本發(fā)明屬藥學領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及小分子化合物能夠通過非atp依賴的方式抑制fgfr1及其信號通路的激活，從而發(fā)揮良好的體內(nèi)外抗腫瘤效果。

背景技術(shù)：

fgfr1，即成纖維細胞生長因子受體1，是成纖維細胞生長因子(fgf)家族的一員，隸屬于酪氨酸受體激酶。大量研究證明fgfr1與多種腫瘤密切相關(guān)，如胃癌，在胃癌中，fgfr1的表達量與10年生存率及腫瘤遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)。如肺癌，研究表明，fgfr1的表達量可作為非小細胞肺癌的預(yù)后標志。如乳腺癌，染色體8p11-12區(qū)域(及fgfr1所在區(qū)域)的擴增可出現(xiàn)的10％的病人中。此外，前列腺癌、直腸癌、胰腺癌、口腔鱗狀細胞癌及腎細胞癌等多種腫瘤中均有fgfr1擴增的現(xiàn)象。因此，靶向fgfr1的抗腫瘤靶向治療一直是近年來靶向藥物研究的熱點，但目前尚未有fgfr1抑制劑上市。

到目前為止，大部分的fgfr1抑制劑都是通過競爭atp的結(jié)合位點來發(fā)揮抑制fgfr1的作用的，稱之為競爭性抑制劑。人基因組編碼的大約518種酪氨酸受體激酶均公用高度保守的atp結(jié)合域，這一特性導(dǎo)致競爭性抑制劑的靶向選擇性較差，具有較大的毒副作用。鑒于此，人們開始思考能否不通過競爭atp的結(jié)合位點發(fā)揮抑制激酶的作用，即非atp競爭性抑制劑。第一個靶向fgfr1的非atp競爭性抑制劑是arq069，隨后又有幾篇研究報道了非atp競爭性fgfr1抑制劑的抗腫瘤活性，對比atp競爭性抑制劑，非atp競爭性抑制劑確實具有更佳的靶向選擇性。

本發(fā)明人經(jīng)過長期和艱苦的研究實踐，借鑒之前非atp競爭性fgfr1抑制劑的結(jié)構(gòu)，設(shè)計合成新的非atp競爭性fgfr1抑制劑，它們具有抗腫瘤的藥理活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種非atp競爭性fgfr1抑制劑及其在制備抗腫瘤藥物及與腫瘤相關(guān)疾病的治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供一種用于治療腫瘤的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的非atp競爭性fgfr1抑制劑及其藥用輔料。

具體而言，本發(fā)明所述非atp競爭性fgfr1抑制劑為如下所述結(jié)構(gòu)的化合物或其可藥用鹽：

l16h50的分子式為c24h16cl2o2，化學名稱為：2e,2'e)-3,3'-(1,4-phenylene)bis(1-(2-chlorophenyl)prop-2-en-1-one)。

鑒于fgfr1在腫瘤中的重要性以及非atp競爭性抑制劑的優(yōu)點，非atp競爭性fgfr1抑制劑的研究漸漸成為新型fgfr1抑制劑研究的重要方向之一。我們課題組前期研究中，曾報道過多個非atp競爭性fgfr1抑制劑，包括a114、a117、aea4、aea25和l6123等。本發(fā)明中設(shè)計合成了一個新型的小分子fgfr1激酶抑制劑化合物l16h50，首先用激酶抑制試驗檢測了l16h50對fgfr1激酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)其對fgfr1激酶具有較好的抑制活性，其對激酶抑制活性的ic50為：3.8±2.7μm(詳情見實施例2)。用人工構(gòu)建高表達fgfr1的hek293細胞，證明了l16h50能劑量依賴地抑制fgf2誘導(dǎo)的fgfr1激活(詳情見實施例4)，在胃癌細胞系sgc7901中驗證了l16h50能劑量依賴地抑制fgf2誘導(dǎo)的fgfr1激活，并能抑制fgf2誘導(dǎo)的fgfr1下游蛋白(包括frs2α，akt，erk1/2及plcγ)的磷酸化(詳情見實施例4)。atp競爭性實驗可以用來檢測激酶抑制劑對激酶活性的抑制作用是否會受atp的濃度改變所影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著atp的濃度升高，l16h50對fgfr1激酶的抑制作用幾乎不變(詳情見實施例3)，因此該抑制劑為一種新型的非atp競爭性fgfr1激酶抑制劑。鑒于l16h50對fgfr1較好的抑制活性，進一步用分子對接的方法研究了l16h50與fgfr1的結(jié)合位點，結(jié)果表明l16h50能夠與fgfr1的ala-564、ser-565、gly-567及asp-641氨基酸殘基形成較穩(wěn)定的氫鍵(詳情見實施例5)。因此，本發(fā)明提供了一種新型的非atp競爭性的fgfr1激酶抑制劑。

fgfr1信號通路具有多種生物學功能，包括促進細胞生長、胚胎發(fā)育、創(chuàng)口愈合等。腫瘤細胞內(nèi)fgfr1異常高表達，會導(dǎo)致其介導(dǎo)的信號通路異常激活，其與腫瘤細胞的增殖、遷移、生存及血管形成等相關(guān)。大量研究表明fgfr1抑制劑在多種腫瘤中具有較好的抗腫瘤效果。因此，我們首先用mtt的方法檢測了l16h50對胃癌細胞生長的影響，l16h50能夠顯著地抑制胃癌細胞的生長，對sgc7901、bgc823及kato-iii這三株胃癌細胞的ic50分別是0.5±0.4μm、1.4±0.2μm和1.6±1.0μm(詳情見實施例4)，集落形成實驗的結(jié)果也表明l16h50能夠顯著地抑制sgc7901、bgc823及kato-iii細胞的集落形成能力(詳情見實施例7)。進一步研究了l16h50抑制胃癌細胞生長的機制，流式細胞術(shù)的結(jié)果表明l16h50能夠?qū)⒓毎芷谧铚趃2/m期，能明顯下調(diào)細胞中與g2/m期相關(guān)的周期蛋白cyclinb1和cdc2p34蛋白的水平(詳情見實施例8)。同時用流式細胞術(shù)和westernblot檢測了l16h50對胃癌細胞凋亡的影響，結(jié)果表明l16h50顯著地誘導(dǎo)了胃癌細胞的凋亡，上調(diào)促凋亡蛋白cleaved-parp的水平并下調(diào)了抗凋亡蛋白bcl-2的水平，而caspase-3/caspase-9檢測試劑盒的結(jié)果表明l16h50能夠增加caspase-3/caspase-9的活性(詳情見實施例9)。裸小鼠荷sgc7901異位瘤模型顯示，l16h50在動物體內(nèi)能顯著地抑制腫瘤的生長以及抑制fgfr1及其下游蛋白的激活(詳情見實施例10)。用急性毒性實驗評估l16h50的初步毒性，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，給藥組的體重無統(tǒng)計學差異，he染色發(fā)現(xiàn)兩組間重要器官的顯微結(jié)構(gòu)亦無顯著差異(詳情見實施例11)。

本發(fā)明所述小分子化合物l16h50可以應(yīng)用于制備與fgfr1高表達相關(guān)腫瘤的抗腫瘤藥物及與腫瘤相關(guān)疾病的治療藥物中，所述腫瘤疾病如下：乳腺癌、腎癌、膀胱癌、口腔癌、咽喉癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、卵巢癌、皮膚癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、腦腫瘤。

本發(fā)明還提供了一種用于治療腫瘤的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的以上所述小分子化合物或其可藥用鹽及其藥用輔料?！八幬锝M合物”指本發(fā)明所述小分子化合物或其可藥用鹽與現(xiàn)已上市的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，制備得到的防治腫瘤類藥物的組合物，已上市的抗腫瘤藥物包括各種細胞毒性藥物和靶向藥物。

本文中所用“藥用輔料”指藥學領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如：稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣/鎂、聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。

本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。所述藥物的制劑形式包括注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、軟膏劑、控釋或緩釋劑或納米制劑。本發(fā)明可以組合物的形式通過口服，鼻吸入、直腸或者腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。

附圖說明

圖1小分子化合物l16h50非atp競爭性地抑制fgfr1的激活。a.l16h50的結(jié)構(gòu)及其對fgfr1激酶抑制活性的半數(shù)抑制濃度(ic50)。b.將fgfr1高表達的hek-293t細胞(只表達fgfr1)鋪板，用無血清的dmem高糖培養(yǎng)基饑餓12小時后，更新培養(yǎng)液并加入各種濃度的受測化合物預(yù)處理1小時后，再加入40ng/mlfgf2刺激10分鐘。裂解蛋白，westernblot法檢測fgfr1的磷酸化水平。c.將sgc7901細胞鋪板，用無血清的rpmi-1640培養(yǎng)基饑餓12小時后，更新培養(yǎng)液并加入各種濃度的受測化合物預(yù)處理1小時后，再加入40ng/mlfgf2刺激10分鐘。裂解蛋白，westernblot法檢測fgfr1及其下游蛋白包括frs2α、akt、erk1/2及plcγ的磷酸化水平。d.l16h50的atp競爭性實驗。

圖2l16h50抑制胃癌細胞的生長。(a-c)細胞用不同濃度的化合物處理72小時，再用mtt法檢測細胞生存率。d.用集落形成實驗檢測l16h50對胃癌細胞集落形成能力的影響。

圖3l16h50將胃癌細胞周期阻滯在g2/m期。a和b.流式細胞術(shù)檢測不同濃度(1，5，10μm)的l16h50作用10小時后胃癌細胞周期分布的變化。c.westernblot法檢測不同濃度(1，5，10μm)的l16h50作用10小時后胃癌細胞中周期相關(guān)蛋白cyclinb1和cdc2p34水平的改變。三次重復(fù)實驗得到相同結(jié)論(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,vs0group)。

圖4l16h50誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。a-d流式細胞術(shù)檢測不同濃度(1，5，10μm)的l16h50和10μm的a114對胃癌細胞作用12小時后，對胃癌細胞凋亡情況的影響。e.caspase-3/caspase-9檢測試劑盒檢測10μm的l16h50和a114作用12小時后對胃癌細胞中caspase-3/caspase-9活性的影響。f-hwesternblot法不同濃度(1，5，10μm)的l16h50和10μm的a114作用12小時后胃癌細胞中bcl-2和cleaved-parp水平的變化。每個柱條為三次實驗的平均值和誤差值(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,vsdmsogroup)。

圖5l16h50的裸鼠體內(nèi)抗胃癌活性。a-d將7x10⁶的sgc7901細胞接種于裸鼠右肩區(qū)域以建立異位瘤模型，接種7天后開始腹腔注射給藥(10mg/kg受試藥：l16h50、azd4547)，開始給藥后每兩天測腫瘤長短徑及鼠重，給藥20天后處死小鼠，剝出腫瘤稱瘤重。e和f.westernblot法檢測腫瘤組織中fgfr1及其下游蛋白包括frs2α、akt及erk1/2的磷酸化水平。g.ihc檢測腫瘤組織中ki67和bcl-2的水平(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,vsvehiclegroup)。

圖6l16h50對icr小鼠的初步急性毒性作用。icr小鼠用vehicle(saline)或1g/kg的l16h50口服給藥后，連續(xù)14天每隔1天記錄體重(b)。14天后處死小鼠，取出重要臟器稱重(a)并用he染色了解臟器顯微結(jié)構(gòu)的變化(c)。

具體實施方式

本發(fā)明在以下的實施例中進一步說明。這些實施例只是為了說明本發(fā)明的目的，而不是用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1化合物的合成

將1mmol相應(yīng)的對苯二甲醛和2mmol取代苯乙酮溶于20ml左右的無水乙醇中，5-8℃下加入50％naoh溶液10-15滴，5-8℃反應(yīng)5-24h后，用tlc檢測反應(yīng)的進行。反應(yīng)完后，加入1-2倍反應(yīng)液體積的水，析出沉淀，過濾，真空干燥過夜后得粉末狀產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱色譜純化后得純度均大于98％的化合物。在合成的多個化合物中，藥理活性差別很大，有代表性的化合物及其理化性質(zhì)如下所述：

有效化合物(2e,2'e)-3,3'-(1,4-phenylene)bis(1-(2-chlorophenyl)prop-2-en-1-one)(l16h50)yellowpowder,90.2％yield,mp144.4～147.1℃.esi-msm/z:407.0(m+1)⁺calcdforc24h16cl2o2:407.29.¹h-nmr(dmso),δ:7.601(s,4h,h-2,h-3,h-4,h-6),7.426～7.515(m,8h,h-3’×2,h-4’×2，h-6’×2，h-β×2),7.376(t,j＝7.2hz,2h,h-5’×2),7.186(d,j＝15.6hz,2h,h-α×2).

無效化合物(2e,2'e)-3,3'-(1,4-phenylene)bis(1-(2-fluorophenyl)prop-2-en-1-one)(l15h50)earthyellowpowder,91.3％yield,mp133.8～135.1℃.esi-msm/z:374.9(m+1)⁺calcdforc24h16f2o2:374.38.¹h-nmr(dmso),δ:7.874(s,4h,h-2,h-3,h-5,h-6),7.814(m,j＝1.8hz,2h,h-4’,h-4’),7.724(dd,j＝15.6hz,2h,h-β×2),7.666(m,2h,h-5’,h-5’),7.545(dd,j＝15.2hz,2h,h-α×2),7.371(t,j＝7.2hz,2h,h-3’,h-3’),7.312(m,j＝2.4hz,8.4hz,2h,h-2’,h-2’).

無效化合物(2e,2'e)-3,3'-(1,4-phenylene)bis(1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one)(l20h50)brownpowder,70.2％yield,mp91.6～93.2℃.esi-msm/z:428.9(m-1)^-calcdforc26h22o6:430.45.¹h-nmr(dmso),δ:7.703(s,2h,h-6’×2),7.477(dd,j＝15.6hz,2h,h-α×2),7.451(dd,j＝15.6hz,2h,h-β×2),7.382(t,4h,h-2’×2,h-3’×2),7.260(s,3h,h-5’×2,h-2),7.163(d,3h,h-4,h-5,h-6),3.814(s,6h).

實施例2化合物對fgfr1激酶的抑制活性

采用caliperezreader藥物篩選平臺檢測化合物對fgfr1的激酶活性。將atp的濃度設(shè)置在fgfr1的km值，即262μmol/ml。為了檢測化合物對激酶抑制活性的ic50，將化合物稀釋成從5nmol/ml到100μmol/ml的10個濃度梯度。在遷移率檢測時，產(chǎn)物的積累量用轉(zhuǎn)化率＝a/(a+b)表示，a代表產(chǎn)物峰高度，b代表底物峰高度。l16h50對激酶抑制活性的ic50為：3.8±2.7μm；而對照化合物l15h50和l20h50在100μmol/ml濃度下，對fgfr1激酶的抑制率分別為19.5％、15.8％，可以認為兩者均不是fgfr1激酶抑制劑。

實施例3l16h50以非atp競爭性方式抑制fgfr1激酶活性

l16h50為一種全新型的fgfr1激酶抑制劑，為了探究其對fgfr1激酶的抑制模式，測定了其與atp的競爭關(guān)系。具體方法：首先固定底物的濃度(相對激酶來說是足量的濃度)，然后加入一定量的激酶，再分別加入不同濃度的atp(5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125和39.0625μmol/ml)和化合物(l16h50：100、50、25、13、6.5、3.3、1.6、0.8、0.4和0.2μmol/ml)，然后測定不同濃度的atp和化合物條件下，激酶對底物的轉(zhuǎn)化率，根據(jù)公式轉(zhuǎn)化率＝(vmax*x)/{km*[(1+i/ki)ⁿ]+x}。x代表atp的濃度，n代表希爾系數(shù)。實驗結(jié)果見圖1d，結(jié)果顯示，在固定l16h50濃度下，隨著atp濃度的增加，底物轉(zhuǎn)化率未表現(xiàn)出增加的趨勢，因此atp的濃度的變化并未對激酶的底物轉(zhuǎn)化率表現(xiàn)出明顯影響，說明其為非atp競爭性抑制劑。

實施例4westernblot法測定l16h50對細胞中fgfr1信號通路的抑制作用

為了研究化合物對細胞中fgfr1激酶的抑制作用，通過westernblot法測定了化合物對人工構(gòu)建高表達fgfr1的hek-293t、及內(nèi)源高表達fgfr1的sgc7901細胞中fgfr1及其下游信號通路蛋白的影響。具體方法：取對數(shù)期生長的sgc7901或者hek-293tfgfr1細胞(只表達fgfr1)按每孔30萬個細胞鋪在6孔板中，貼壁過夜后，再用無血清的培養(yǎng)基饑餓12小時，再分(空白組、fgf240ng/ml組、fgf2+l16h50/a114/azd4547組)組加藥。具體加藥方法：先加入化合物預(yù)孵1小時后，再加入40ng/mlfgf2刺激10分鐘，收蛋白，用westernblot測定fgfr1信號通路蛋白的表達情況。結(jié)果見圖1b和1c。l16h50對hek-293t中fgf2誘導(dǎo)的fgfr1的磷酸化表現(xiàn)出濃度劑量依賴性的抑制作用；對sgc7901中fgf2誘導(dǎo)的fgfr1，及其下游信號通路蛋白frs2α、plcγ、erk、akt的磷酸化均表現(xiàn)出很好的抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度劑量依賴性。在濃度10μm濃度下，l16h50在以上活性中均表現(xiàn)出與陽性藥物azd4547和a114相當?shù)幕钚浴?/p>

實施例6mtt法測定化合物對細胞生長的影響

fgfr1與腫瘤細胞的生長密切相關(guān)，因此通過mtt法測定了化合物對腫瘤細胞的生長抑制活性。具體方法：將處于對數(shù)期生長的胃癌細胞sgc7901、bgc823及kato-iii細胞消化并按3000個/孔各自鋪在96孔板中，貼壁過夜，換液，按(空白組、dmso組、l16h50/a114組)組加藥。作用72小時后，觀察細胞存活情況并在每個孔加入25μlmtt(濃度為5mg/ml)，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6小時，吸取上清，留下結(jié)晶，每孔加入150μldmso溶解結(jié)晶，室溫避光條件下在微量振蕩儀上振蕩10min，觀察結(jié)晶溶解情況，待結(jié)晶完全溶解后在酶標儀490nm波長處讀取od值，并計算抑制率和ic50。結(jié)果見圖2a-c。在sgc7901，bgc823及kato-iii三株細胞株中，l16h50濃度依賴且時間依賴地抑制胃癌細胞的增殖，其抑制效果明顯優(yōu)于對照a114。l16h50對sgc7901、bgc823及kato-iii的半數(shù)抑制濃度(ic50)分別為0.5±0.4，1.4±0.2和1.6±1.0μm。

實施例7集落形成實驗

用集落克隆實驗測定了化合物對胃癌細胞集落形成的影響。具體方法：sgc7901、bgc803及kato-iii細胞按300個/孔接種至6孔板，貼壁過夜，換液，分(空白組、l16h50組)組加藥作用8小時后，換成新鮮的完全培養(yǎng)基，在37℃、5％co2的環(huán)境中培養(yǎng)3周。將預(yù)處理的細胞從恒溫培養(yǎng)箱中取出，棄培養(yǎng)基，1mlpbs洗滌細胞2次，用4％多聚甲醛室溫下固定10分鐘后，吸去多聚甲醛，pbs洗去殘余多聚甲醛，加入0.5ml結(jié)晶紫染色液室溫下染30分鐘，回收結(jié)晶紫染色液(室溫保存，可重復(fù)利用)。pbs洗去殘留的結(jié)晶紫染色液，晾干后用單反照相機記錄圖片。實驗結(jié)果見圖2d。結(jié)果顯示l16h50作用8小時后，對三種胃癌細胞均能以濃度劑量依賴性地抑制腫瘤細胞集落的形成，在濃度5μm下就表現(xiàn)出良好的抑制作用，10μm的l16h50處理過的胃癌細胞基本上不能形成集落，在相同濃度下其活性明顯由于對照a114。

實施例8對腫瘤細胞周期的阻滯

用流式細胞儀測定了l16h50對胃癌細胞周期的影響。具體方法，：sgc7901、bgc803及kato-iii細胞按30萬個/孔接種至6孔板，貼壁過夜后，換液，分(空白組、l16h50組)組加藥作用10小時。從培養(yǎng)箱中取出預(yù)處理過的細胞，吸去培養(yǎng)基，每孔加入1mlpbs洗滌細胞，吸去pbs，重復(fù)1次，加入含edta的胰蛋白酶消化細胞，注意吹打輕柔，收集細胞至5mlep管中，離心(1000轉(zhuǎn)、5分鐘)，棄上清，加入1mlpbs后輕輕吹打重懸，再次離心。離心后固定，先加入1mlpbs重懸，再在振蕩器上邊振蕩邊緩緩加入3ml預(yù)冷的乙醇?；靹蚝笾糜?20℃環(huán)境下4小時以上，固定完畢后，離心以去掉乙醇，再加入1mlpbs重懸離心，洗去殘留的乙醇。離心后，去上清，加入0.5mlpi(含rnase)在4℃避光的環(huán)境下孵育10分鐘后，再用200目的紗布將染色的細胞過濾至流式上樣管，按流式周期操作步驟上機檢測。結(jié)果見圖3a-b。三種胃癌細胞中加入1μm的l16h50后，g2/m期細胞的比例均明顯上升，在10μm時g2/m期細胞比例均提高到大于20％的水平。因此l16h50能夠通過阻滯細胞周期在g2/m期，起到抑制腫瘤細胞生長的作用。

cyclinb1和cdc2p34這兩個蛋白主要調(diào)控g2/m期，因此用westernblot測定了其對這兩種周期蛋白的影響。結(jié)果見圖3c，l16h50能夠劑量依賴地下調(diào)cyclinb1和cdc2p34的水平，在10μm時對兩種蛋白的表達幾乎被完全抑制。

實施例9誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡

為了進一步了解l16h50對胃癌細胞的作用，我們檢測了l16h50對細胞凋亡的作用。結(jié)果見圖4。流式細胞儀測定凋亡的方法：sgc7901、bgc803及kato-iii細胞按50萬個/孔接種至6孔板，貼壁過夜后，換液，分(空白組、l16h50/a114組)組加藥作用12小時。從培養(yǎng)箱中取出預(yù)處理過的細胞，收集培養(yǎng)基至流式上樣管，每孔加入1mlpbs洗滌細胞，吸取pbs至對應(yīng)流式上樣管，重復(fù)1次，加入不含edta的胰蛋白酶消化細胞，注意吹打輕柔，收集細胞至對應(yīng)流式上樣管中，離心(1000轉(zhuǎn)，5分鐘)，棄上清，加入1mlpbs后輕輕吹打重懸，再次離心。離心后去上清，將結(jié)合緩沖液(10×bindingbuffer)用pbs配置成1×bindingbuffer，除低濃度藥物組外每組加入0.1ml1×bindingbuffer重懸，低濃度藥物組則加入0.4ml1×bindingbuffer重懸并分成4管(每管0.1ml細胞懸液，分別標記為未染色管、低濃度雙染管、annexin-v管及pi管)，除低濃度藥物組外每組加入3μl的annexin-v避光染色10分鐘，同時取低濃度雙染管及annexin-v管加入3μl的annexin-v避光染色10分鐘，接著再在除低濃度藥物組外每組加入1μl的pi避光染色5分鐘，同時取低濃度雙染管及pi管加入1μl的pi避光染色5分鐘，染色完成后，每管加入400μl1×bindingbuffer混勻，按流式凋亡操作步驟上機檢測。流式細胞儀測定結(jié)果顯示了l16h50顯著地上調(diào)了三株胃癌細胞(包括sgc7901，bgc823及kato-iii)的凋亡水平(圖4a-d)。10μm的l16h50引起的凋亡比例在sgc7901、bgc823及kato-iii分別占到24.1％、16.81％和12.2％。

此外，檢測了化合物對凋亡蛋白caspase3/9活力的影響。方法：將處于對數(shù)期的sgc7901按100萬個/孔接種至6孔板，貼壁過夜后，換液，分(空白組、10μml16h50/10μma114組)組加藥作用12小時。caspase3/9的活性檢測步驟按試劑盒說明書操作。結(jié)果顯示l16h50能夠明顯地增強caspase3/9的活性(圖4e)。進一步用westernblot對凋亡相關(guān)蛋白進行了檢測(圖4f-h)。發(fā)現(xiàn)在這三株胃癌細胞株中l(wèi)16h50顯著地上調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2的水平，同時上調(diào)了凋亡蛋白cleaved-parp的水平。

實施例10裸鼠異位荷瘤實驗

上述結(jié)果表明了l16h50確實具有較好的體外抗腫瘤效果，因此用sgc7901的異位瘤模型進一步評估l16h50在裸鼠體內(nèi)抗腫瘤的效果。方法：將處于對數(shù)期的sgc7901細胞用pbs(按700萬個細胞/0.1mlpbs)重懸混勻，用1ml注射器將0.1ml細胞懸液皮下注射至nu/nubalb/c裸鼠的右肩區(qū)域以建立異位瘤模型，根據(jù)裸鼠體重將裸鼠隨機分為模型組、給藥組，每組7只。藥物用劑型(pbs：聚乙二醇：蓖麻油＝7：2：1)溶解，1周后，模型組每天腹腔注射劑型0.1ml，藥物組每天腹腔注射藥物10mg/kg(受試藥：l16h50、azd4547)。給藥期間每2天測定裸鼠體重、腫瘤長徑(l)及短徑(w)，腫瘤體積計算公式：腫瘤體積(v)＝0.5×w²×l。給藥20天后，頸椎脫臼法處死裸鼠，剝出腫瘤并稱重，之后將腫瘤分成兩部分：一部分-80℃保存，一部分福爾馬林固定。結(jié)果見圖5。l16h50顯著地減少了腫瘤的體積和重量，并且這效果不弱于azd4547。為了檢測l16h50在體內(nèi)對fgfr1的作用，我們用westernblot檢測了腫瘤組織中的fgfr1及相關(guān)下游蛋白。westernblot結(jié)果顯示l16h50顯著地抑制了fgfr1、frs2、akt及erk的激活。此外，我們還用免疫組化的方法對腫瘤組織中的增殖及凋亡相關(guān)蛋白進行測定。結(jié)果顯示，l16h50明顯下調(diào)了增殖相關(guān)因子ki67和抗凋亡相關(guān)因子bcl-2的水平。

實施例11體內(nèi)毒性實驗

在異位瘤模型給藥期間，每2天檢測裸鼠的體重，發(fā)現(xiàn)體重并沒有因為給藥發(fā)生顯著的改變(圖5d)。此外進行了化合物對的初步的急性毒性研究。方法：取20g左右的icr小鼠分為模型組、給藥組，每組7只，一次性灌胃給予藥物(受試藥：l16h50)1g/kg。給藥后每天測量小鼠體重，連續(xù)觀察14天后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出心肝脾肺腎胃，觀察臟器有無異常并稱重，之后臟器用福爾馬林固定。結(jié)果顯示(圖6)，1g/kg的劑量給藥并沒有對icr小鼠的體重造成明顯變化(圖6b)，并且造模組和給藥組之間的內(nèi)臟重量(圖6a)，及he染色顯示的顯微結(jié)構(gòu)(圖6c)均無明顯差異。由以上實驗說明在給藥劑量范圍內(nèi)，l16h50并未表現(xiàn)出明顯的小鼠體內(nèi)毒性。