本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測細(xì)胞和機(jī)體衰老水平的方法。

背景技術(shù)：

人口老齡化是世界尤其是中國面臨的日益嚴(yán)峻的社會問題。毋庸置疑，衰老及其相關(guān)疾病已成為國內(nèi)外科研領(lǐng)域急需突破的熱點(diǎn)問題。已有的研究表明，人類的細(xì)胞衰老受到遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及代謝生物學(xué)等層面的多重調(diào)控(Lopez-Otin,C.,Blasco,M.A.,Partridge,L.,Serrano,M.&Kroemer,G.The hallmarks of aging.Cell 153,1194-1217)。另一方面，人類細(xì)胞也能夠通過從基因組、表觀組、代謝組以及細(xì)胞生物學(xué)等多種水平表現(xiàn)出不同的衰老表型，從而反映出不同的細(xì)胞衰老進(jìn)程。同時(shí)，衰老細(xì)胞的形態(tài)及代謝功能的異常和改變，將直接導(dǎo)致由其構(gòu)成的組織和器官無法維持正常的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響個體的生命活動，最終導(dǎo)致個體衰老以及衰老相關(guān)疾病。因此，對于不同層面細(xì)胞衰老表型的精準(zhǔn)檢測將為判斷個體衰老水平提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，從而為個體衰老以及衰老相關(guān)疾病的精準(zhǔn)預(yù)后和提前干預(yù)提供重要依據(jù)。

對于細(xì)胞衰老的檢測指標(biāo)，目前有基因組水平的端?？截悢?shù)檢測，細(xì)胞生物學(xué)水平的生長速率檢測，轉(zhuǎn)錄水平的p16和p21標(biāo)志物檢測，以及生化和代謝水平的衰老相關(guān)b-gal檢測和IL6、IL8檢測等。在這其中，由于其它指標(biāo)在不同程度上都會受到環(huán)境等外界因素的影響而導(dǎo)致檢測結(jié)果可能存在較大誤差，因此唯有在基因組水平檢測端?？截悢?shù)變化被認(rèn)為是評價(jià)細(xì)胞衰老唯一的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，隨著人口老齡化程度的日益增高，人們對于衰老和衰老相關(guān)疾病的檢測、診斷和預(yù)后，以及相關(guān)藥物和治療技術(shù)研發(fā)提出來越來越多的需求和越來越多的要求，因此單純通過檢測端?？截悢?shù)變化來評價(jià)細(xì)胞和機(jī)體衰老已遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了現(xiàn)有需求，無論是科研還是臨床市場，都急需新型的細(xì)胞和機(jī)體衰老檢測技術(shù)來彌補(bǔ)空白，并進(jìn)一步提升檢測精度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供檢測待測細(xì)胞或機(jī)體中rDNA拷貝數(shù)的物質(zhì)的新用途。

本發(fā)明提供了檢測待測細(xì)胞或機(jī)體中rDNA拷貝數(shù)的物質(zhì)在檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體衰老水平中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了檢測待測細(xì)胞或機(jī)體中rDNA拷貝數(shù)的物質(zhì)在制備檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體衰老水平的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了檢測待測細(xì)胞或機(jī)體中rDNA拷貝數(shù)的物質(zhì)在檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體端粒拷貝數(shù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了檢測待測細(xì)胞或機(jī)體中rDNA拷貝數(shù)的物質(zhì)在制備檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體端?？截悢?shù)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述檢測待測細(xì)胞或機(jī)體中rDNA拷貝數(shù)的物質(zhì)為由引物1和引物2組成的引物對或探針；

所述引物1為如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的單鏈DNA分子；

a2)將a1)限定的單鏈DNA分子進(jìn)行一個或幾個堿基的缺失、插入和/或改變得到的、與a1)限定的單鏈DNA分子具有相同功能的單鏈DNA分子；

所述引物2為如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的單鏈DNA分子；

b2)將b1)限定的單鏈DNA分子進(jìn)行一個或幾個堿基的缺失、插入和/或改變得到的、與b1)限定的單鏈DNA分子具有相同功能的單鏈DNA分子；

所述探針為如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的單鏈DNA分子；

c2)將c1)限定的單鏈DNA分子進(jìn)行一個或幾個堿基的缺失、插入和/或改變得到的、與c1)限定的單鏈DNA分子具有相同功能的單鏈DNA分子。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體衰老水平的試劑盒。

本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體衰老水平的試劑盒包括檢測待測細(xì)胞或機(jī)體中rDNA拷貝數(shù)的物質(zhì)。

上述試劑盒中，所述試劑盒還包括記載如下判斷標(biāo)準(zhǔn)A的可讀載體A1)或A2)：

A1)rDNA拷貝數(shù)高的細(xì)胞或機(jī)體的衰老水平低于rDNA拷貝數(shù)低的細(xì)胞或機(jī)體的衰老水平；

A2)rDNA拷貝數(shù)越高，細(xì)胞或機(jī)體的衰老水平越低。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體端粒拷貝數(shù)的試劑盒。

本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體端粒拷貝數(shù)的試劑盒包括檢測待測細(xì)胞或機(jī)體中rDNA拷貝數(shù)的物質(zhì)。

上述試劑盒中，所述試劑盒還包括記載如下判斷標(biāo)準(zhǔn)B的可讀載體B1)或B2)：

B1)rDNA拷貝數(shù)高的細(xì)胞或機(jī)體的端?？截悢?shù)高于rDNA拷貝數(shù)低的細(xì)胞或機(jī)體的端?？截悢?shù)；

B2)rDNA拷貝數(shù)越高，細(xì)胞或機(jī)體的端?？截悢?shù)越高。

上述試劑盒中，所述檢測待測細(xì)胞或機(jī)體中rDNA拷貝數(shù)的物質(zhì)為如下X1)-X5)：

X1)由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對A；

X2)由序列C所示的單鏈DNA分子和序列D所示的單鏈DNA分子組成的引物對B；

所述序列C為將序列1刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列1具有相同功能的核苷酸；

所述序列D為將序列2刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列2具有相同功能的核苷酸；

X3)序列表中序列3所示的單鏈DNA分子；

X4)序列E所示的單鏈DNA分子；

所述序列E為將序列3刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列3具有相同功能的核苷酸；

X5)含有X1)所述引物對A或X2)所述引物對B或X3)所述單鏈DNA分子或X4)所述單鏈DNA分子的PCR試劑。

本發(fā)明還有一個目的是提供上述檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體衰老水平的試劑盒試劑盒或上述可讀載體A1)或A2)的新用途。

本發(fā)明提供了上述檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體衰老水平的試劑盒或上述可讀載體A1)或A2)在檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體衰老水平中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體衰老水平的試劑盒或上述可讀載體A1)或A2)在制備檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體衰老水平的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的最后一個目的是提供上述檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體端?？截悢?shù)的試劑盒或可讀載體B1)或B2)的新用途。

本發(fā)明提供了檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體端?？截悢?shù)的試劑盒或可讀載體B1)或B2)在檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體端?？截悢?shù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體端?？截悢?shù)的試劑盒或可讀載體B1)或B2)在制備檢測或輔助檢測待測細(xì)胞或機(jī)體端?？截悢?shù)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用或試劑盒中，所述檢測待測細(xì)胞或機(jī)體中rDNA拷貝數(shù)的方法為如下(1)或(2)：

(1)以待測細(xì)胞或機(jī)體的基因組DNA為模板，采用引物1和引物2進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR；

(2)用探針標(biāo)記待測細(xì)胞或機(jī)體中的rDNA，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測待測細(xì)胞或機(jī)體中rDNA拷貝數(shù)；所述探針為熒光標(biāo)記的探針，具體為5’端標(biāo)記Cy3的探針。

上述應(yīng)用或試劑盒中，

所述rDNA拷貝數(shù)是指細(xì)胞核內(nèi)基因組DNA中編碼45S核仁組織區(qū)核糖體RNA的DNA序列(Nucleolar organizer region-related ribosomal DNAs,NOR-rDNA)的拷貝數(shù)；

所述端?？截悢?shù)是指人類基因組中端粒重復(fù)序列TTAGGG的拷貝數(shù)，其拷貝數(shù)多少反映了染色體末端的端粒長度。

上述應(yīng)用或試劑盒中，所述細(xì)胞或機(jī)體具體可為人的細(xì)胞或機(jī)體。

本發(fā)明首次通過qPCR方法檢測人類細(xì)胞基因組中的rDNA拷貝數(shù)來評價(jià)細(xì)胞衰老水平。利用體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞和不同年齡人群的血液基因組進(jìn)行的對比研究證明人類細(xì)胞基因組中的rDNA拷貝數(shù)能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞的衰老水平。這一方法為評價(jià)細(xì)胞衰老乃至個體衰老提供一種全新的檢測指標(biāo)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明使用的WRN基因缺失的人間充質(zhì)干細(xì)胞系(WS-MSC)的鑒定結(jié)果。其中，A顯示W(wǎng)S-MSC中WRN基因的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平遠(yuǎn)低于野生型的人間充質(zhì)干細(xì)胞系(WT-MSC)；B顯示，與P6代WT-MSC相比，P6代WS-MSC中端粒長度顯著縮短。

圖2為野生型間充質(zhì)干細(xì)胞(記為WT-MSC)和WRN基因缺失的人間充質(zhì)干細(xì)胞系(記為WS-MSC)中rDNA拷貝數(shù)檢測結(jié)果。其中，A顯示，與P6代WT-MSC相比，P6代WS-MSC中rDNA拷貝數(shù)顯著降低；B顯示，在WT-MSC和WS-MSC中，作為對照的單拷貝基因GAPDH沒有顯著差異。

圖3為利用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證WS-MSC中rDNA拷貝數(shù)降低的結(jié)果。其中，A顯示了流式細(xì)胞術(shù)檢測的原始結(jié)果；B顯示A圖中細(xì)胞熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果說明，與P6代WT-MSC相比，P6代WS-MSC中由熒光探針標(biāo)記了rDNA的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著降低，直接反映了rDNA拷貝數(shù)的顯著降低，從而驗(yàn)證了之前定量PCR的結(jié)果。

圖4為不同年齡人群血液基因組中端粒和NOR-rDNA拷貝數(shù)檢測結(jié)果。其中，A顯示與0-10歲人群外周血相比，70-80歲人群外周血基因組中的端粒長度顯著降低；B顯示與0-10歲人群外周血相比，70-80歲人群外周血基因組中的中rDNA拷貝數(shù)也顯著降低，從而驗(yàn)證了之前在WS-MSC中的檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的培養(yǎng)基配方如下：

(1)CDF12培養(yǎng)基配方：

DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen，11320-033)；

0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050)；

1mM GlutaMAX(Invitrogen，35050-061)；

20％(體積百分含量)Knockout血清替代物(Invitrogen，N10828-028)；

1％(1g/100ml)青霉素/鏈霉素(Invitrogen，15070-063)；

55μMβ-巰基乙醇(Invitrogen，21985-023)；

10ng/ml人FGF2(Joint Protein Central)。

(2)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)培養(yǎng)基配方：

MEM培養(yǎng)基(Invitrogen，12571071)；

10％(體積百分含量)胎牛血清(Invitrogen，10091148)；

1％(1g/100ml)青霉素/鏈霉素(Invitrogen，15070-063)；

10ng/ml重組人成纖維細(xì)胞生長因子(JPC，bFGF)；

MSC分化培養(yǎng)基需額外添加5ng/ml TGFβ(Humanzyme，HZ1131)。

下述實(shí)施例中的細(xì)胞系如下：

人胚胎干細(xì)胞H9細(xì)胞系(WT-ESC)是WiCell公司的產(chǎn)品，貨號：WA09(H9)-DL-7。

WRN基因缺失的人胚胎干細(xì)胞系(WS-ESC)由第一發(fā)明人創(chuàng)建，在文獻(xiàn)“Zhang,W.et al.Aging stem cells.A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging.Science 348,1160-1163”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院生物物理研究所獲取該細(xì)胞系。WRN蛋白對于細(xì)胞核內(nèi)組成型異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)維持至關(guān)重要，與細(xì)胞衰老密切相關(guān)，其功能缺失是成年早衰癥發(fā)生的直接原因，可引起多組織器官衰老和衰老相關(guān)疾病。

下述實(shí)施例中的人胚胎干細(xì)胞H9細(xì)胞系(WT-ESC)培養(yǎng)方法如下：

(1)將H9細(xì)胞接種至預(yù)先培養(yǎng)了經(jīng)過絲裂霉素(美國Sigma公司產(chǎn)品，貨號：M0503)滅活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(美國Invitrogen公司產(chǎn)品，貨號：S1520-100)的培養(yǎng)板中，使用人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基(CDF12培養(yǎng)基)與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)；

(2)將H9細(xì)胞接種至預(yù)先用細(xì)胞外基質(zhì)(qualified-Matrigel，美國BD Biosciences產(chǎn)品，貨號：354277)包被的培養(yǎng)板中，使用mTeSR培養(yǎng)基(美國StemCell Technologies產(chǎn)品)培養(yǎng)。

下述實(shí)施例中的用于流式細(xì)胞術(shù)分選MSC的熒光標(biāo)記抗體如下：

熒光素FITC標(biāo)記的抗人細(xì)胞表面識別分子CD90抗體，BD Biosciences，貨號：555595。

熒光素PE標(biāo)記的抗人細(xì)胞表面識別分子CD73抗體，BD Biosciences，貨號：550257。

熒光素APC標(biāo)記的抗人細(xì)胞表面識別分子CD105抗體，BD Biosciences，貨號：17-1057-42。

熒光素APC標(biāo)記同型對照抗體，BD Biosciences，貨號：555751。

熒光素PE標(biāo)記同型對照抗體，BD Biosciences，貨號：555749。

熒光素FITC標(biāo)記同型對照抗體，BD Biosciences，貨號：555742。

下述實(shí)施例中的rDNA是指細(xì)胞核內(nèi)的核仁組織區(qū)核糖體RNA的編碼序列(Nucleolar organizer region-related ribosomal DNAs,NOR-rDNA),是由40-400個拷貝構(gòu)成的串連重復(fù)序列，每個拷貝含有18S，5.8S和28S核糖體RNA的編碼序列。

下述實(shí)施例中的rDNA拷貝數(shù)是指細(xì)胞核內(nèi)基因組DNA中編碼45S核仁組織區(qū)核糖體RNA的DNA序列(Nucleolar organizer region-related ribosomal DNAs,NOR-rDNA)的拷貝數(shù)。

下述實(shí)施例中的端粒是染色體末端的染色質(zhì)凝縮區(qū)域，其中的DNA序列為由TTAGGG(記為一個拷貝)構(gòu)成的串連重復(fù)序列，目前認(rèn)為隨著細(xì)胞衰老，端粒區(qū)串連重復(fù)序列的拷貝數(shù)是逐漸減少的。

下述實(shí)施例中的端?？截悢?shù)是指人類基因組中端粒重復(fù)序列TTAGGG的拷貝數(shù)，其拷貝數(shù)多少反映了染色體末端的端粒長度。

實(shí)施例1、rDNA拷貝數(shù)在評價(jià)細(xì)胞衰老水平中的應(yīng)用

一、野生型人間充質(zhì)干細(xì)胞(WT-MSC)和WRN基因缺失的人間充質(zhì)干細(xì)胞(WS-MSC)的制備及WRN轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)水平檢測

1、野生型人間充質(zhì)干細(xì)胞(WT-MSC)和WRN基因缺失的人間充質(zhì)干細(xì)胞(WS-MSC)的制備

本發(fā)明將野生型人胚胎干細(xì)胞H9細(xì)胞系(WT-ESC)和WRN基因缺失的人胚胎干細(xì)胞系(WS-ESC)，進(jìn)一步體外定向分化為間充質(zhì)干細(xì)胞(WT-MSC)和WRN基因缺失的人間充質(zhì)干細(xì)胞(WS-MSC)，具體方法如下：

(1)將野生型人胚胎干細(xì)胞H9細(xì)胞系(WT-ESC)和WRN基因缺失的人胚胎干細(xì)胞系(WS-ESC)分別進(jìn)行擬胚體(EB)分化，獲得擬胚體(EB)。擬胚體(EB)分化具體步驟如下：準(zhǔn)備含有300-500個細(xì)胞、大小均一的ESC克隆，用室溫PBS(Gibco，10010023)清洗一次，用Dispase(Invitrogen公司，貨號為17105041)37℃消化20-30min。待ESC克隆形成球體后，用CDF12培養(yǎng)基重懸后，加到低粘附培養(yǎng)板(Corning公司，貨號3471)中，37℃，5％CO₂條件培養(yǎng)1-3天后即形成擬胚體。

(2)將步驟(1)獲得的擬胚體(EB)接種于基質(zhì)膠(matrigel)包被的6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2周至纖維狀細(xì)胞出現(xiàn)。再經(jīng)過一次傳代后，利用流式細(xì)胞術(shù)分選其中的CD73、CD90和CD105均為陽性的細(xì)胞類群(圖1)，即為野生型間充質(zhì)干細(xì)胞(記為WT-MSC)和WRN基因缺失的人間充質(zhì)干細(xì)胞系(記為WS-MSC)。

2、WRN轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)水平檢測

按照2×10⁵/孔的接種密度分別將步驟1中的WT-MSC和WS-MSC在6孔板中進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)(每代培養(yǎng)4天，隔天換液)至第6代，收取第2-3代(第2-3代分別記為P2代、P3代)和第5-6代(第5-6代分別記為P5代、P6代)的WT-MSC和WS-MSC分別作為早代WT-MSC和WS-MSC、晚代WT-MSC和WS-MSC。分別檢測第6代WT-MSC和WS-MSC中的WRN轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)水平。具體步驟如下：

以第6代的WT-MSC和WS-MSC為供試細(xì)胞，分別提取供試細(xì)胞的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別使用如下引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，檢測供試細(xì)胞中WRN基因的表達(dá)量。

WRN-F：CCAACATCCCAGCTTGCTT；

WRN-R：GAGCAGGCCCATGTTACCTGA；

WRN轉(zhuǎn)錄本的檢測結(jié)果如圖1A所示，從圖中可以看出：WS-MSC中WRN基因的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平遠(yuǎn)低于野生型的人間充質(zhì)干細(xì)胞系(WT-MSC)。

二、間充質(zhì)干細(xì)胞中端粒長度和rDNA拷貝數(shù)檢測

分別以步驟一中P6代的WT-MSC和WS-MSC細(xì)胞為供試細(xì)胞。分別從供試細(xì)胞中提取基因組DNA，通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測供試細(xì)胞中端粒長度和rDNA拷貝數(shù)。其中，以36B4為端粒長度檢測的對照基因；以GAPDH為rDNA拷貝數(shù)檢測的對照基因。引物序列如下：

rDNA-F：5’-CTTGGGAATGCAGCCCAAAG(序列1)-3’；

rDNA-R：5’-GAATCCTCCGGGCGGACTG(序列2)-3’；

Tel-F：5’-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3’；

Tel-R：5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3’；

36B4u：5’-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’；

36B4d：5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’；

GAPDH-F：5’-GCAGCTGAGCTAGGCAGCA-3’；

GAPDH-R：5’-CTTAAGGCATGGCTGCAACTG-3’。

端粒長度檢測結(jié)果如圖1B所示，從圖中可以看出：與P6代WT-MSC相比，P6代WS-MSC中端粒長度顯著縮短。

rDNA拷貝數(shù)檢測結(jié)果如圖2A所示，從圖中可以看出：與P6代WT-MSC相比，P6代WS-MSC中rDNA拷貝數(shù)顯著降低；且圖2B顯示，在WT-MSC和WS-MSC中，作為對照的單拷貝基因GAPDH沒有顯著差異。

上述結(jié)果表明：rDNA拷貝數(shù)與端粒長度的檢測結(jié)果一致。

三、利用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證rDNA拷貝數(shù)的檢測結(jié)果

分別以WT-MSC和WS-MSC細(xì)胞為供試細(xì)胞(第2-3代和第5-6代)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測供試細(xì)胞中rDNA拷貝數(shù)。具體步驟如下：

1、利用4％多聚甲醛(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號：AR-0211)將供試細(xì)胞在室溫條件下固定10分鐘，然后使用含有0.4％TritonX100(美國Sigma公司，貨號：T8787)的PBS室溫孵育供試細(xì)胞15分鐘，再用100g/ml RNase A于37度孵育供試細(xì)胞30分鐘。

2、使用帶有Cy3熒光標(biāo)記的rDNA熒光探針按如下條件孵育步驟1獲得的細(xì)胞：首先85度孵育10分鐘，然后37度孵育2-3小時(shí)。用PBS清洗細(xì)胞1-2次，每次5分鐘。最后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。上述帶有Cy3熒光標(biāo)記(5’端)的rDNA熒光探針由韓國PANAGENE公司合成，探針序列如下：5’-ACCCTACTGATGATGTGT(序列3)-3’。

結(jié)果如圖3所示。其中，圖3A為流式細(xì)胞術(shù)檢測的原始結(jié)果；圖3B為圖3A中細(xì)胞熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。從圖中可以看出：與P6代WT-MSC相比，P6代WS-MSC中由熒光探針標(biāo)記了rDNA的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著降低，直接反映了rDNA拷貝數(shù)的顯著降低，從而驗(yàn)證了步驟二中定量PCR的檢測結(jié)果。

實(shí)施例2、不同年齡人群血液基因組中端粒長度和NOR-rDNA(核仁組織區(qū)rDNA)拷貝數(shù)檢測

分別以0-10歲(Young Blood)和70-80歲(Old Blood)正常人的外周血為供試樣品(各10例)。從供試外周血中提取基因組DNA，通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測端粒長度和rDNA拷貝數(shù)。具體步驟參見實(shí)施例1的步驟二中的方法。

結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出：與0-10歲人群外周血相比，70-80歲人群外周血基因組中的端粒長度顯著降低(圖4A)；與0-10歲人群外周血相比，70-80歲人群外周血基因組中的rDNA拷貝數(shù)也顯著降低(圖4B)，此結(jié)果與實(shí)施例1中的檢測結(jié)果一致。說明rDNA拷貝數(shù)與細(xì)胞或機(jī)體的衰老水平呈負(fù)相關(guān)，即rDNA拷貝數(shù)越高，衰老水平越低。rDNA拷貝數(shù)高的細(xì)胞或機(jī)體的衰老水平低于rDNA拷貝數(shù)低的細(xì)胞或機(jī)體。rDNA拷貝數(shù)可以用于檢測細(xì)胞和機(jī)體的衰老水平。

序列表

<110>中國科學(xué)院生物物理研究所

<120>一種檢測細(xì)胞和機(jī)體衰老水平的方法

<160>3

<210>1

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

cttgggaatg cagcccaaag 20

<210>2

<211>19bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gaatcctccg ggcggactg 19

<210>3

<211>18bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

accctactga tgatgtgt 18