一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法，設計用于檢測靶核酸片段的功能化探針；將功能化探針修飾于功能化磁珠表面；通過雜交，將靶核酸片段及其發(fā)光標記物捕獲至磁珠表面；磁分離，清洗，即得到已獲取發(fā)光標記物的磁珠；加入核酸水解試劑，通過核酸水解將發(fā)光標記物從磁珠表面分離下來，即得到不含磁珠的發(fā)光標記物溶液；對該溶液進行發(fā)光檢測，即可獲取靶核酸信息。本發(fā)明完全克服了磁珠對發(fā)光信號的遮蔽效應導致的發(fā)光信號損失，能夠檢測出最少0.1pM核酸片段，檢測靈敏度高。
【專利說明】一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生化檢測和分子診斷領域，尤其涉及一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法。本發(fā)明可應用于涉及超靈敏核酸分子檢測的領域。

【背景技術】
[0002]近年來，由于惡性公共衛(wèi)生事件頻發(fā)，如1996年日本發(fā)生的大腸桿菌(E.coli)0157:H7食物中毒的暴發(fā)流行，引起數人死亡，超過萬人感染，造成巨大的社會恐慌；2003年SARS病毒在我國的肆虐；2005年豬鏈球菌的危害；近來禽流感病毒及2009年全世界范圍內流行的甲型HlNl流感病毒等，都對人們的健康和生命造成了嚴重的威脅。另外，致病微生物污染也是影響我國食品衛(wèi)生和安全的最主要因素，微生物性食物中毒導致的中毒人數最多，在2003年和2004年全國報告的重大食物中毒事故中，微生物性重大食物中毒起數和人數均有增加，分別占當年總起數和總人數的26%、43.8%和34%、58.1 %。食品在加工、運輸、貯藏、銷售等過程中極易受到致病微生物污染。有害致病微生物不僅影響人們的健康，危及人們的生命，而且引起全社會的恐慌，影響正常的社會運行。為了能快速準確地鑒定病原體，力求將病原體對人的危害降到最低，科學家們使用了很多種鑒定方法。傳統(tǒng)的微生物特征信息檢測方法有病原體的培養(yǎng)、生化分析、毒素測定、血清學(抗原或抗體)檢測等，但這些檢測方法不僅不適合快速偵檢，而且難以檢測和鑒定病原體中所含的多種信息，如致病基因、毒力基因、抗性基因等。雖然近年來也發(fā)展了 PCR技術及核酸探針雜交技術，但不能對微生物特征信息進行快速檢測、更不具備高通量篩查的能力。
[0003]惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病之一。世界衛(wèi)生組織和國際抗癌聯盟的相關資料顯示，如果不能有效控制惡性腫瘤的發(fā)病率，預計癌癥發(fā)病例在2020年將達到1600萬，近1000萬人死亡。我國每年新增癌癥患者約160萬人，其中因癌癥死亡人數約130萬人。導致癌癥患者死亡主要是因為無法及早發(fā)現從而貽誤治療時機以及腫瘤治愈率低，而早期發(fā)現與有效治療是預防和治療癌癥的關鍵手段。幾十年來，研宄者們發(fā)現，生物標志物可以用來進行腫瘤早期診斷，使得癌癥的治愈率、生存率大大提高。近年來，隨著微小RNA(microRNA, miRNA)的發(fā)現和進一步研宄，使其有可能作為新的生物標志物。已證實，miRNA在外周血中的表達具有腫瘤相關性、組織特異性以及表達穩(wěn)定性，外周血miRNA很可能是一種理想的腫瘤標志物，為癌癥的早期診斷開辟了新途徑。目前，外周血miRNA的檢測手段主要有miRNA芯片技術與實時熒光定量PCR技術。但二維的芯片技術使得核酸雜交效率低下，使得其檢測靈敏度相對偏低。而熒光定量PCR檢測miRNA需要設計復雜的莖環(huán)探針，以及進行擴增反應，使得其檢測成較高，亦無法實現自動化。
[0004]隨著納米技術的迅速發(fā)展，納米材料逐漸被應用到生命科學領域，納米磁珠(magnetic beads, MBs)因具有分離速度快、效率高、可重復使用、操作簡單、易功能化、易實現自動化以及不影響分離物質的活性等特殊的物理化學性質和生物相容性，目前已應用于細胞分離、免疫測定、蛋白質和酶的固定以及核酸檢測等方面。
[0005]近年來，發(fā)光標記類檢測方法，如熒光標記、酶標化學發(fā)光等已廣泛應用于生物分子檢測來放大檢測信號以提高檢測靈敏度。操作安全，方法簡便、快速，具有巨大的潛力，正成為生物分析研宄與發(fā)展的最重要領域。因此，結合核酸探針雜交技術，通過標記能夠產生發(fā)光信號的分子而獲取靶核酸信息，可實現病靶核酸的快速檢測與高通量篩查。
[0006]目前，已報道各種基于固相雜交與發(fā)光標記的核酸檢測方法。其基本思路為:在固相載體表面修飾核酸探針，通過捕獲標記有發(fā)光信號分子的待測特異核酸片段，再檢測發(fā)光信號，經分析后，即可快速確認靶核酸的特性。
[0007]但隨著研宄深入發(fā)現，影響基于磁珠與發(fā)光標記核酸檢測方法靈敏度的一個重要因素為:發(fā)光信號會由于磁珠的遮蔽作用而大大減弱一一靈敏度降低最高可達90%。但現有技術僅有熒光檢測法采用高溫使雙鏈核酸變性解鏈的方法分離熒光標記物，因為熒光標記物如熒光素(Cy3，Cy5)等可耐受高溫。但化學發(fā)光檢測法等的發(fā)光標記物無法通過高溫的方式達到此目的，因為化學發(fā)光標記物等無法耐受高溫，當高溫時會失活而無法繼續(xù)進行發(fā)光檢測。因此，研制出一種通用的基于磁珠與分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法，能夠極大地提高熒光、尤其是化學發(fā)光的檢測靈敏度，這對于疾病分子診斷、食品微生物監(jiān)測等具有重大意義。


【發(fā)明內容】

[0008]技術問題:本發(fā)明所要解決的主要技術問題是克服現有的基于磁珠與發(fā)光標記物的核酸檢測方法存在的檢測靈敏度受限問題，其原因是磁珠對光信號產生遮蔽效應，極大地減弱了發(fā)光信號強度。因此，提出一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法。
[0009]技術方案:本發(fā)明的一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法包括以下步驟:
[0010]I)設計用于檢測靶核酸片段的功能化探針；
[0011]2)將功能化探針修飾于功能化磁珠表面；
[0012]3)通過雜交，將靶核酸片段及其發(fā)光標記物捕獲至磁珠表面；
[0013]4)磁分離，清洗，即得到已獲取發(fā)光標記物的磁珠；
[0014]5)加入核酸水解試劑，通過核酸水解將發(fā)光標記物從磁珠表面分離下來，即得到不含磁珠的發(fā)光標記物溶液；
[0015]6)對該溶液進行發(fā)光檢測，即可獲取靶核酸信息。
[0016]其中:
[0017]步驟I)所述靶核酸片段為非擴增或經擴增后的核酸片段。所述功能化探針為:能夠與功能化磁珠以共價鍵、非共價鍵或物理吸附方式結合，并與靶核酸片段序列互補的寡核苷酸。
[0018]步驟2)所述功能化磁珠為:適合連接功能化探針，包括但不限于在磁珠表面以共價鍵、非共價鍵或物理吸附方式結合功能化探針。
[0019]步驟3)所述發(fā)光標記物為適用于分子檢測的能夠產生發(fā)光信號的分子，包括熒光標記物。
[0020]所述發(fā)光標記物為熒光素Cy3、Cy5,或發(fā)光標記物為堿性磷酸酶及其化學發(fā)光底物、辣根過氧化物酶及其化學發(fā)光底物。
[0021]所述發(fā)光標記物，其標記靶核酸的方式包括通過靶核酸擴增進行標記，以及通過報告探針與靶核酸片段雜交進行標記。
[0022]步驟5)所述核酸水解試劑為能夠水解核酸的化學或生物試劑，包括核酸水解酶如DNA酶、RNA酶、核酸內切酶或核酸外切酶。
[0023]步驟6)所述發(fā)光檢測為:基于分子標記的發(fā)光檢測體系，包括熒光、化學發(fā)光或其他波長的光。
[0024]有益效果:與現有技術相比，本發(fā)明具有以下特點:
[0025]將對應靶核酸片段的發(fā)光標記物從磁珠表面分離，進行發(fā)光檢測，完全避免了磁珠遮蔽效應，提高了發(fā)光信號強度。因此，本發(fā)明技術極大地提高了檢測靈敏度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]以下結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述:
[0027]圖1為一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法流程示意圖。
[0028]圖2為HBV核酸PCR擴增產物電泳圖。
[0029]圖3為HBV核酸的化學發(fā)光檢測動力曲線。

【具體實施方式】
[0030]本發(fā)明公布了一種利用磁珠易于磁分離的特性結合雜交以及核酸水解分離發(fā)光標記物的策略，對不含磁珠的發(fā)光標記物溶液進行發(fā)光檢測，獲取靶核酸信息的方法。在本發(fā)明的一個較佳的實例中，以Fe3O4OS12磁珠作為載體，在其表面修飾功能化探針，以生物素標記靶核酸片段，通過核酸雜交將帶生物素標記的靶核酸片段捕獲至磁珠表面，通過與親和素標記酶孵育使磁珠獲取對應靶核酸片段的酶分子，然后利用DNA酶水解核酸片段將對應靶核酸片段的酶分子從磁珠表面分離下來，最后進行化學發(fā)光檢測，獲取靶核酸信息。
[0031]其步驟如下:
[0032]1.在磁珠表面進行功能化修飾:(I)磁珠氨基化修飾:將ImL Fe3O4OS12磁珠(30mg/mL)磁分離，加入6mL乙醇/水混合液并超聲分散，然后取12 μ L氨丙基三乙氧基娃燒(aminopropyltriethoxysilane, APTES)加入上述混合液中，室溫振蕩攪拌7h。利用外加磁場將APTES修飾的磁性顆粒分離出來，用乙醇和二甲基甲酰胺(N, N-dimethylformamide, DMF)分別清洗數次，以5mg/mL分散在DMF中，備用；(2)磁珠羧基化修飾:取ImL氨基化磁珠(5mg/mL)，逐滴加入等體積DMF溶解的丁二酸酐溶液(succinicanhydride, SA, ImM)，37°C搖床振蕩12h。去離子水清洗數次，以10mg/mL分散在去離子水中。
[0033]2.設計用于檢測靶核酸片段的特異性引物及功能化探針，探針以3’端氨基修飾。探針修飾磁珠:將羧基化磁珠(10mg/mL)用等體積2_N_嗎啉代乙磺酸水合物溶液(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate, MES, 25mM, pH 6)清洗數次，磁分離棄上清，加入MES溶液稀釋的探針(2μΜ)到洗過的羧基化磁珠中，混勻后室溫旋轉孵育30min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的1_(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, EDC, 10mg/mL)至磁珠混合液中混勻，4°C下旋轉孵育2h以上。磁分離棄上清，加入Tris溶液(50mM，含0.1 % Tween-20, pH7.4)溶液孵育15min中和未反應羧基，再用Tris溶液清洗數次，最后分散在磷酸鹽緩沖溶液(PB，0.1Μ，ρΗ 7.4)中，即得到連有特異探針的功能化磁珠。
[0034]3.對靶核酸片段進行PCR擴增:反應體系為1XBuffer 2 μ L、Mg2+L 2 μ L、dNTPMix I μ L、上下游引物各I yL、DNA模板I μ L、Taq酶0.5 μ L、加入去離子水補足體積至20 μ L ;反應條件為 95°C 5min、95°C 30s,60°C 30s 72°C 30s，35 個循環(huán)。
[0035]4.核酸雜交:取30 μ L探針修飾磁珠(10mg/mL)于PCR管，磁分離棄上清，加入雜交液10 μ L、靶核酸片段PCR產物I μ L，加去離子水補足體積至20 μ L ;雜交反應條件為950C 5min、60°C 1min ;然后磁分離，對磁珠清洗數次，即得到已獲取靶核酸片段的磁珠。
[0036]5.發(fā)光標記物標記靶核酸片段:(I)通過PCR擴增進行標記:在步驟3中所述dNTPMix中加入b1tin-11-dUTP，其他同步驟3，然后進行步驟4 ； (2)通過核酸雜交標記:設計與靶核酸片段序列互補的報告探針，該報告探針末端修飾有發(fā)光標記物；步驟4完成后，進行第二次核酸雜交:將步驟4的雜交產物磁分離，棄上清，加入雜交液10 μ L、報告探針溶液I μ L，加入去離子水補足體積至20 μ L ;雜交反應條件為95°C 5min、60°C 1min ;然后磁分離，對磁珠清洗數次，即得到已獲取發(fā)光標記的磁珠。
[0037]6.加入適量核酸水解試劑至已獲取捕獲靶核酸片段及其發(fā)光標記物的磁珠懸液中孵育lOmin，用移液器獲取上清液，即得到不含磁珠的發(fā)光標記物溶液。
[0038]7.對發(fā)光標記溶液進行發(fā)光檢測，獲取靶核酸信息。
[0039]以下結合實例對本發(fā)明作進一步描述:
[0040]實施例1以乙肝病毒Ofepatitis B virus, HBV)DNA為對象進行檢測
[0041]1.在磁珠表面進行功能化修飾:(I)磁珠氨基化修飾:將ImL Fe3O4OS12磁珠(30mg/mL)磁分離，加入6mL乙醇/水混合液并超聲分散，然后取12 μ L氨丙基三乙氧基娃燒(aminopropyltriethoxysilane, APTES)加入上述混合液中，室溫振蕩攪拌7h。利用外加磁場將APTES修飾的磁性顆粒分離出來，用乙醇和二甲基甲酰胺(N, N-dimethylformami de, DMF)分別清洗數次，以5mg/mL分散在DMF中，備用；(2)磁珠羧基化修飾:取ImL氨基化磁珠(5mg/mL)，逐滴加入等體積DMF溶解的丁二酸酐溶液(succinicanhydride, SA, ImM)，37°C搖床振蕩12h。去離子水清洗數次，以10mg/mL分散在去離子水中。
[0042]2.設計一對能夠特異擴增HBV X基因序列的引物和與該序列互補配對的功能化探針，探針3 ’端以氨基修飾。引物序列如下:5 ’ -CCTCTACCGTCCCCTTCTTCA-3 ’、5 ’ -ACGTGCAGAGGTGAAGCGAAG-3 ’ ；探針序列如下:5 ‘ -CACTTCGCTTCACCTCTGCACGTA- (T) 15_NH2-3，。
[0043]3.探針修飾磁珠:將羧基化磁珠(lOmg/mL)用等體積2_N_嗎啉代乙磺酸水合物溶液(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate, MES, 25mM, pH 6)清洗數次，磁分離棄上清，加入MES溶液稀釋的探針(2μΜ)到洗過的羧基化磁珠中，混勻后室溫旋轉孵育30min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的1_(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, EDC, 10mg/mL)至磁珠混合液中混勻，4°C下旋轉孵育2h以上。磁分離棄上清，加入Tris溶液(50mM，含0.1 % Tween-20, pH7.4)溶液孵育15min中和未反應羧基，再用Tris溶液清洗數次，最后分散在磷酸鹽緩沖溶液(PB，0.1M, pH7.4)中，即得到連有特異探針的功能化磁珠。
[0044]4.對靶核酸片段進行PCR擴增:反應體系為1XBuffer 2 μ L、Mg2+L 2 μ L、dNTPMix (dATP:dCTP:dGTP:dTTP:b1tin-11-dUTP = 25:25:25:23:2) I μ L、上下游引物各 I μ L、DNA模板I yL、Taq酶0.5 yL、加去離子水補足體積至20 yL ;反應條件為95 °C 5min、95°C 30s,60°C 30s 72°C 30s，35個循環(huán)。圖2為HBV核酸PCR擴增產物電泳圖，靶核酸片段條帶單一，證明擴增成功。
[0045]5.核酸雜交:取30 μ L探針修飾磁珠(10mg/mL)于PCR管，磁分離，棄上清，加入雜交液10 μ L、PCR產物I μ L，加去離子水補足體積至20 μ L ;雜交反應條件為95°C 5min、60°C 20min ;然后磁分離，對磁珠清洗數次，即得到已獲取帶發(fā)光標記的靶核酸片段的磁珠。
[0046]6.化學發(fā)光檢測:磁珠液磁分離后吸去上清，加入封閉液混勻后室溫放置30min，期間不斷混勻。磁分離吸去上清，加入封閉液稀釋堿性磷酸酶標記鏈霉親和素(alkalinephosphatase labeled streptavidin, ALP-SA)，混勾后室溫孵育 30min。磁分離后清洗數次，然后加入DNA酶2 yL孵育lOmin，用移液器轉移上清液，將上清液與磁珠分開，然后在上清液與磁珠中分別加入0.25mM化學發(fā)光底物3-(2’ -螺旋金剛烷)_4_甲氧基_4_(3”_羥基)苯-1，2- 二氧雜環(huán)丁燒磷酸(3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3”-phosphoryloxy) phenyl-1, 2-d1xetane, AMPPD)。充分混勾后測定化學發(fā)光強度值至其穩(wěn)定，平行測定3次。以未加入DNA酶的發(fā)光檢測結果作為對照。
[0047]化學發(fā)光檢測結果如圖3所示。測得的發(fā)光值說明去除磁珠遮蔽效應后，化學發(fā)光信號顯著提升，相對于未超聲對照組提高到7倍左右。能夠檢測出最少0.1pM核酸片段。重復三次實驗，結果穩(wěn)定。即加入DNA酶孵育的化學發(fā)光檢測獲取的HBV核酸信息靈敏度顯著高于未加入DNA酶對照組的檢測結果。
[0048]實施例2:以血清miR-21為對象進彳丁檢測
[0049]1.在磁珠表面進行功能化修飾:同實施例1中所述在磁珠表面進行功能化修飾的方法。
[0050]2.設計與miR-21序列互補配對的功能化捕獲探針與報告探針，捕獲探針3’端以氨基修飾，報告探針5’端以生物素修飾。探針序列如下:5’ -CTGATAAGCTA-(T) 15-NH2-3’、5’ -B1tin-(T)15-TCAACATCAG-3’。
[0051]3.在磁珠表面修飾捕獲探針:將羧基化磁珠(5mg/mL)用等體積2-N-嗎啉代乙磺酸水合物溶液(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate, MES, 25mM, pH 6)清洗數次，磁分離棄上清，加入MES溶液稀釋的探針(ΙμΜ)到洗過的羧基化磁珠中，混勻后室溫旋轉孵育30min，立刻加入冷的用MES溶液溶解的1_(3_ 二甲基氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, EDC, 10mg/mL)至磁珠混合液中混勻，4°C下旋轉孵育2h以上。磁分離棄上清，加入Tris溶液(50mM，含0.1 % Tween-20, pH7.4)溶液孵育15min中和未反應羧基，再用Tris溶液清洗數次，最后分散在磷酸鹽緩沖溶液(ΡΒ，0.1Μ，ρΗ 7.4)中，即得到連有捕獲探針的功能化磁珠。
[0052]4.第一次核酸雜交:(I)取30 μ L捕獲探針修飾磁珠(10mg/mL)于PCR管，磁分離，棄上清，加入雜交液10 μ L、PCR產物I μ L，加去離子水補足體積至20 μ L ;雜交反應條件為950C 5min、60°C 20min ;然后磁分離，對磁珠清洗數次，即得到已獲取miR-21片段的磁珠。
[0053]5.第二次核酸雜交:磁分離，棄上清，加入雜交液10 μ L、報告探針溶液I UL，加入去離子水補足體積至20 μ L ;雜交反應條件為95°C 5min、60°C 1min ;然后磁分離，對磁珠清洗數次，即得到已獲取帶發(fā)光標記物的miR-21片段的磁珠。
[0054]6.化學發(fā)光檢測:同實施例1所述化學發(fā)光檢測的方法。
[0055]化學發(fā)光檢測結果表明，miR-21檢測的有益效果同實施例1，故不贅述。
【權利要求】
1.一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 1)設計用于檢測靶核酸片段的功能化探針； 2)將功能化探針修飾于功能化磁珠表面； 3)通過雜交，將靶核酸片段及其發(fā)光標記物捕獲至磁珠表面； 4)磁分離，清洗，即得到已獲取發(fā)光標記物的磁珠； 5)加入核酸水解試劑，通過核酸水解將發(fā)光標記物從磁珠表面分離下來，即得到不含磁珠的發(fā)光標記物溶液； 6)對該溶液進行發(fā)光檢測，即可獲取靶核酸信息。
2.根據權利要求1所述的一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法，其特征在于，步驟I)所述靶核酸片段為非擴增或經擴增后的核酸片段。
3.根據權利要求1所述的一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法，其特征在于，步驟I)所述功能化探針為:能夠與功能化磁珠以共價鍵、非共價鍵或物理吸附方式結合，并與靶核酸片段序列互補的寡核苷酸。
4.根據權利要求1所述的一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法，其特征在于，步驟2)所述功能化磁珠為:適合連接功能化探針，包括但不限于在磁珠表面以共價鍵、非共價鍵或物理吸附方式結合功能化探針。
5.根據權利要求1所述的一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法，其特征在于，步驟3)所述發(fā)光標記物為適用于分子檢測的能夠產生發(fā)光信號的分子，包括熒光標記物。
6.根據權利要求1所述的一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法，其特征在于所述發(fā)光標記物為熒光素Cy3、Cy5，或發(fā)光標記物為堿性磷酸酶及其化學發(fā)光底物、辣根過氧化物酶及其化學發(fā)光底物。
7.根據權利要求1所述的一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法，其特征在于所述發(fā)光標記物，其標記靶核酸的方式包括通過靶核酸擴增進行標記，以及通過報告探針與靶核酸片段雜交進行標記。
8.根據權利要求1所述的一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法，其特征在于，其中步驟5)所述核酸水解試劑為能夠水解核酸的化學或生物試劑，包括核酸水解酶如DNA酶、RNA酶、核酸內切酶或核酸外切酶。
9.根據權利要求1所述的一種基于磁珠與核酸水解分離發(fā)光標記物的核酸檢測方法，其特征在于，步驟6)所述發(fā)光檢測為:基于分子標記的發(fā)光檢測體系，包括熒光、化學發(fā)光或其他波長的光。
【文檔編號】C12Q1/70GK104498600SQ201410755917
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權日:2014年12月10日
【發(fā)明者】何農躍, 楊淏文, 李智洋, 蘇恩本 申請人:東南大學