本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種檢測FFPE樣本DNA含量及完整性的方法。
背景技術(shù)：
：FFPE為福爾馬林固定、石蠟包埋的樣本。這類病理樣本是珍貴且來源廣泛的生物醫(yī)學研究材料。而二代測序的不斷發(fā)展及其在醫(yī)學上的應(yīng)用給臨床復(fù)雜疾病的基因診斷和治療帶來了新的曙光。FFPE樣本測序流程主要分為核酸提取、文庫構(gòu)建、上機測序及數(shù)據(jù)分析、解讀四個部分。而提取的核酸的質(zhì)量對建庫的成功與否乃至下機數(shù)據(jù)的可靠性都起著重要的作用，因此對提取后核酸進行嚴格的質(zhì)控就顯得尤為重要。而目前傳統(tǒng)的核酸檢測方法由于易受到雜質(zhì)，高級結(jié)構(gòu)等影響從而無法準確的評估FFPE樣本的DNA有效濃度及完整性。目前檢測DNA濃度的方法主要為分光光度計法和Qubit熒光劑法。分光光度計是利用核酸分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)(－C＝C一C＝C一)，能夠強烈吸收250-280nm波長的紫外光；核酸(DNA/RNA)的最大紫外吸收值在260nm處；遵照Lambert-Beer定律，可以從紫外光吸收值的變化來測定核酸物質(zhì)的含量。盡管紫外吸收定量法是最常用的一種DNA定量方法，但其讀數(shù)并不可靠且不準確。紫外吸光度法能夠檢測吸光度為260nm的所有物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、降解核酸和游離核苷酸。因此其無法準確對FFPE樣本的有效DNA片段進行定量。另一種常用的DNA定量儀器2.0/3.0熒光計采用專門研制的熒光檢測技術(shù)，該技術(shù)采用只有與DNA結(jié)合后才發(fā)出熒光的分子染料；這些熒光染料只有與特異性的靶分子結(jié)合時，才能發(fā)出熒光信號，從而測定DNA濃度。但是其測定的濃度包含所有的DNA片段，包括降解的(如小于100bp)DNA片段。而這部分小片段對于DNA樣本的后期建庫是無意義的。Qubit熒光計定量受樣本雜質(zhì)的影響也較大。這兩種方法檢測的DNA濃度受DNA溶液中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的影響較大，因此定量不準確。目前檢測DNA完整性/降解程度使用較多的方法為瓊脂糖凝膠電泳及安捷倫2100生物分析儀(AligentBioanlyzer2100)。瓊脂糖凝膠電泳是利用DNA片段遷移距離與堿基對的對數(shù)成反比，通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離進行比較，得出未知片段的大小，進而對FFPE樣本DNA的降解程度進行檢測。但是該檢測方法受雜質(zhì)如蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)的影響較大，遷移率受到影響，從而無法準確判斷其降解程度。而且該方法也不能對FFPEDNA樣本的降解程度進行量化。AligentBioanlyzer2100也存在著同樣的問題，同時其儀器成本及檢測成本也比較高。為了精確檢測FFPE樣本DNA的含量及完整性，并且將其成本降至最低，從而為建庫提供準確的指導，避免樣本、時間、試劑、人力等成本的浪費，亟待開發(fā)新的檢測FFPE樣本DNA的含量及完整性方法和產(chǎn)品。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在提供一種檢測FFPE樣本DNA含量及完整性的方法，以精確檢測FFPE樣本DNA的含量及完整性。為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種檢測FFPE樣本DNA含量及完整性的方法。該方法包括以下步驟：S1，根據(jù)FFPE樣本的內(nèi)參基因設(shè)計產(chǎn)物長度為Mbp和Nbp的兩對引物，其中，M<N；S2，取不同降解程度的樣本，使用qPCR方法進行定量，并使用人全基因組DNA標準品采用擴增Mbp產(chǎn)物的擴增引物進行標準曲線的繪制；S3，每個樣本分別采用上述兩對引物進行擴增，根據(jù)Mbp產(chǎn)物的濃度確定DNA的有效濃度，根據(jù)Mbp產(chǎn)物與Nbp產(chǎn)物的CT差值判斷DNA的降解程度；以及S4，根據(jù)樣本的檢測結(jié)果及建庫信息分析結(jié)果確定量化的判定標準。進一步地，M為50～100bp；N為150～300bp。進一步地，S2中取n個不同降解程度的樣本，其中，n不少于200。進一步地，內(nèi)參基因為GAPDH基因。進一步地，M＝74，N＝195，n＝200。進一步地，Mbp產(chǎn)物的擴增引物為SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；Nbp產(chǎn)物的擴增引物為SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。進一步地，S4確定量化的判定標準為：應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，主要針對FFPE的DNA樣本，采用qPCR方法對其進行準確的質(zhì)控，使用內(nèi)參基因，設(shè)計長度不同的兩對引物，在本發(fā)明中只需繪制較短產(chǎn)物的標準曲線，通過標準曲線計算FFPEDNA的有效濃度，通過兩個產(chǎn)物的CT差值判定DNA的降解程度，DNA降解越嚴重，其CT差值越大。本發(fā)明能夠精準測定FFPEDNA的有效濃度，并且量化其降解程度；從而為后續(xù)的建庫、上機、信息分析提供準確的指導。附圖說明構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：圖1示出了實施例1中檢測FFPE樣本DNA含量及完整性的流程示意圖；以及圖2示出了實施例1中FFPEDNA樣本A、B的瓊脂糖凝膠電泳圖。具體實施方式需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種檢測FFPE樣本DNA含量及完整性的方法。該方法包括以下步驟：S1，根據(jù)FFPE樣本的內(nèi)參基因設(shè)計產(chǎn)物長度為Mbp和Nbp的兩對引物，其中，M<N；S2，取不同降解程度的樣本，使用qPCR方法進行定量，并使用人全基因組DNA標準品采用擴增Mbp產(chǎn)物的擴增引物進行標準曲線的繪制；S3，每個樣本分別采用上述兩對引物進行擴增，根據(jù)Mbp產(chǎn)物的濃度確定DNA的有效濃度，根據(jù)Mbp產(chǎn)物與Nbp產(chǎn)物的CT差值判斷DNA的降解程度；以及S4，根據(jù)樣本的檢測結(jié)果及建庫信息分析結(jié)果確定量化的判定標準。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，主要針對FFPE的DNA樣本，采用qPCR方法對其進行準確的質(zhì)控，使用內(nèi)參基因，設(shè)計長度不同的兩對引物，在本發(fā)明中只需繪制較短產(chǎn)物的標準曲線，通過標準曲線計算FFPEDNA的有效濃度，通過兩個產(chǎn)物的CT差值判定DNA的降解程度，DNA降解越嚴重，其CT差值越大。本發(fā)明能夠精準測定FFPEDNA的有效濃度，并且量化其降解程度；從而為后續(xù)的建庫、上機、信息分析提供準確的指導。較短的Mbp長度的產(chǎn)物可以很好的反應(yīng)FFPEDNA內(nèi)部產(chǎn)物的實際濃度。若DNA完整性越差，降解越嚴重，Nbp長產(chǎn)物與Mbp短產(chǎn)物的CT差值越大，因此通過CT差值的大小可以精確的反應(yīng)DNA的降解程度。M的長度應(yīng)該在50-100bp之間；N的長度應(yīng)該在150-300bp之間。CT差值要能明確區(qū)分不同降解程度的DNA樣本。優(yōu)選的，S2中取n個不同降解程度的樣本，其中，選定樣本的數(shù)量n應(yīng)不少于200個，選擇大量樣本可以通過統(tǒng)計學方法獲得DNA樣本降解程度判定標準的準確數(shù)據(jù)。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，內(nèi)參基因為GAPDH基因。GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶的編碼基因。該酶是糖酵解反應(yīng)中的一個酶，該酶基因為管家基因，幾乎在所有組織中都高水平表達，并且表達量是恒定的。因此使用GAPDH基因進行FFPEDNA樣本的有效濃度及完整性的檢測。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，M＝74，N＝195，n＝200。優(yōu)選的，Mbp產(chǎn)物的擴增引物為SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；Nbp產(chǎn)物的擴增引物為SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。采用上述引物，S4確定量化的判定標準為：根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施，主要針對FFPE的DNA樣本，采用qPCR方法對其進行準確的質(zhì)控。使用GAPDH內(nèi)參基因，設(shè)計74bp、195bp兩對引物，只需繪制74bp產(chǎn)物的標準曲線，通過標準曲線計算FFPEDNA的有效濃度。通過195bp及74bp兩個產(chǎn)物的CT差值判定DNA的降解程度。DNA降解越嚴重，其CT差值越大。本發(fā)明能夠精準測定FFPEDNA的有效濃度，并且量化其降解程度；從而為后續(xù)的建庫、上機、信息分析提供準確的指導。使用本發(fā)明的技術(shù)方案可以排除低質(zhì)量樣本，提高建庫成功率，降低DNA不合格導致后期結(jié)果不可信的情況，進而節(jié)省公司的成本，避免患者樣本的浪費，為患者提供更加準確的檢測結(jié)果，從而為后續(xù)疾病的預(yù)防、用藥指導等提供更加可靠的指導。與現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明的方法不受FFPEDNA樣本中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)及小片段的影響，可以準確對DNA的有效濃度進行測定，并且可以準確的判斷DNA的降解程度。目前也有使用qPCR的方法對DNA樣本的有效濃度及降解程度進行檢測，主要是通過2-3對引物，繪制2-3個標準曲線，因此一個樣本的檢測需要的成本較高。本發(fā)明主要是通過qPCR方法精確的對FFPEDNA進行質(zhì)控，并且將質(zhì)控的成本降至最低。本發(fā)明設(shè)計2對qPCR引物：通過較短的產(chǎn)物為74bp的引物實現(xiàn)FFPEDNA有效濃度的測定。通過195bp與74bp擴增產(chǎn)物的CT差值對FFPEDNA樣本的完整性進行量化。本發(fā)明為FFPEDNA樣本的后續(xù)建庫提供了準確的指導，避免樣本、時間、試劑、人力等成本的浪費，從而為患者提供快速、可靠的檢測結(jié)果。下面將結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的有益效果。實施例1本實施例中的主要步驟見圖1，主要包括FFPFDNA提取，qPCR質(zhì)控(定量及降解程度檢測)，該步驟包括標準品梯度稀釋、DNA樣本15倍稀釋、74bp、159bpmix(混合液)配置，樣本或標準品與混合液混合，然后進行上機操作以及下機數(shù)據(jù)分析。具體步驟如下：設(shè)計GAPDH基因產(chǎn)物長度為74bp、195bp兩對引物(簡稱74bp引物和195bp引物)。選擇200個不同降解程度的樣本，使用qPCR方法進行定量，使用人全基因組DNA進行標準曲線的繪制。每個樣本分別采用74bp引物、195bp引物進行反應(yīng)。根據(jù)74bp引物的產(chǎn)物濃度確定DNA的有效濃度(即只做74bp引物的標準曲線即可)；根據(jù)195bp引物與74bp引物的產(chǎn)物的CT差值(δCT)判斷DNA的降解程度。根據(jù)200個樣本的檢測結(jié)果及建庫、信息分析結(jié)果確定量化的判定標準。具體操作方案如下：⑴定量引物設(shè)計74bp引物：上游引物序列(SEQIDNO：1)：ATTCCACCCATGGCAAATTC，20bp下游引物序列(SEQIDNO：2)：GATGGGATTTCCATTGATGACA，22bp195bp引物：上游引物序列(SEQIDNO：3)：ATTCCACCCATGGCAAATTC，20bp下游引物序列(SEQIDNO：4)：GGGACAGGACCATATTGAGGG，21bp⑵使用到的試劑諾唯贊，VAHTSSYBRqPCRMasterMix(諾唯贊染料法qPCR預(yù)混液)。Promega，人全基因組DNA標準品(HumanGenomicDNA)，200ng/μl不含核酸酶的水(Nuclease-freewater)。⑶使用到的儀器：Lifetechnology，AB7500熒光定量PCR儀。⑷實驗操作標準品的稀釋使用Nuclease-freeWater將人全基因組標準品(200ng/μl)按表1進行10倍梯度稀釋：表1每一步稀釋需充分振蕩混勻，并離心10s將液體收集到管中。(此處離心是指輕微離心將震蕩時濺到管蓋及管壁上的液體收集到管中)。待檢DNA的稀釋將DNA樣品稀釋15倍，即3μLDNA+42μLNuclease-freeWater，充分震蕩混勻離心。反應(yīng)液的配制反應(yīng)總體系20μl，每個標準品及樣品做2個復(fù)孔。反應(yīng)體系分為擴增產(chǎn)物74bp及195bp2種：74bp：標準品及待檢DNA樣品，用于待檢DNA濃度的測定。195bp：待檢DNA樣品，通過δCT值(CT195-CT74)判定DNA的降解程度。每板(96孔)可做4個標準品和22個樣品。①qPCR混合液(Mix)的配制如表2：表2將配制好的Mix充分混勻離心后，進行分配，每個qPCR管中加入11.2μl配制好的qPCRmix。②qPCRMix和qPCR標準品及樣品的混合往已加入qPCRMix的qPCR管中加入配制好的標準品或樣品，每孔加入8.8μl。標準品及樣品排列方式見表3(STD為梯度稀釋好的標準品，A2-A7，B2-B7，C2-C7，D2-D7，E2-E7，F(xiàn)2-F7，G2-G5，H2-H5標注為74bp擴增體系，剩余的為195bp擴增體系：表3123456789101112ASTD111991717119919BSTD1221010181822101019CSTD2331111191933111120DSTD2441212202044121220ESTD3551313212155131321FSTD3661414222266141421GSTD4771515171777151522HSTD4881616181888161622蓋好PCR管蓋后振蕩混勻一次，簡短離心，離心后檢查液面是否平齊，是否有氣泡，若有氣泡再次離心將其去除。上機操作按照以下程序在AB7500熒光定量PCR儀上設(shè)置：依次設(shè)置標準品的濃度；設(shè)置ROX作為參考染料；反應(yīng)體系20μL；選擇SYBRGreenReagents作為熒光染料檢測類型；反應(yīng)程序設(shè)置如表4：表4程序設(shè)置完成后，運行程序：打開樣品槽，按照設(shè)置好的樣品位置放好樣品，檢查樣品順序放置無誤后關(guān)閉樣品槽后點擊“Start”，這時軟件會詢問數(shù)據(jù)存放的位置，確定好數(shù)據(jù)存儲位置后開始運行程序。數(shù)據(jù)處理①DNA樣本濃度＝74bp產(chǎn)物的濃度×稀釋倍數(shù)，即為該樣本的有效濃度。②DNA樣本的降解程度計算公式：δCT＝CT195-CT74③δCT值法判定標準見表5(根據(jù)200例樣本結(jié)果確定)：表5下面以2例FFPEDNA樣本為例進行說明。FFPEDNA樣本A、B，使用Qubit進行濃度的檢測，使用1％瓊脂糖凝膠電泳進行DNA降解程度的檢測，120V，30min。結(jié)果如圖2所示。對以上A、B兩個樣本采用qPCR方法進行質(zhì)控。結(jié)果如表6所示：表6根據(jù)兩種方式的質(zhì)控結(jié)果，對A、B兩個樣本進行建庫。每個樣本分別按照Qubit及qPCR定量的濃度取10ng進行建庫，并進行上機分析。建庫試劑盒為LifetechnologiesIonAmpliSeqTMLibraryKit2.0；上機平臺為LifetechnologiesIonProton測序儀。A樣本Qubit、qPCR定量方法構(gòu)建的文庫分別命名為LibA01，LibA02；同理B樣本文庫命名為LibB01，LibB02。通過qPCR方法對LibA01，LibA02，LibB01，LibB02四個文庫進行定量，文庫總量分別為12.1、288.5，17.9、504.2pM，使用Qubit定量兩個樣本所建文庫的濃度過低，均不滿足上機要求；因此選擇文庫LibA02，LibB02上機。從DNA樣本濃度來看使用Qubit檢測，A、B兩個樣本的濃度均較高，而qPCR定量結(jié)果顯示兩個樣本的有效濃度均<0.5ng/μL。結(jié)合建庫結(jié)果可以看出，Qubit對于雜質(zhì)較多的FFPE樣本定量不準確，定量偏差太大，而qPCR方法定量較為準確，可以為后續(xù)建庫提供更可靠的指導。信息分析結(jié)果表明兩個樣本均降解嚴重，各項質(zhì)控指標均不合格。如表7：表7標準為該指標正常水平的閾值，“+”表示該指標越高越好，“-”表示該指標越低越好。平均長度：reads的平均長度，即總數(shù)據(jù)量/總reads；特異性擴增：表示覆蓋目標區(qū)域的reads占總reads的百分比；測序均一性：表示測序深度低于平均測序深度20％的靶向位點占總靶向位點的百分比；3000X區(qū)域覆蓋率：表示測序深度高于3000X的靶向位點占總靶向位點的百分比。從表7可以看到A、B兩個樣本的各項指標均低于標準值，表明兩個樣本均降解嚴重，測序結(jié)果不可信。而從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果來看，其降解程度為可接受，而qPCR表明兩個樣本降解嚴重，無法建庫、上機。qPCR對于FFPEDNA樣本降解程度的判定更加準確。以上2個實例表明qPCR方法可以對FFPE樣本DNA的含量及完整性進行精確的檢測。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。。SEQUENCELISTING<110>天津諾禾醫(yī)學檢驗所有限公司<120>一種檢測FFPE樣本DNA含量及完整性的方法<130>PN60171NHZY<160>4<170>PatentInversion3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>artifical<220><223>引物<400>1attccacccatggcaaattc20<210>2<211>22<212>DNA<213>artifical<220><223>引物<400>2gatgggatttccattgatgaca22<210>3<211>20<212>DNA<213>artifical<220><223>引物<400>3attccacccatggcaaattc20<210>4<211>21<212>DNA<213>artifical<220><223>引物<400>4gggacaggaccatattgaggg21當前第1頁1 2 3