本發(fā)明屬于植物遺傳育種和蘋果種質(zhì)創(chuàng)新研究領(lǐng)域，具體為一種鑒定嘎拉蘋果后代植株的SSR分子標記V及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蘋果（Malus domestica Borkh.）生態(tài)適應(yīng)性強，果品營養(yǎng)價值高，是世界上栽培面積廣、消費量大、經(jīng)濟效益較好的果樹樹種之一。我國是蘋果栽培面積最廣、總產(chǎn)量最高的國家之一。尤其在我國北方，蘋果是栽培面積最大的果樹樹種，其產(chǎn)量和面積均居全國水果之首。這種產(chǎn)業(yè)已成為我國許多省市的支柱產(chǎn)業(yè)，它們在提高農(nóng)民收入、促進地方經(jīng)濟發(fā)展中起著越來越重要的作用。蘋果屬自花不孕植物，生產(chǎn)中的蘋果品種均為雜合二倍體品種，蘋果基因組高度雜合，遺傳背景十分復(fù)雜，加之其童期漫長，使得常規(guī)雜交育種周期長，效率低。

利用純合基因型種質(zhì)育種則可以大大提高定向育種效率?；ㄋ幣囵B(yǎng)可以獲得單倍體植株，經(jīng)過染色體加倍后可以迅速得到純合的二倍體種質(zhì)。由于蘋果是高度雜合的二倍體品種，通常在單一位點由復(fù)等位基因控制，即同一位點含有兩種不同的等位基因，而單倍體品種只含一種基因。通過花藥培養(yǎng)所獲得植株，如果其為單倍體起源，應(yīng)只具有其親本之一的一種等位基因。通過花藥培養(yǎng)可以得到純合的二倍體種質(zhì)，還可以直接獲得性狀優(yōu)良的隱性基因材料和誘變育種材料，這些材料對蘋果遺傳育種研究有重要意義。

分子標記技術(shù)已經(jīng)在蘋果主要農(nóng)藝性狀的早期選擇中得到應(yīng)用，如紅肉、紅皮、黑星病、蘋果綿蚜和火疫病等，參與完成蘋果基因組測序工作并聯(lián)合開發(fā)了8 K（CHAGNé D等，Genome-wide SNP detection, validation, and development of an 8K SNP array for apple[J]. PLoS ONE, 2012, 7: e31745. doi:10.1371/journal.pone.0031745）和20 K（BIANCO L等，Development and validation of a 20K Single Nucleotide Polymorphism（SNP）whole genome genotyping array for apple ( Malus × domestica Borkh) [J]. PLoS One ,2014，9(10): e110377. dio：10.1371/journal.pone.0110377）的蘋果SNP芯片，第1次在世界蘋果育種項目中使用基因組選擇（GS）方法來代替表型篩選加快育種步伐。

簡單序列重復(fù) (simple sequence repeat， SSR) 是一類 1-6bp 核苷酸基序構(gòu)成重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物基因組的編碼區(qū)、非編碼區(qū)，SSR 標記利用簡單序列重復(fù)的側(cè)翼保守序列設(shè)計引物，經(jīng)過PCR擴增， 根據(jù)條帶的大小來反映DNA序列的多態(tài)性。與其它分子標記如 RFLP、AFLP ISSR 等相比，SSR 標記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、重復(fù)性好、特異性強等特點，近年來成為遺傳多樣性研究、遺傳作圖、重要功能基因定位、分子輔助育種等領(lǐng)域應(yīng)用最多的一種標記。

SSR標記因其具有良好的穩(wěn)定性和可傳遞性，在果實品質(zhì)性狀標記篩選、品種鑒定和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中被廣泛使用（Liu, 等. Identification of apple cultivars on the basis of simple sequence repeat markers. Genet Mol Res, 2014, 13 ( 3) : 7377-7387; Moriya, 等. Aligned genetic linkage maps of apple rootstock cultivar ‘JM7’ and Malus sieboldii ‘Sanashi 63’ constructed with novel EST - SSRs. Tree Genet Genomes, 2012, 8 (4) : 709-723.）。

到目前為止，對于嘎拉蘋果花藥培養(yǎng)植株的SSR分子標記還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定嘎拉蘋果后代植株的SSR分子標記V及其應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種鑒定嘎拉蘋果后代植株的SSR分子標記V，在檢測過程中同時使用，所述分子標記為具有如下所示核苷酸序列的2對SSR引物：

LG9 標記Hi23d06：

上游：5^，- TTGAAACCCGTACATTCAACTC -3^，

下游：5^，- GTTTCAAGAACCGTGCGAAATG -3^，

LG17 標記Hi02f12：

上游：5^，- ACATGGCCGAAGACAATGAC -3^，

下游：5^，- GTTTCAACCTTTATCCCTCCATCTTTC -3^，。

一種鑒定嘎拉蘋果后代植株的SSR分子標記V的應(yīng)用，包括以下步驟：

（1）以嘎啦蘋果基因組DNA為PCR擴增模板，分別以上述SSR分子標記為引物對，進行PCR擴增，反應(yīng)體系為15μL，其中含10×PCR Buffer 1.5 μL、2.5 mM dNTPs mixture 1.2μL、10ng/μL Primers F 1.5μL、10ng/μL Primers R 1.5μL、5U Taq 聚合酶0.15μL、100ng/μL DNA模板0.75 μL，去離子水補足至15μL；（2）擴增程序為：94℃預(yù)變性2 min 30 s，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)，72℃10 min，4℃保存?zhèn)溆茫唬?）PCR產(chǎn)物檢測，用8%非變性聚丙烯酰胺電泳，將PCR的每個反應(yīng)產(chǎn)物加入1/2的非變性Loading Buffer，混勻，150V恒定電壓150min，冰醋酸固定，AgNO₃ 染色拍照；（4）用于遺傳連鎖鑒定時，如能擴增出上述2對SSR引物相對應(yīng)的任意一條特異性條帶，說明待測蘋果種質(zhì)中含有的遺傳物質(zhì)位于相應(yīng)的遺傳連鎖群，反之，則待測蘋果種質(zhì)中不存在相應(yīng)的遺傳連鎖群；（5）用于花藥培養(yǎng)植株鑒定時，待測蘋果能擴增出上述2對SSR引物中相對應(yīng)的單獨一條特異性條帶，說明待測蘋果植株為純合材料，如出現(xiàn)兩條條帶，則待測蘋果植株不是純合材料；（6）用于品種來源鑒定時，待測蘋果能擴增出上述2對SSR引物相對應(yīng)的任意一條特異性條帶，說明待測蘋果植株來源于嘎拉蘋果，如無特異性條帶擴增出來，則待測蘋果植株不是嘎拉蘋果培育的后代品種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明在國內(nèi)外首次報道了用SSR分子標記對鑒定材料所處蘋果連鎖群進行鑒定，同時也報道了蘋果的9號和17號染色體上連鎖的SSR分子標記；

2、本發(fā)明所述分子標記是共顯性標記，可以快速、準確對嘎拉蘋果遺傳連鎖群、花藥培養(yǎng)植株及嘎啦培育后代品種進行鑒定；

3、這些研究結(jié)果為下一步加快嘎拉蘋果與重要農(nóng)藝性狀連鎖基因的利用及蘋果純合植株遺傳育種提供了分子水平的支持；

4、為快速鑒定嘎拉培育植株進行分子水平驗證提供了方法。

本發(fā)明通過對嘎拉蘋果花藥培養(yǎng)植株的9號和17號染色體上連鎖的2對SSR分子標記鑒定，不僅可以系統(tǒng)準確地了解嘎拉蘋果基因型類型及其遺傳多樣性，為豐富與發(fā)展蘋果等位基因體系奠定基礎(chǔ)，也為今后科學(xué)利用嘎拉蘋果提供理論依據(jù)，而且也為鑒定嘎拉蘋果花藥培養(yǎng)植株的基因型，及其純合性進行了佐證。本發(fā)明對于蘋果新品種選育及分子標記輔助育種都具有積極的推動作用。同時，本發(fā)明篩選出的2對SSR分子標記也為嘎拉蘋果后代品種從分子水平上進行來源驗證提供了支持。

附圖說明

圖1為LG9 標記Hi23d06的毛細管電泳圖譜；圖2為LG17 標記Hi02f12的毛細管電泳圖譜。

具體實施方式

純合基因型對于高等植物遺傳機理研究和育種應(yīng)用均具有十分重要作用（Murovec, 等. Haploids and doubled haploids in plant breeding. In: Abdurakhmonov I (ed) Plant Breeding: 2012: 87-106.）。蘋果是基因組高度雜合的果樹樹種，利用單倍體基因組可以大大降低基因組的組裝難度（Dunwell. Haploids in flowering plants: origins and ex-ploitation. Plant Biotechnol J，2010，8 ( 4) : 377-424.）。蘋果屬多年生草本植物，生殖周期長，加之自交不親和，導(dǎo)致通過多代自交獲得純合植株的方法難以實現(xiàn)。利用花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體獲得純合基因型株系，對基因型高度雜合的蘋果育種及遺傳分析有重要意義（Germanà. Gametic embryogenesis and haploid technology as valuable support to plant breeding. Plant Cell Rep, 2011，30(5): 839-857；Maria. Doubled haploid production in fruit crops. Plant Cell, Tissue and Organ Culture，2006, 86：131-146.）。通過花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體獲得再生植株，并對獲得的再生植株倍性以及來源進行準確鑒定，對創(chuàng)新種質(zhì)遺傳分析具有重要意義。為更好地利用這些種質(zhì)材料，本發(fā)明對嘎拉蘋果及其花藥培養(yǎng)獲得的植株進行連鎖群和基因型鑒定，為加快嘎拉蘋果與重要農(nóng)藝性狀連鎖基因的利用及蘋果純合植株遺傳育種提供了分子水平的支持。

嘎拉蘋果花藥培養(yǎng)

4月上旬嘎拉蘋果現(xiàn)蕾后，采取混合采樣的方法，選取生長健壯的嘎拉蘋果成年樹，采集發(fā)育良好的花蕾，用密封袋封好置于冰箱4℃冷藏室進行低溫預(yù)處理。低溫處理后，將花蕾在超凈工作臺內(nèi)用0.1%次氯酸鈉滅菌，然后用鑷子從花蕾內(nèi)取出花藥接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，25℃下暗培養(yǎng)，3~5個月后待胚狀體長至8~10mm，轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基上進行植株再生，并進行繼代培養(yǎng)后經(jīng)繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化、室內(nèi)移栽獲得再生植株。

SSR分子標記分析

基因組總DNA提取

選取嘎拉蘋果和嘎拉花藥培育再生植株7株，采用CTAB法（曹秋芬等，2003）分別提取花藥的總DNA。從HiDRAS網(wǎng)站和Okada等構(gòu)建的蘋果高密度微衛(wèi)星遺傳圖譜上，選取分布于蘋果9號和17號染色體的2對SSR引物，再生植株連鎖群HIDRAS 標記見表1；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1：

PCR擴增

PCR反應(yīng)體系總體積為為15μL，由其中含10×PCR Buffer 1.5 μL、2.5 mM dNTPs mixture 1.2μL、10ng/μL Primers F 1.5μL、10ng/μL Primers R 1.5μL、5U Taq 聚合酶0.15μL、100ng/μL DNA模板0.75 μL，去離子水補足至15μL；擴增程序為：94℃預(yù)變性2 min 30 s，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)，72℃10 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物檢測

用8%非變性聚丙烯酰胺電泳，將PCR的每個反應(yīng)產(chǎn)物加入1/2的非變性Loading Buffer，混勻，150V恒定電壓150min左右，冰醋酸固定，AgNO3染色拍照。

對8%非變性聚丙烯酰胺電泳獲得的條帶，進行篩選，對在嘎拉及其花藥培養(yǎng)植株中產(chǎn)生多態(tài)性的標記進行分析，統(tǒng)計。選取在嘎拉蘋果中兩個等位基因/位點都擴增出條帶，而在嘎拉蘋果花藥培養(yǎng)植株中只有一個等位基因/位點擴增出來條帶的引物。嘎啦蘋果在引物Hi23d06（LG 9）中，擴增產(chǎn)物有155 bp和185 bp的特異性條帶；在引物Hi02f12（LG 17）中，擴增產(chǎn)物有130 bp和170 bp的特異性條帶；結(jié)果表明，篩選出分布于第9和第17條染色體上的2對SSR分子標記，在嘎拉蘋果及其花藥培育植株中擴增出等位基因位點。

再生株系的染色體倍性分析：取再生植株葉片在500 μL 裂解液中用刀片切碎，靜置2 min后過濾于EP管中，PI染色后用BD Accuri C5 流式細胞儀分析葉片中的DNA含量。以莖尖培養(yǎng)獲得的雜合二倍體“嘎啦”試管苗葉片為倍性鑒定的參考標準。

采用流式細胞儀對成活再生株系進行染色體倍性鑒定。以雜合二倍體“嘎啦”供體為對照，結(jié)果表明：Gala11- Gala15再生株系均為二倍體。

再生株系的基因型鑒定：

基因組DNA的提?。翰捎酶牧糃TAB法提取葉片總DNA后，經(jīng)核酸蛋白儀（Bio-Rad）檢測DNA濃度，再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質(zhì)量。

對篩選得到引物的5’端TAM、FAM、HEX熒光標記，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，含dNTP mixture（10 mM）0.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、25 mM MgCl₂ 2.0 μL、rTaq酶（5 U/μL）0.2 μL、DNA模板（100 ng/μL）1 μL 、去離子水 17.8 μL。PCR反應(yīng)程序為：第一步95℃ 預(yù)變性3min；第二步94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個循環(huán)；第三步95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，20個循環(huán)；第四步72℃充分延伸6 min，4℃ 保存。反應(yīng)板每孔先加入9.9 μL 去離子甲酰胺和 0. 1μL ROX500或LIZ500 分子量內(nèi)標，再吸取加入50 pg擴增產(chǎn)物加入樣品孔中。98℃變性 5 min，急速冷卻，置放于 ABI 3730XL DNA分析儀上。使用Gene Mapper 軟件分析擴增片段峰型并讀取相應(yīng)數(shù)據(jù)。

SSR 鑒定嘎啦再生植株基因型結(jié)果見表2，結(jié)果顯示，連鎖群上的2個SSR標記顯示雜合體為兩個峰，而再生株系只有其中的一個峰。證明，嘎啦再生株系Gala11- Gala15均為純合基因型植株。

再生株系植物學(xué)觀察：對再生植株試管苗進行植物學(xué)特征調(diào)查。再生植株植物學(xué)觀察結(jié)果見表3，表3結(jié)果顯示嘎啦雜合供體株高為5.67 cm（n=1）和純合二倍體平均株高 2.96 cm ± 0.44 cm（n=28）。同時我們也觀察到純合二倍體長勢相對于嘎啦雜合供體較弱。不同二倍體純合植株的植物學(xué)特征也存在差異。

表3：

結(jié)果與分析

單倍體育種是獲得優(yōu)勢親本供體材料的最有效方法之一?；ㄋ幍幕ㄋ幈谑请s合體細胞，同時也可能誘導(dǎo)成雜合二倍體的再生植株，所以獲得的二倍體植株并非一定為純合體。通過鑒定再生植株的等位基因就可以把花藥培養(yǎng)再生植株的雜合二倍體和純合二倍體區(qū)分開。以前的技術(shù)包括同工酶標記、S等位基因及SSR分子標記都曾被應(yīng)用于花藥再生植株的純合性鑒定。首先選用的SSR標記（來自HIDRAS數(shù)據(jù)庫（http://www.hidras.unimi.it/））對所有的再生植株進行PCR擴增，篩出可區(qū)分再生植株為純合的SSR標記。為了進一步區(qū)分再生植株的基因型，我們又篩選出分布于蘋果9號和17號染色體上連鎖群的SSR標記。這個SSR標記能明確標記“嘎啦”蘋果不同的植株，為今后進行“嘎啦”蘋果的基因型鑒定提供了技術(shù)指標。

親本蘊含的等位基因在花藥培養(yǎng)來的植株中能檢測到，但是花藥培養(yǎng)來的植株中只有一個等位基因/位點擴增出來。這表明花藥培養(yǎng)來的植株其基因型是純合的，即來源于親本的單倍體。

結(jié)論

通過花藥培養(yǎng)還可獲得倍性豐富的純合體植株，這為今后開展蘋果倍性遺傳育種研究提供了豐富的試材。

本發(fā)明獲得的再生株系以及SSR鑒定體系對分析鑒定“嘎啦”優(yōu)良性狀基因研究，田間嫁雜交育種，以及表型-基因型關(guān)聯(lián)分析具有重要意義。

下一步結(jié)合嘎拉蘋果全基因組測序結(jié)果，在基因組范圍內(nèi)對親本及其花藥培養(yǎng)植株進行更為徹底的分析和比較，以便解析嘎拉蘋果重要性狀（特性）的分子機制。

序列表

〈110〉山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所

〈120〉一種鑒定嘎拉蘋果后代植株的SSR分子標記V及其應(yīng)用

〈160〉4

〈210〉1

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG9 標記Hi23d06的上游引物

〈400〉1

TTGAAACCCGTACATTCAACTC

〈210〉2

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG9 標記Hi23d06的下游引物

〈400〉2

GTTTCAAGAACCGTGCGAAATG

〈210〉3

〈211〉20

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG17 標記Hi02f12的上游引物

〈400〉3

ACATGGCCGAAGACAATGAC

〈210〉4

〈211〉27

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG17 標記Hi02f12的下游引物

〈400〉4

GTTTCAACCTTTATCCCTCCATCTTTC