本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域的基因融合表達(dá)，具體涉及一種融合雞λ、α干擾素基因及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

干擾素(interferon,IFN)是一種在特定的誘導(dǎo)劑作用下，宿主細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的細(xì)胞因子，其本質(zhì)為分泌性多功能糖蛋白。1957年被英國(guó)科學(xué)家lsaacs研究病毒間相互作用時(shí)首次發(fā)現(xiàn)，其本質(zhì)為蛋白質(zhì)，由病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生，干擾病毒復(fù)制，限制病毒感染。根據(jù)干擾素來(lái)源，氨基酸序列及生物活性不同，干擾素被分為三大類，分別為Ⅰ型干擾素，包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-κ、IFN-ω和IFN-τ，其中IFN-α與IFN-β的研究比較成熟；Ⅱ型干擾素為IFN-γ，但其功能主要為調(diào)節(jié)免疫功能，抗病毒效應(yīng)不強(qiáng)；Ⅲ型干擾素包括IFN-λ1(IL-29),IFN-λ2(IL-28A)，IFN-λ3(IL-28B)與2013年新發(fā)現(xiàn)的IFN-λ4。IFN-α屬于Ⅰ型干擾素,由582個(gè)核酸構(gòu)成，除去93個(gè)信號(hào)肽后，共編碼162個(gè)氨基酸。不同種雞IFN-α間相對(duì)保守，核苷酸同源性在99.3％以上。能夠在大部分細(xì)胞中被病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生，雖然不直接作用于病毒粒子，但由于其能很快誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，所以一直以來(lái)Ⅰ型干擾素都是研究熱點(diǎn)之一。研究表明雞IFN-α能夠抑制H5N1病毒繁殖，同時(shí)對(duì)新城疫疫苗免疫也有一定影響。IFN-λ(interferonλ)，又稱Ⅲ型干擾素，是繼干擾素Ⅰ，Ⅱ之后發(fā)現(xiàn)的一類新型干擾素。通過(guò)與其特異性異二聚體復(fù)合受體(IFN-λR1/IL-10R2)結(jié)合，激活JAK-STAT信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。由于其受體特異性，導(dǎo)致IFN-λ有著不同于Ⅰ型干擾素的其他優(yōu)勢(shì)，人IFN-λ的研究日益增多，但對(duì)雞IFN-λ的研究尚淺，少量研究表明雞IFN-λ在氣管環(huán)實(shí)驗(yàn)中可抑制流感病毒的增殖。目前尚無(wú)將這兩個(gè)雞干擾素串聯(lián)表達(dá)并檢測(cè)其抗病毒活性的例子。

新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒引起的雞和多種禽類發(fā)病的急性高度接觸性傳染病。該病的主要發(fā)病特征為呼吸困難、神經(jīng)紊亂、下痢、粘膜和漿膜出血。由于新城疫毒株不同，新城疫患病動(dòng)物的嚴(yán)重程度有很大差異。該病傳播迅速，死亡率很高，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)，對(duì)世界經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)兩種干擾素的缺陷，實(shí)現(xiàn)兩種干擾素的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。本發(fā)明所述的雞干擾素IFN-λ與IFN-α的融合蛋白生產(chǎn)簡(jiǎn)便，成本低，活性高，對(duì)新城疫和流感有良好的治療效果。

本發(fā)明的第一目的是提供上述雞IFN-λ與IFN-α融合蛋白。

本發(fā)明的另一目的是提供該融合蛋白的生產(chǎn)方法和原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IFNλ-linker-IFNα的制備方法。

本發(fā)明的再一目的是提供該融合蛋白在細(xì)胞上抑制病毒繁殖和在臨床上治療動(dòng)物病毒性疫病的應(yīng)用和效果。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種雞IFN-λ與IFN-α融合基因(IFNλ-linker-IFNα)，其核苷酸序列如下：

CAGGTCACCCCGAAGAAGAGCTGCAGCCTCTCCAAGTACCAGTTCCCTGCACCTTTGGAGTTGAAGGCAGTGTGGAGGATGAAGGAGCAGTTTGAAGACATCATGCTGTTAACAAACAGAAAATGCAACACCAGACTCTTCCATCGGAAGTGGGACATAGCTGAGCTGTCGGTACCTGACCGAATCACCCTGGTGGAGGCTGAGCTGGACCTCACCATCACCGTGCTCACAAACCCCACAACCCAGAGACTGGCAGAGACGTGCCAACAGCCCCTGGCCTTCCTTACCCAAGTCCAGGAGGACCTGCGAGACTGCTTGGCCCTCGAGGCACCTTCACATCAGCCCTCTGGGAAACTGAGGCACTGGCTGCAGAAGCTGGAGACAGCCAAGAAGAAGGAGACCGCCGGCTGCCTGGAGGCCTCAGCCATCCTCCACATCTTCCAAGTACTGAACGACCTGCGGTGCGCAGCCCAGCGCGAGGATTGCACTTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTGCAACCACCTTCGCCCCCAGGATGCCACCTTCTCTCACGACAGCCTCCAGCTCCTCCGGGACATGGCTCCCACACTACCCCAGCTGTGCCCACAGCACAACGCGTCTTGCTCCTTCAACGACACCATCCTGGACACCAGCAACACCCGGCAAGCCGACAAAACCACCCACGACATCCTTCAGCACCTCTTCAAAATCCTCAGCAGCCCCAGCACTCCAGCCCACTGGAACGACAGCCAACGCCAAAGCCTCCTCAACCGGATCCACCGCTACACCCAGCACCTCGAGCAATGCTTGGACAGCAGCGACACGCGCTCCCGGACGCGATGGCCTCGCAACCTTCACCTCACCATCAAAAAACACTTCAGCTGCCTCCACACCTTCCTCCAAGACAACGATTACAGCGCCTGCGCCTGGGAACACGTCCGCCTGCAAGCTCGTGCCTGGTTCCTGCACATCCACAACCTCACAGGCAACACGCGCACTTAG

以上所述雞IFN-λ與IFN-α融合基因是通過(guò)重疊延伸PCR法(gene splicing by overlapextension，SOE-PCR)融合而成，分別將兩個(gè)干擾素基因擴(kuò)增出來(lái)之后，除去信號(hào)肽，再通過(guò)疏水性柔性氨基酸接頭(linker)(G4S)3將雞IFN-λ與IFN-α連接，克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+)，通過(guò)BL21系統(tǒng)表達(dá)及純化后，分別在體內(nèi)與體外檢測(cè)其抗病毒活性。

上述雞IFN-λ與IFN-α融合基因是通過(guò)以下步驟獲得：

(1)引物設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)是根據(jù)Genbank提供的雞IFN-λ的基因序列(GenBank no.KF680102.1)與IFN-α的基因序列(GenBank no.AM049251.1)，通過(guò)SignalP預(yù)測(cè)并除去信號(hào)肽，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別在上下游插入EcoR1與Hind3兩個(gè)酶切位點(diǎn)，為IFN-λ-F,IFN-λ-R1，IFN-α-F1，IFN-α-R。然后分別在IFN-λ的下游以及IFN-α上游設(shè)計(jì)2個(gè)含有互補(bǔ)疏水性柔性氨基酸接頭的引物IFN-λ-R2與IFN-α-F2。序列如下：

IFN-λ-F：CCGGAATTCCAGGTCACCCCGAAGAA

IFN-λ-R1：CCCAAGCTTCTAAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

IFN-λ-R2：

CTCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

IFN-α-F1：CCGGAATTCTGCAACCACCTTC

IFN-α-F2：

TCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTGCAACCACCTTC

IFN-α-R：CCCAAGCTTCTAAGTGCGCGTGTTGCC

(2)基因克隆與鑒定

用SPF雞胚自制雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞，使用新城疫GM毒株攻毒后，抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)得到擴(kuò)增雞IFN-λ與IFN-α基因的模板cDNA，使用IFN-λ-F,IFN-λ-R1，IFN-α-F1，IFN-α-R引物擴(kuò)增出雞IFN-λ與IFN-α去信號(hào)肽的基因片段。

接下來(lái)用SOE-PCR方法將雞IFN-λ與IFN-α基因融合：第一步，分別用IFN-λ-F,IFN-λ-R2與IFN-α-F2，IFN-α-R引物擴(kuò)增出含有l(wèi)inker的兩個(gè)基因片段；第二步，以第一步膠回收產(chǎn)物為模板，不加引物，PCR擴(kuò)增10-15個(gè)循環(huán)；第三步，以第二步PCR產(chǎn)物為模板，用IFN-λ-F和IFN-α-R擴(kuò)增PCR，得到的產(chǎn)物即雞IFN-λ與IFN-α基因片段。

一種雞IFN-λ與IFN-α融合蛋白(chIFN-λ+α)原核表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)將融合基因克隆至pMD-19T載體

將雞IFN-λ與IFN-α融合基因連接至pMD-19T載體，16℃連接4h以上，轉(zhuǎn)化至含氨芐瓊脂平板，挑取單克隆菌放入LB培養(yǎng)基中搖菌，菌液PCR鑒定出陽(yáng)性克隆，測(cè)序正確后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pMD-19T-chIFN-λ+α。

(2)pET32a-chIFN-λ+α重組質(zhì)粒構(gòu)建

分別將pMD-19T-chIFN-λ+α與pET32a空載體用EcoR1與Hind3快切酶雙酶切，膠回收后用T4連接酶，常溫連接30min以上，轉(zhuǎn)化至含氨芐瓊脂平板，挑取單克隆菌放入LB培養(yǎng)基中搖菌，菌液PCR鑒定出陽(yáng)性克隆，測(cè)序正確后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pET32a-chIFN-λ+α。

本發(fā)明采用基因工程方法融合雞IFN-λ與IFN-α，有以下有益效果：

(1)本發(fā)明利用Ⅰ、Ⅲ型干擾素的受體分布差異規(guī)律，利用基因工程方法將兩者融合，有利于更高水平綜合發(fā)揮兩個(gè)干擾素的效果；

(2)本發(fā)明成功在包涵體中提取chIFN-λ+α融合蛋白，經(jīng)變性、復(fù)興、純化后，能提取出較高濃度蛋白，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下良好的基礎(chǔ)。；

(3)本發(fā)明提取的融合蛋白chIFN-λ+α在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中均有良好的抗病毒效果。

附圖說(shuō)明

圖1為PCR擴(kuò)增的雞IFN-λ基因瓊脂糖核酸電泳圖；其中，泳道M為DNA marker DL2000，泳道1為陰性對(duì)照，泳道2為chIFN-λ基因擴(kuò)增結(jié)果。

圖2為PCR擴(kuò)增的雞IFN-α基因瓊脂糖核酸電泳圖；其中，泳道M為DNA marker DL5000，泳道1，2為chIFN-α基因擴(kuò)增結(jié)果，泳道3為陰性對(duì)照。

圖3為SOE-PCR擴(kuò)增的chIFN-λ+α基因瓊脂糖核酸電泳圖；其中，泳道M為DNA marker DL2000，泳道1為chIFN-λ+α基因擴(kuò)增結(jié)果，泳道2為陰性對(duì)照。

圖4為SDS-PAGE鑒定chIFN-λ+α蛋白表達(dá)結(jié)果圖；其中，泳道M為低分子量蛋白Marker，泳道1為pET-32a空載體對(duì)照，泳道2為chIFN-λ+α上清，泳道3為chIFN-λ+α包涵體沉淀。

圖5為Western blot鑒定chIFN-λ+α蛋白表達(dá)結(jié)果圖；其中，泳道M為低分子量蛋白Marker，泳道1為pET-32a空載體對(duì)照，泳道2為chIFN-λ+α上清，泳道3為chIFN-λ+α包涵體沉淀。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但本發(fā)明并不限于此。

實(shí)施例1雞IFN-λ與IFN-α(chIFN-λ+α)融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)相關(guān)引物設(shè)計(jì)與合成

引物設(shè)計(jì)是根據(jù)Genbank提供的雞IFN-λ的基因序列(GenBank no.KF680102.1)與IFN-α的基因序列(GenBank no.AM049251.1)，通過(guò)SignalP預(yù)測(cè)并除去信號(hào)肽，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別在上下游插入EcoR1與Hind3兩個(gè)酶切位點(diǎn)，為IFN-λ-F,IFN-λ-R1，IFN-α-F1，IFN-α-R。然后分別在IFN-λ的下游以及IFN-α上游設(shè)計(jì)2個(gè)含有互補(bǔ)疏水性柔性氨基酸接頭的引物IFN-λ-R2與IFN-α-F2。序列如下：

IFN-λ-F：CCGGAATTCCAGGTCACCCCGAAGAA

IFN-λ-R1：CCCAAGCTTCTAAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

IFN-λ-R2：

CTCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

IFN-α-F1：CCGGAATTCTGCAACCACCTTC

IFN-α-F2：

TCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTGCAACCACCTTC

IFN-α-R：CCCAAGCTTCTAAGTGCGCGTGTTGCC

(2)基因克隆與鑒定

取10日齡SPF雞胚，用鑷子去除頭、四肢和內(nèi)臟，將雞肉剪碎后胰酶消化4min,過(guò)濾，制成CEF細(xì)胞，傳代一次之后，使用新城疫GM毒株攻毒，12h后，抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)得到擴(kuò)增雞IFN-λ與IFN-α基因的模板cDNA，使用IFN-λ-F,IFN-λ-R1，IFN-α-F1，IFN-α-R引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：25μl Premix ExTaq酶，2.5μl模板DNA(cDNA)，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，蒸餾水補(bǔ)至50μl。反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性4min,94℃變性1min,55℃退火30s,72℃延伸40s,72℃延伸7min，其中第2至第4步35個(gè)循環(huán)。核酸電泳條帶大小分別約561bp與582bp。

用SPF雞胚自制雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞，使用新城疫GM毒株攻毒后，抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)得到擴(kuò)增雞IFN-λ與IFN-α基因的模板cDNA，使用IFN-λ-F,IFN-λ-R1，IFN-α-F1，IFN-α-R引物擴(kuò)增出雞IFN-λ與IFN-α去信號(hào)肽的基因片段。

接下來(lái)用SOE-PCR方法將雞IFN-λ與IFN-α基因融合：第一步，分別用IFN-λ-F,IFN-λ-R2引物擴(kuò)增出含有l(wèi)inker的IFN-λ-linker片段，用IFN-α-F2，IFN-α-R引物擴(kuò)增出含有l(wèi)inker的linker-IFN-α片段，將兩者分別膠回收；第二步，以第一步膠回收產(chǎn)物為模板，等摩爾混合，不使用引物，PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：10μl Premix ExTaq酶，8.4μl蒸餾水，第一步膠回收產(chǎn)物等摩爾混合共1.6μl，反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性4min,94℃變性1min,60℃退火30s,72℃延伸40s,72℃延伸7min，其中第2至第4步15個(gè)循環(huán)；第三步，以第二步PCR產(chǎn)物為模板，用IFN-λ-F和IFN-α-R擴(kuò)增PCR，得到的產(chǎn)物即chIFN-λ+α基因片段。

(3)將融合基因克隆至pMD-19T載體

將chIFN-λ+α融合基因連接至pMD-19T載體，反應(yīng)體系如下：5.0μl Ligation SolutionⅠ，0.5μl pMD 19-T vector，4.5μl chIFN-λ+αPCR回收產(chǎn)物。16℃連接4h以上，用DH5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化至含氨芐瓊脂平板，37℃放置過(guò)夜，挑取單克隆菌放入含氨芐LB培養(yǎng)基中搖菌6-8h，菌液PCR鑒定出陽(yáng)性克隆，反應(yīng)體系如下：7.5μl Premix rTaq酶,6.1μl ddH₂O，0.2μl上游引物IFN-λ-F，0.2μl下游引物IFN-α-R，1.0μl菌液，反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性4min,94℃變性1min,55℃退火30s,72℃延伸40s,72℃延伸7min，其中第2至第4步30個(gè)循環(huán)。挑選鑒定陽(yáng)性樣品送測(cè)序，測(cè)序正確后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒

pMD-19T-chIFN-λ+α。

(4)pET32a-chIFN-λ+α重組質(zhì)粒構(gòu)建

分別將pMD-19T-chIFN-λ+α與pET32a空載體用EcoR1與Hind3快切酶雙酶切，反應(yīng)體系如下：1.5μl EcoR1酶，1.5μl Hind3酶，5μl 10×Buffer,2-5μg質(zhì)粒，ddH₂O補(bǔ)至50μl，37℃水浴30min。膠回收后用T4連接酶，酶切產(chǎn)物按照pMD-19T-chIFN-λ+α：pET32a空載體＝3:1的比例加入8μl，1μl T4連接酶，1μl T4連接Buffer，常溫連接30min以上，轉(zhuǎn)化至含氨芐瓊脂平板，挑取單克隆菌放入含氨芐LB培養(yǎng)基中搖菌，菌液PCR鑒定出陽(yáng)性克隆，送測(cè)序，測(cè)序正確后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pET32a-chIFN-λ+α。

實(shí)施例2蛋白表達(dá)與鑒定

將重組質(zhì)粒pET32a-chIFN-λ+α用BL21感受態(tài)轉(zhuǎn)化，單克隆菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照1:100比例接種氨芐LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)，直至OD600nm值為0.6左右時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，菌液離心，棄上清，PBS重懸、離心清洗2次后，超聲破碎儀200W裂解15min，4℃離心分離出沉淀，用預(yù)冷PBS清洗2次，用含8M尿素的Lysis Equilibration Buffer溶解包涵體，室溫孵育60min，4℃離心出去不溶雜質(zhì)，上清用0.45μm濾器過(guò)濾，將其與Ni柱結(jié)合，用不同濃度咪唑洗脫液洗脫直至OD280值為0，最后用含有250mmol/L咪唑的Elution Buffer洗脫，收集濾液。將濾液放入用EDTA處理過(guò)的透析袋中，分別用8M,6M,4M,2M,0M,PBS進(jìn)行梯度透析，每次間隔12h，最后用SDS-PAGE鑒定。

實(shí)施例3體外抗病毒活性鑒定

將DF-1細(xì)胞鋪板至96孔板細(xì)胞板，待長(zhǎng)至80％-90％，將chIFN-λ+α以4倍梯度稀釋100μl加入每孔，分別從4^-1-4^-10,，每個(gè)梯度24個(gè)重復(fù)，于37℃孵育12h，分別將100TCID50VSV,NDV,AIV病毒加入，100μl每孔，于37℃孵育1h，將病毒液棄掉，用PBS洗2次，換上2％血清DMEM，放于37℃48h，檢測(cè)病毒含量。結(jié)果顯示：chIFN-λ+α對(duì)DF-1細(xì)胞產(chǎn)生良好的保護(hù)能力，在體外DF-1細(xì)胞上有良好的VSV,NDV,AIV抗病毒活性，分別為3.2*10 ⁴IU/mg，4.6*10 ⁴IU/mg，1.5*10 ⁵IU/mg。

實(shí)施例4體內(nèi)抗病毒活性鑒定

在2周齡SPF雞上檢測(cè)chIFN-λ+α抗病毒活性。給2周齡SPF雞靜脈注射100μgchIFN-λ+α，4h后，以同樣的量再次進(jìn)行靜脈注射，再隔2h后注射攻新城疫病毒。之后1、3、5、7、9、11天采集咽拭子與泄殖腔拭子，普通雞胚接胚檢測(cè)排毒；每日觀察雞采食與精神狀況；記錄死亡情況。結(jié)果顯示：chIFN-λ+α組對(duì)SPF雞的保護(hù)率可達(dá)到25％,而攻毒對(duì)照組的存活率僅8％；此外，咽拭子與泄殖腔拭子結(jié)果顯示，chIFN-λ+α組與攻毒對(duì)照組比較，可推遲3-7d排毒，且排毒量明顯降低；chIFN-λ+α組的SPF雞采食正常，精神良好。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

一種雞干擾素IFN-λ與IFN-α的融合蛋白

（1） 雞IFN-λ+α基因

CAGGTCACCC CGAAGAAGAG CTGCAGCCTC TCCAAGTACC AGTTCCCTGC ACCTTTGGAG 60

TTGAAGGCAG TGTGGAGGAT GAAGGAGCAG TTTGAAGACA TCATGCTGTT AACAAACAGA 120

AAATGCAACA CCAGACTCTT CCATCGGAAG TGGGACATAG CTGAGCTGTC GGTACCTGAC 180

CGAATCACCC TGGTGGAGGC TGAGCTGGAC CTCACCATCA CCGTGCTCAC AAACCCCACA 240

ACCCAGAGAC TGGCAGAGAC GTGCCAACAG CCCCTGGCCT TCCTTACCCA AGTCCAGGAG 300

GACCTGCGAG ACTGCTTGGC CCTCGAGGCA CCTTCACATC AGCCCTCTGG GAAACTGAGG 360

CACTGGCTGC AGAAGCTGGA GACAGCCAAG AAGAAGGAGA CCGCCGGCTG CCTGGAGGCC 420

TCAGCCATCC TCCACATCTT CCAAGTACTG AACGACCTGC GGTGCGCAGC CCAGCGCGAG 480

GATTGCACTg gtggaggagg cTCTGGTGGA GGCGGTAGCG GAGGCGGAGG GTCGTGCAAC 540

CACCTTCGCC CCCAGGATGC CACCTTCTCT CACGACAGCC TCCAGCTCCT CCGGGACATG 600

GCTCCCACAC TACCCCAGCT GTGCCCACAG CACAACGCGT CTTGCTCCTT CAACGACACC 660

ATCCTGGACA CCAGCAACAC CCGGCAAGCC GACAAAACCA CCCACGACAT CCTTCAGCAC 720

CTCTTCAAAA TCCTCAGCAG CCCCAGCACT CCAGCCCACT GGAACGACAG CCAACGCCAA 780

AGCCTCCTCA ACCGGATCCA CCGCTACACC CAGCACCTCG AGCAATGCTT GGACAGCAGC 840

GACACGCGCT CCCGGACGCG ATGGCCTCGC AACCTTCACC TCACCATCAA AAAACACTTC 900

AGCTGCCTCC ACACCTTCCT CCAAGACAAC GATTACAGCG CCTGCGCCTG GGAACACGTC 960

CGCCTGCAAG CTCGTGCCTG GTTCCTGCAC ATCCACAACC TCACAGGCAA CACGCGCACT 1020

TAG 1023

（2） 雞IFN-λ基因

ATGGTATGCT ACGGGGTCAC AATTATTTTG GTGGGGACCC TGGGGTCCCT CCTGGTGGGT 60

GCCTTCCCCC AGGTCACCCC GAAGAAGAGC TGCAGCCTCT CCAAGTACCA GTTCCCTGCA 120

CCTTTGGAGT TGAAGGCAGT GTGGAGGATG AAGGAGCAGT TTGAAGACAT CATGCTGTTA 180

ACAAACAGAA AATGCAACAC CAGACTCTTC CATCGGAAGT GGGACATAGC TGAGCTGTCG 240

GTACCTGACC GAATCACCCT GGTGGAGGCT GAGCTGGACC TCACCATCAC CGTGCTCACA 300

AACCCCACAA CCCAGAGACT GGCAGAGACG TGCCAACAGC CCCTGGCCTT CCTTACCCAA 360

GTCCAGGAGG ACCTGCGAGA CTGCTTGGCC CTCGAGGCAC CTTCACATCA GCCCTCTGGG 420

AAACTGAGGC ACTGGCTGCA GAAGCTGGAG ACAGCCAAGA AGAAGGAGAC CGCCGGCTGC 480

CTGGAGGCCT CAGCCATCCT CCACATCTTC CAAGTACTGA ACGACCTGCG GTGCGCAGCC 540

CAGCGCGAGG ATTGCACTTA G 561

（3） 雞IFN-α基因

ATGGCTGTGC CTGCAAGCCC ACAGCACCCA CGGGGGTACG GCATCCTGCT GCTCACGCTC 60

CTTCTGAAAG CTCTCGCCAC CACCGCCTCC GCCTGCAACC ACCTTCGCCC CCAGGATGCC 120

ACCTTCTCTC ACGACAGCCT CCAGCTCCTC CGGGACATGG CTCCCACACT ACCCCAGCTG 180

TGCCCACAGC ACAACGCGTC TTGCTCCTTC AACGACACCA TCCTGGACAC CAGCAACACC 240

CGGCAAGCCG ACAAAACCAC CCACGACATC CTTCAGCACC TCTTCAAAAT CCTCAGCAGC 300

CCCAGCACTC CAGCCCACTG GAACGACAGC CAACGCCAAA GCCTCCTCAA CCGGATCCAC 360

CGCTACACCC AGCACCTCGA GCAATGCTTG GACAGCAGCG ACACGCGCTC CCGGACGCGA 420

TGGCCTCGCA ACCTTCACCT CACCATCAAA AAACACTTCA GCTGCCTCCA CACCTTCCTC 480

CAAGACAACG ATTACAGCGC CTGCGCCTGG GAACACGTCC GCCTGCAAGC TCGTGCCTGG 540

TTCCTGCACA TCCACAACCT CACAGGCAAC ACGCGCACTT AG 582

（4）IFN-λ-F

CCGGAATTCC AGGTCACCCC GAAGAA 26

（5）IFN-λ-R1

CCCAAGCTTC TAAGTGCAAT CCTCGCGCTG GGC 33

（6）IFN-λ-R2

CTCCGCTACC GCCTCCACCA GAGCCTCCTC CACCAGTGCA ATCCTCGCGC TGGGC 55

（7）IFN-α-F1

CCGGAATTCT GCAACCACCT TC 22

（8）IFN-α-F2

TCTGGTGGAG GCGGTAGCGG AGGCGGAGGG TCGTGCAACC ACCTTC 46

（9）IFN-α-R

CCCAAGCTTC TAAGTGCGCG TGTTGCC 27