參照雞干擾素 a成熟肽基因編碼序列，合成雞干擾素 a的 cDNA序列，該序列通過重新優(yōu)化，替換稀有密碼子，調(diào)節(jié)AT含量，可在大腸桿菌BL21 (DE3) 中尚效表達(dá)，優(yōu)化后的雞干擾素 a成熟狀的基因序列為序列表400〈1>所不序列； (2) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：用酶切連接的方法分別將上述雞干擾素 a基因與載體 pET-21a(+)相連，得到攜帶雞干擾素 a基因的重組表達(dá)載體pET-21a(+)/ChIFNa，并進(jìn)行 雙酶切驗(yàn)證； (3) 基因工程菌株的構(gòu)建：將上述驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌株BL21(DE3) 中，得到含有重組質(zhì)粒的基因工程菌株； (4) 重組蛋白的表達(dá)：發(fā)酵條件下使工程菌株在IPTG的誘導(dǎo)下合成雞干擾素 a蛋白； (5) 重組雞干擾素 a的發(fā)酵生產(chǎn)：制備發(fā)酵種子液，將種子液接入發(fā)酵罐中，通過補(bǔ)加 碳源和誘導(dǎo)劑使其大量生產(chǎn)雞干擾素 a，獲得的重組雞干擾素 a經(jīng)提取、純化后制成雞干 擾素 a產(chǎn)品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組雞干擾素 a的制備方法，其特征在于：所述步驟（2)中 所用的原核表達(dá)載體是大腸桿菌表達(dá)載體pET_21a，構(gòu)建載體宿主細(xì)胞是大腸桿菌DH5 a 菌株，表達(dá)宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組雞干擾素 a的制備方法，其特征在于：所述步驟（3) 中重組蛋白的表達(dá)：分別挑取與pET_21a表達(dá)載體連接的重組表達(dá)菌于含氨芐青霉素 100 y g/ml的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，在培養(yǎng)溫度為35?37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180?200r/min條件 下，培養(yǎng)至菌液OD值為1左右時(shí)，取出lmL菌液作為對照，剩下的部分加入終濃度為0. 5? 2mM/mL的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為4?6小時(shí)，誘導(dǎo)結(jié)束后12000r/min離心2?5min 收集菌體，并將誘導(dǎo)前后的菌體煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測重組雞干擾素 a蛋白的表 達(dá)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組雞干擾素 a的制備方法，其特征在于：所述步驟（5) 中重組雞干擾素 a的發(fā)酵生產(chǎn)包括：a.重組表達(dá)工程菌E. coliBL21(DE3)/pET21a(+)/ ChIFN a發(fā)酵種子液的制備；b.發(fā)酵菌體的培養(yǎng)階段；c.碳源飼喂階段；d.誘導(dǎo)表達(dá)階段； e.重組雞干擾素 a的提取、純化。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組雞干擾素 a的制備方法，其特征在于：所述LB培養(yǎng)基 的成分為蛋白胨l〇g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組雞干擾素 a的制備方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)基 的組成為：葡萄糖 5g/L、蛋白胨 5g/L、酵母粉 5g/L、KH2P042g/L、K2HP044g/L、Na 2HP04 ? 12H20 7g/L、（NH4)2S041.2g/L、NH4Cl 0.2g/L、MnS04.5H20 0.001g/L、CoCl2.6H20 0.004g/L、 Na2Mo04.2H20 0? 002g/L、ZnCl20. 002g/L、CuS04.5H20 0? 001g/L、H3B040. 005g/L、FeS04.7H20 0? 02g/L、CaCl ? 2H20 0? 02g/L、MgS04 ? 7H20 0? 3g/L、消泡劑 0? 2g/L。
【文檔編號(hào)】C12N15/21GK104447978SQ201410755900
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】王連民, 劉珂飛, 高應(yīng)瑞, 荊瑋 申請人:天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司