本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及異普耳文酸衍生物及其制備方法以及該衍生物的醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：

隨著抗生素的濫用，超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，使得細(xì)菌感染是危害人類健康的主要疾病之一。研究和開發(fā)新的抗生素一直是醫(yī)藥領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容。近年來，天然產(chǎn)物逐漸成為人類研究有效活性成分的重要來源，在新藥開發(fā)過程中，一方面具有良好活性的天然產(chǎn)物可以直接被用于臨床；另一方面，以天然活性成分為先導(dǎo)化合物，通過有機(jī)合成、結(jié)構(gòu)改造等方法尋找和開發(fā)新的高效低毒藥物，是被實(shí)踐證明最行之有效的開發(fā)新藥的途徑之一。

作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成，海洋微生物同樣為長(zhǎng)期適應(yīng)生存產(chǎn)生各種各樣的酶和許多新穎的活性化合物。研究表明，海洋微生物具有豐富的生物多樣性，種類多達(dá)1億種以上，但目前所研究和鑒別過的海洋微生物還不到海洋微生物總量的1％，這意味著海洋微生物為海洋藥物的研究提供了一個(gè)近似無窮的資源。微生物在海洋中的分布非常廣泛，在極端的環(huán)境中都有微生物存在，其中一部分與海洋動(dòng)植物處于共附生、共棲、寄生或附生的微生物稱為共附生微生物。很多文獻(xiàn)報(bào)道中指出，許多以前認(rèn)為是由植物和無脊椎動(dòng)物產(chǎn)生的活性物質(zhì)實(shí)際上是由與其共附生的微生物產(chǎn)生的。因此，海洋共附生微生物正受到越來越多研究者的重視，迄今為止已從海洋共附生微生物中發(fā)現(xiàn)了種類繁多并且具有活性顯著的生物學(xué)活性物質(zhì)。

然而，由于微生物沉默基因簇的存在，大部分單體化合物在普通的培養(yǎng)條件下并不能表達(dá)產(chǎn)生，通過傳統(tǒng)模式尋求結(jié)構(gòu)新穎的抗菌活性成分的成功率越來越低，因此，如何有效的誘導(dǎo)沉默基因進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新穎的活性單體已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明運(yùn)用稀土元素共培養(yǎng)的方法對(duì)海洋來源的土曲霉進(jìn)行了共培養(yǎng)，從中發(fā)現(xiàn)一種新穎的具有抗菌活性的異普耳文酸衍生物。

本發(fā)明的目的是提供一種異普耳文酸衍生物及其制備方法。

本發(fā)明所提供的異普耳文酸衍生物及其藥學(xué)上可成的鹽或酯，其結(jié)構(gòu)式為式Ⅰ的化合物2-(chloro(4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl)methylene)-4-hydroxy-4-(4-hydroxyphenyl)but-3-enoic acid：

本發(fā)明所述異普耳文酸衍生物可以任何藥學(xué)意義上的陽離子成鹽，這些鹽可以由本發(fā)明所述異普耳文酸衍生物與無機(jī)堿或有機(jī)堿成鹽制備，如堿金屬鹽(例如鈉和鉀鹽)，堿土金屬鹽(例如鈣和鎂鹽)和衍生自氨或具有1-16個(gè)碳原子的有機(jī)胺的銨鹽，如乙胺，二乙胺，三乙胺，乙基二異丙基胺，單乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，二環(huán)己基胺，二甲氨基乙醇，普魯卡因，二芐基胺，N-甲基嗎啉，精氨酸，賴氨酸，1，2-乙二胺和N-甲基哌啶。

本發(fā)明所述異普耳文酸衍生物也可以被溶劑化，例如被水合。溶劑化可以在制備工藝過程中進(jìn)行，或者可以例如由于最初無水的式(I)化合物的吸濕性質(zhì)而發(fā)生(水合)?！八帉W(xué)上可成的鹽”還包括生理學(xué)上可接受的溶劑化物。

藥學(xué)上可成的酯可通過已知的方法利用可藥用酸或醇制得。這些酯的非限制性例子包括脂肪酸/醇或芳香酸/醇的酯，可藥用酯的代表性例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基和芐基酯等。

本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括該化合物的所有可能的幾何異構(gòu)體、例如Z和E異構(gòu)體(順式和反式異構(gòu)體)以及該化合物的所有可能的旋光異構(gòu)體、例如非對(duì)映體和對(duì)映體。此外，本發(fā)明在其范圍內(nèi)還包括單獨(dú)的異構(gòu)體及其任何混合物、例如外消旋混合物。單獨(dú)的異構(gòu)體可利用原料的相應(yīng)的異構(gòu)形式得到或在制得目標(biāo)化合物之后按照常規(guī)分離方法將它們分離。對(duì)于旋光異構(gòu)體、例如對(duì)映體從其混合物中的分離，可使用常規(guī)拆分方法、例如分步結(jié)晶。

本發(fā)明另外涵蓋本發(fā)明化合物的前藥。術(shù)語“前藥”涵蓋自身可以是生物學(xué)上活性或非活性的化合物，但是在其在身體內(nèi)的停留時(shí)間期間轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物(例如通過代謝或水解)。

本發(fā)明還提供了上述異普耳文酸衍生物制備方法，包括如下步驟：1)發(fā)酵培養(yǎng)微生物；2)將所述發(fā)酵液經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后，減壓濃縮，得到初提物；3)將所述轉(zhuǎn)化物殘?jiān)苑聪嘀械蛪荷V純化，所述柱純化采用甲醇-水兩相系統(tǒng)梯度洗脫，收集合并組分；4)將所述組分用反相高效液相色譜純化，得到產(chǎn)物。

其中，上述方法步驟1)微生物為真菌，土曲霉(Aspergillus terreus)。

上述方法步驟2)中萃取溶劑為常規(guī)機(jī)型有機(jī)溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯。

上述制備方法具體包括：

1)發(fā)酵以及萃取

將土曲霉接入GYT培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液，用等體積的乙酸乙酯萃取，優(yōu)選2次，萃取液減壓濃縮至干，得到轉(zhuǎn)化物殘?jiān)?/p>

2)反相中低壓色譜柱純化

將所得殘?jiān)苡谶m量甲醇，使用反相硅膠(優(yōu)選120埃，30–50目)的色譜柱，用甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫(30％-100％甲醇，V/V)，優(yōu)選收集50％-60％甲醇的洗脫組分；

3)反相高效液相色譜純化

合并步驟2)洗脫組分，用C18反相高效液相色譜分析、純化。洗脫系統(tǒng)為甲醇–水等度洗脫，具體條件：流動(dòng)相：甲醇：水(52:48，V/V)，流速為2.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，得到結(jié)構(gòu)式為式Ⅰ化合物。

本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明異普耳文酸衍生物式Ⅰ的化合物的用途。

本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的異普耳文酸衍生物具有良好的抗菌活性，可以作為抗菌藥物的活性成分。

這些抗菌藥物的活性成分可以是選自結(jié)構(gòu)式為式Ⅰ的化合物中的一種或幾種。

在以上述化合物為活性成分的藥物中，需要的時(shí)候還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等，均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。

本發(fā)明利用微生物與稀土元素共發(fā)酵，純化技術(shù)，對(duì)海洋海綿共附生的真菌(Aspergillus terreus)的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)分離，獲得了一類新的異普耳文酸衍生物，通過體外抗菌試驗(yàn)證實(shí)，這些化合物具有較好的抗菌活性，可以作為抗菌藥物的活性成分，具有廣泛的用途。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述異普耳文酸衍生物HPLC純化色譜圖。

圖2為本發(fā)明所述異普耳文酸衍生物HPLC指紋圖譜。

圖3為不同培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC圖譜比較。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、結(jié)構(gòu)式為式Ⅰ化合物的制備

本發(fā)明采用微生物發(fā)酵，提取，純化等步驟來制備本發(fā)明化合物。其中所采用的菌株為土曲霉。此菌株于海洋海綿中分離得到，為海洋海綿的共附生微生物，放置于20％甘油水溶液中，于零下80℃冰箱內(nèi)保存。所選用的培養(yǎng)基為GYT培養(yǎng)基。

GYT培養(yǎng)基的配制：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物10g，0.35g硫酸鎂，溶解于1000mL人工海水中，121℃下滅菌30分鐘。

含有0.5‰氯化鑭的GYT培養(yǎng)基的配制：稱取葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物10g，0.35g硫酸鎂，0.5g氯化鑭，溶解于1000mL人工海水中，121℃下滅菌30分鐘。

含有1‰氯化鑭的GYT培養(yǎng)基的配制：稱取葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物10g，0.35g硫酸鎂，1g氯化鑭，溶解于1000mL人工海水中，121℃下滅菌30分鐘。

含有2‰氯化鑭的GYT培養(yǎng)基的配制：稱取葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物10g，0.35g硫酸鎂，2g氯化鑭，溶解于1000mL人工海水中，121℃下滅菌30分鐘。

配制固體培養(yǎng)基時(shí)在液體培養(yǎng)基中加入2％瓊脂。其中將30.0g海鹽溶解于1000ml自來水溶液中配置為人工海水。

細(xì)菌培養(yǎng)基的制備(LB培養(yǎng)基)：每1000mL液體培養(yǎng)基加入5.0g酵母提取物，10.0g蛋白胨，10.0g NaCl，加水溶解，調(diào)pH值至7.0。配制固體斜面培養(yǎng)基再在液體培養(yǎng)基中加入1.5％瓊脂。

具體化合物的過程如下：

1)發(fā)酵以及萃取

分別選擇普通GYT培養(yǎng)基及含有0.5‰、1‰、2‰氯化鑭的GYT培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基試驗(yàn)組將土曲霉接入2個(gè)250mL培養(yǎng)基的三角瓶中，作為種子液，于搖床上160rpm、28℃下振蕩培養(yǎng)3天后，用無菌移液管吸取25mL的種子液，加入到20個(gè)1000mL搖瓶(裝有500mL GYT培養(yǎng)基)中。振蕩培養(yǎng)28天后，用等體積的乙酸乙酯萃取2次，萃取液減壓濃縮至干，分別得到不同培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化物殘?jiān)骷s6.0g。

用LB培養(yǎng)基復(fù)蘇金黃色葡萄球菌。連續(xù)轉(zhuǎn)接2次后獲得新鮮菌液培養(yǎng)物，用接種環(huán)沾取新鮮菌液培養(yǎng)物采用平板劃線法在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)劃線，獲取單菌落。接種環(huán)挑取單菌落，接種于2ml LB培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)(24h)，用血球計(jì)數(shù)板分別配置濃度為1×10⁶CFU/ml的菌液，備用。

抑菌環(huán)試驗(yàn)：超級(jí)工作臺(tái)中，吸取100μl備用菌液，用玻棒在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面均勻涂布。置室溫干燥后，用直徑為6mm的滅菌打孔器在在培養(yǎng)基表面打孔，往小孔內(nèi)注入不同培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化物樣品，置37℃溫箱，孵育24h后，讀取結(jié)果，抑菌圈邊緣以肉眼見不到菌落明顯生長(zhǎng)為限，測(cè)量其抑菌圈的直徑。結(jié)果如表1所示，

表1

結(jié)果表明0.5‰氯化鑭的GYT培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物具有更好的抑菌效果，因此選擇該產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2)反相中低壓色譜柱純化

將0.5‰氯化鑭的GYT培養(yǎng)基發(fā)酵萃取產(chǎn)物溶于適量甲醇，加至裝有120g反相硅膠(120埃，30–50目)的色譜柱，用甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫(30％-100％甲醇)，收集洗脫組分。

分別對(duì)20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％甲醇的洗脫組分進(jìn)行抗菌活性測(cè)試，其中50％-60％的洗脫組分具有較好的抗菌活性，因此，優(yōu)選收集50％-60％的洗脫組分。

3)反相高效液相色譜純化

將步驟2)收集的洗脫組分用反相高效液相色譜分析、純化。優(yōu)選分析條件為：色譜柱Hedera C₁₈A-5μm，4.6mm I.D×250mm(江蘇漢邦科技)，洗脫系統(tǒng)為甲醇–水等度洗脫，具體條件：流動(dòng)相：甲醇：水(52:48，V/V)，流速為2.0mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL。收集保留時(shí)間108min的組分，得到結(jié)構(gòu)式為式Ⅰ的化合物。

化合物Ⅰ，2-(chloro(4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl)methylene)-4-hydroxy-4-(4-hydroxyphenyl)but-3-enoic acid，黃色無定形粉末：(+)-ESIMS m/z 445/447[M+H]⁺；(+)-HRESIMS m/z 445.0659(calcd for C₂₂H₂₂⁷⁹BrO₅,445.0651).

其¹H-NMR及¹³C-NMR數(shù)據(jù)如表2所示。

表2.化合物Ⅰ的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(CD₃OD)

以上結(jié)果表明，所得化合物結(jié)構(gòu)正確。

化合物Ⅰ的高效液相指紋圖譜如圖2所示，液相條件：色譜柱Hedera C₁₈A-5μm，4.6mm I.D×250mm(江蘇漢邦科技)，具體條件：流動(dòng)相：40％-100％的甲醇-水系統(tǒng)(V/V)，40％甲醇(0分鐘開始)-100％甲醇(70分鐘終止)，梯度洗脫，流速為2.0mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL。

采用上述液相條件考察不同培養(yǎng)基的發(fā)酵轉(zhuǎn)化物(步驟1)的產(chǎn)物)中的化合物Ⅰ的含量，結(jié)果如圖3所示，其中(1為0.5‰氯化鑭的GYT培養(yǎng)基，2為1‰氯化鑭的GYT培養(yǎng)基，3為2‰氯化鑭的GYT培養(yǎng)基，4為普通GYT培養(yǎng)基。結(jié)果表明，0.5‰氯化鑭的GYT培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物中化合物Ⅰ的含量最高，其它培養(yǎng)基的產(chǎn)物中化合物Ⅰ的含量很低。

實(shí)施例2本發(fā)明化合物Ⅰ的抗菌活性

1)實(shí)驗(yàn)材料

儀器與試劑：CO₂培養(yǎng)箱；酶標(biāo)儀(Bio-TEK ELx800)；LB培養(yǎng)基(上海生物工程有限公司)。

測(cè)試所用致病細(xì)菌株：Enterobacter cloacae(陰溝腸桿菌)，Escherichia coli(大腸桿菌)，Klebsiella aerogenes(克雷伯氏菌)，Pseudomonas aeroginosa(綠膿桿菌)，Salmonella typhimurium(鼠傷寒沙門氏菌)，Staphylococcus aureus(金黃色葡萄球菌)，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物研究所。

測(cè)試樣品：土曲霉次生代謝產(chǎn)物Ⅰ，純度在90％以上；同時(shí)，選取硫酸鏈霉素為陽性對(duì)照藥物，各化合物均以DMSO溶解后稀釋。

2)實(shí)驗(yàn)方法

配置LB培養(yǎng)液，121℃下滅菌25分鐘備用，將配置稀釋好的菌液加入96孔板中，每孔加入180μl，將化合物1和2配置為一定濃度的DMSO溶液，以倍數(shù)關(guān)系逐級(jí)稀釋加入含有菌液的微孔中，使其最終濃度依次為64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25，0.125，0.0625μg/ml，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用酶標(biāo)儀于600nm處讀取吸光度，其中采用硫酸鏈霉素為陽性對(duì)照，180μl空白培養(yǎng)基與20μl的DMSO混合溶液為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算各受試樣品對(duì)人類致病菌的最小抑制濃度(MIC值)。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表3所示。

表3.測(cè)試樣品體外細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果

結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物Ⅰ具有良好的光譜抗菌活性，可以作為抗菌藥物的活性成分。