本發(fā)明涉及通過高通量測序篩選基因標志物的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及通過高通量測序?qū)δc癌和/或胃癌的基因標志物進行篩選的方法，以及利用該方法篩選出的基因標志物及其用途。

背景技術(shù)：

隨著生活環(huán)境和習(xí)慣的改變，近些年來癌癥的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年升高，人們對其關(guān)注也隨之增加。胃癌和腸癌分別是我國第二大和第三大高發(fā)癌，屬于發(fā)病率和病死率都非常高的惡性腫瘤，它們的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素參與和多階段累積致癌的復(fù)雜過程。本著現(xiàn)有通行的癌癥早發(fā)現(xiàn)早治療方案，越早期發(fā)現(xiàn)，越有可能早期控制甚至治愈癌癥。如何對胃癌和腸癌進行早期診斷，及時治療，正確地判斷預(yù)后，逐漸受到人們重視。

傳統(tǒng)篩查方法有胃腸鏡檢查和大便隱血試驗，但都有自身不可克服的缺點。胃腸鏡加病理活檢被認為是胃腸癌癥篩查和診斷的金標準，但是因為鏡檢的侵入性和腸道準備的不適，很多病人不愿意接受腸胃鏡檢查。最近有研究表明腸鏡對右側(cè)結(jié)腸內(nèi)常見的扁平息肉的診斷效果不好，腸鏡篩查并不能降低右側(cè)結(jié)腸癌的發(fā)病率。大便隱血試驗是另一種臨床上常用的大腸癌篩查方法，該法有完全無創(chuàng)和廉價等優(yōu)點，但是其檢測腫瘤的準確性低，通過免疫化學(xué)的改進方法也僅能檢測到50-60％的大腸癌和30％左右的癌前腺瘤。并且，該檢測方法假陽性率較高，故很難得到推廣和普及。

除以上傳統(tǒng)篩查方法以外，人們還在不斷探索其他方法，以提高早期診斷率，腫瘤標志物是其中之一。例如，通過DHPLC分析發(fā)現(xiàn)T1151A作為錯配修復(fù)基因hMLH1上的一個多態(tài)位點，可作為胃及大腸腫瘤，尤其是低齡胃及大腸腫瘤高危人群篩選的候選指標(參見張曉梅等，《腫瘤》，2005，25(1)：62-65)。采用CA19-9(糖類胃腸癌相關(guān)抗原)和SA(唾液酸)的腫瘤標志物聯(lián)合檢測對結(jié)/直腸癌和胃/賁門癌的檢測陽性率分別可以達到76.7％和82.5％(參見蔡發(fā)成等，《實用醫(yī)技雜志》，2005，12(3B)：722-723)。此外，我國還開發(fā)了C12蛋白芯片檢測系統(tǒng)，通過分析血清中CA19-9、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、糖原242(CA242)、糖原125(CA125)、糖原153(CA15-3)、甲胎蛋白(AFP)、鐵蛋白、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、人生長激素(HGH)中這十種腫瘤標志物的表達水平，以實現(xiàn)腫瘤的早期診斷和監(jiān)測。然而，大多數(shù)發(fā)現(xiàn)的腫瘤標志物還停留在研究階段，并沒有發(fā)展到臨床診斷階段；或者已經(jīng)應(yīng)用在臨床診斷上，但檢測準確度或靈敏度不高。例如，研究發(fā)現(xiàn)，上述C12系統(tǒng)對胃腸癌患者的總體診斷率為39.21％，I、II、III、IV期患者的診斷率分別為13.73％、33.33％、38.30％、58.03％，表明C12檢測系統(tǒng)對晚期胃腸癌的診斷有一定的價值，但對早期的敏感性不高(參見楊雪琴等，《南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》，2008(10)：1285-1289)。

近期，在現(xiàn)有常規(guī)基因標記物的基礎(chǔ)上又發(fā)展了另外兩種腸癌的體外診斷方法：來自美國Exact Sciences公司的Cologuard技術(shù)和來自Epigenomics公司的Epi proColon技術(shù)。前者主要檢測糞便中的異常DNA變化及人類糞便中存在的潛血紅蛋白；后者檢測血液游離DNA中的SEPT9甲基化標記物。大規(guī)模臨床實驗表明，Cologuard的檢出率效果較好，但需要操作糞便，用戶體驗較差；而SEPT9甲基化屬于液體活檢，雖然用戶體驗較好，但是特異性和靈敏度都較差(分別為80％和72％)。

因此迫切需要具有高特異性和高靈敏度并可供臨床檢測使用的胃腸癌的基因標志物，使能夠以無創(chuàng)或微創(chuàng)、快捷的方法有效診斷胃腸癌，以改善病人接受長期監(jiān)測的意愿。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明人通過對正常樣品和腸癌或胃癌樣品進行高通量測序，并對其中各基因上的5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)含量進行分析，出乎意料地發(fā)現(xiàn)了多個極具信息的可用于檢測腸癌或胃癌的基因標志物。

因此，本發(fā)明的第一個方面涉及用于檢測腸癌的基因標志物，包括一個或多個選自以下的基因：ADAM金屬肽酶域20(ADAM20)、F盒和富亮氨酸重復(fù)蛋白7(FBXL7)、卵泡抑素(FST)、TP53凋亡效應(yīng)器(PERP)、普列克底物蛋白同源相似域家族A成員3(PHLDA3)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1移動伴侶1(RUNX1T1)、互養(yǎng)蛋白γ2(SNTG2)、精子相關(guān)抗原4(SPAG4)、硫酸酯酶1(SULF1)和NME/NM23核苷二磷酸激酶(NME3)。優(yōu)選的，所述基因標志物包括至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或十個選自以下的基因：ADAM20、FBXL7、FST、PERP、PHLDA3、RUNX1T1、SNTG2、SPAG4、SULF1和NME3。更優(yōu)選的，所述基因標志物包括ADAM20、FBXL7、FS孔PERP、PHLDA3、RUNX1T1、SNTG2、SPAG4、SULF1和NME3。

本發(fā)明的第二個方面涉及用于檢測胃癌的基因標志物，包括一個或多個選自以下的基因：Rho GTP酶激活蛋白28(ARHGAP28)、BMP結(jié)合內(nèi)皮調(diào)控者(BMPER)、染色體9開放讀碼框92(C9orf92)、鈣依賴分泌激活者2(CADPS2)、鈣粘蛋白11(CDH11)、F盒和富亮氨酸重復(fù)蛋白7(FBXL7)、間質(zhì)同源框2(MEOX2)、氧化一氮合成酶1(NOS1)、抑瘤素M受體(OSMR)、細胞膜調(diào)控蛋白paralemmin2(PALM2)、磷酸二酯酶10A(PDE10A)、RNA結(jié)合模體單鏈相互作用蛋白3(RBMS3)、硫酸酯酶1(SULF1)、wntless Wnt配體分泌調(diào)節(jié)者(WLS)、Wilms瘤1作用蛋白(WTIP)、鋅指蛋白518B(ZNF518B)、鋅指蛋白714(ZNF714)和Rad52模體包含1(RDM1)。優(yōu)選的，所述基因標志物包括至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個或18個選自以下的基因：ARHGAP28、BMPER、C9orf92、CADPS2、CDH11、FBXL7、MEOX2、NOS1、OSMR、PALM2、PDE10A、RBMS3、SULF1、WLS、WTIP、ANF518B、ZNF714和RDM1。更優(yōu)選的，所述基因標志物包括ARHGAP28、BMPER、C9orf92、CADPS2、CDH11、FBXL7、MEOX2、NOS1、OSMR、PALM2、PDE10A、RBMS3、SULF1、WLS、WTIP、ANF518B、ZNF714和RDM1。

本發(fā)明還涉及上述基因標志物在檢測腸癌或胃癌中的用途。本發(fā)明還涉及利用上述基因標志物進行腸癌或胃癌檢測的試劑盒，其包括用于測定上述基因標志物的5-hmC含量的試劑和說明書。

本發(fā)明的第三個方面涉及用于檢測胃癌或腸癌的方法，包括以下步驟：

(a)測定正常樣品和受試者樣品中本發(fā)明所述的基因標志物的5-hmC的含量；

(b)用正常樣品中所述基因標志物的5-hmC含量作為參照，將受試者樣品中對應(yīng)的基因標志物的5-hmC含量標準化；

(c)對經(jīng)標準化的所述基因標志物的5-hmC含量進行數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)，并獲得評分；和

(d)根據(jù)所述評分獲得檢測結(jié)果。

在一個實施方案中，所述樣品是受試者或正常人體液中游離的DNA片段，或來源于細胞器、細胞以及組織中的完整基因組DNA。其中，體液是血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁、胰腺液等。

在一個實施方案中，本發(fā)明所述的基因標志物的5-hmC含量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進行測定，例如包括但不限于，葡糖基化法、限制性內(nèi)切酶法、化學(xué)標記法、與高通量測序方法聯(lián)用的沉淀法、單分子實時測序法(SMRT)、氧化重亞硫酸鹽測序法(OxBS-Seq)等。葡糖基化法的原理是采用T4噬菌體β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(β-GT)，在葡萄糖供體底物尿核苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glu)存在下，將葡萄糖轉(zhuǎn)移至羥基位置，從而生成β-葡萄糖基-5-羥甲基胞嘧啶(5-ghmC)。同時可采用同位素標記底物進行定量。在葡糖基化法基礎(chǔ)上進一步發(fā)展出限制性內(nèi)切酶法和化學(xué)標記法。限制性內(nèi)切酶法的原理是：葡糖基化反應(yīng)改變了一些限制性內(nèi)切酶的酶切特性。甲基化依賴的限制性內(nèi)切酶MspI和HpaII可識別同樣的序列(CCGG)，但它們對甲基化狀態(tài)的敏感性是不同：MspI識別并切割5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-hmC，但不能切割5-ghmC；HpaII只切割完全未修飾的位點，胞嘧啶上的任何修飾(5-mC、5-hmC、5-ghmC)均阻礙切割。若CpG位點含有5-hmC，那么糖基化、酶解之后能檢測到條帶，未糖基化對照反應(yīng)中沒有條帶；同時可采用qPCR進行定量分析。另外，其他限制性內(nèi)切酶也同樣存在阻礙5-ghmC酶切的情況，可應(yīng)用于5-hmC檢測(如：GmrSD，MspJI，PvuRts1I，TaqI等)。化學(xué)標記法的原理是：將酶反應(yīng)底物上的葡萄糖進行化學(xué)修飾轉(zhuǎn)變成UDP-6-N3-glucose，將6-N3-glucose轉(zhuǎn)移到羥甲基位置，生成N3-5ghmC。隨后，通過點擊化學(xué)方法在每個5-hmC上添加一分子生物素，結(jié)合下一代高通量DNA測序技術(shù)或單分子測序技術(shù)，可分析5-hmC在基因組DNA中的分布情況。沉淀法是將5-hmC用特殊方式修飾后再將其特異性地從基因組DNA中捕獲下來，并進行測序分析。氧化重亞硫酸鹽測序法是首個以單堿基分辨率對5-hmC進行定量測序的方法.首先將5-hmC進行KRuO4氧化處理，生成5-甲酰胞嘧啶(5fC)，然后采用重亞硫酸鹽測序。在此過程中，5-hmC先氧化為5fC，而后脫氨形成U。通常，同時采用多種檢測方法對5-hmC進行定量檢測。

在本發(fā)明的一個實施方案中，利用化學(xué)標記法結(jié)合高通量測序來測定本發(fā)明的基因標志物的5-hmC含量。在該具體的實施方案中，測定本發(fā)明的基因標志物的5-hmC含量的方法包括以下步驟：將來自腸癌或胃癌患者和正常人的樣品的DNA片段化；將所述片段化的DNA末端修復(fù)并末端補齊；將末端補齊的DNA與測序接頭連接，獲得連接產(chǎn)物；通過標記反應(yīng)對連接產(chǎn)物中的5-羥甲基胞嘧啶進行標記；富集含有5-羥甲基胞嘧啶標記的DNA片段，獲得富集產(chǎn)物；對富集產(chǎn)物進行PCR擴增，獲得測序文庫；對測序文庫進行高通量測序，獲得測序結(jié)果；根據(jù)測序結(jié)果確定5-羥甲基胞嘧啶在基因上的含量。其中，標記反應(yīng)包括：i)利用糖基轉(zhuǎn)移酶將帶有修飾基團的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上，和ii)將直接或間接連有生物素的點擊化學(xué)底物與帶有修飾基團的5-羥甲基胞嘧啶反應(yīng)。其中，步驟i)和步驟ii)可以按順序進行，也可以在一個反應(yīng)中同時進行。這種標記方法減少了測序所需的樣本量，且5-羥甲基胞嘧啶上的生物素標簽使其在測序中顯示出更高的動力學(xué)信號，提高了核苷酸識別的準確性。在該實施方案中，所述糖基轉(zhuǎn)移酶包括但不限于：T4噬菌體β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(β-GT)、T4噬菌體α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(α-GT)及其具有相同或相似活性的衍生物、類似物、或重組酶；所述帶有修飾基團的糖包括但不限于：帶有疊氮修飾的糖類(例如6-N3-葡萄糖)或帶有其他化學(xué)修飾(例如羰基、巰基、羥基、羧基、碳-碳雙鍵、碳-碳三鍵、二硫鍵、胺基、酰胺基、雙烯等)的糖類，其中優(yōu)選帶有疊氮修飾的糖類；所述用于間接連接生物素和點擊化學(xué)底物的化學(xué)基團包括但不限于：羰基、巰基、羥基、羧基、碳-碳雙鍵、碳-碳三鍵、二硫鍵、胺基、酰胺基、雙烯。在該實施方案中，優(yōu)選通過固相材料來富集含有5-hmC標記的DNA片段。具體地，可以通過固相親和反應(yīng)或其他特異性結(jié)合反應(yīng)將含有5-羥甲基胞嘧啶標記的DNA片段結(jié)合在固相材料上，然后通過多次洗滌去除未結(jié)合的DNA片段。固相材料包括但不限于帶有表面修飾的硅片或其他芯片，例如人工高分子小球(優(yōu)選直徑為1nm-100um)、磁性小球(優(yōu)選直徑為1nm-100um)、瓊脂糖小球等(優(yōu)選直徑為1nm-100um)。固相富集中所用的洗滌液是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的緩沖液，包括但不限于：含有Tris-HCl、MOPS、HEPES(pH＝6.0-10.0，濃度在1mM到1M之間)、NaCl(0-2M)或表面活性劑如Tween20(0.01％-5％)的緩沖液。在該實施方案中，優(yōu)選直接在固相上進行PCR擴增從而制備測序文庫。如有需要，在固相上進行PCR擴增后，可以回收擴增產(chǎn)物后進行第二輪PCR擴增來制備測序文庫。所述第二輪PCR擴增可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進行。任選地，在制備測序文庫的過程中可進一步包括一個或多個純化步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的或可商購的任何純化試劑盒均可用于本發(fā)明。純化方法包括但不限于：凝膠電泳切膠回收、硅膠膜離心柱法、磁珠法、乙醇或異丙醇沉淀法或其組合。任選地，在高通量測序之前，對測序文庫進行質(zhì)量檢查。例如，對文庫進行片段大小分析并使用qPCR方法對文庫的濃度進行絕對定量。通過質(zhì)量檢查的測序文庫可用于高通量測序。然后將一定數(shù)量(1-96個)含有不同barcode的文庫按相同濃度混勻并根據(jù)二代測序儀的標準上機方法上機測序，獲得測序結(jié)果。本領(lǐng)域已知的各種二代測序平臺及其相關(guān)的試劑可用于本發(fā)明。

在本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選將測序結(jié)果與標準人類基因組參考序列進行比對，挑選出其中比對到本發(fā)明基因標志物上的序列，即選擇比對位點與基因特征(如組蛋白修飾位點、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、基因外顯子內(nèi)含子區(qū)域以及基因啟動子等)重合區(qū)域的讀段數(shù)量，以代表5-hmC在該基因上的修飾水平，從而測定5-hmC在該基因標志物上的含量。優(yōu)選在進行比對前，首先將測序結(jié)果清除低質(zhì)量測序位點，其中衡量測序位點質(zhì)量的因素包括但不限于：堿基質(zhì)量、reads質(zhì)量、GC含量、重復(fù)序列和Overrepresented序列數(shù)量等。該步驟中涉及的各種比對軟件和分析方法是本領(lǐng)域已知的。

在本發(fā)明的一個實施方案中，測定基因標志物的5-hmC含量是指測定該基因標志物全長上的5-hmC含量或測定該基因標志物上某一片段的5-hmC含量或其組合。

根據(jù)本發(fā)明，在測定各基因標志物上5-hmC含量之后，用正常樣品中所述基因標志物的5-hmC含量作為參照，將受試者樣品中對應(yīng)的基因標志物的5-hmC含量標準化。舉例而言，正常樣品和受試者樣品中同一基因標志物的5-hmC含量分別為X和Y，則受試者樣品中該基因標志物的標準化5-hmC含量為Y/X。

根據(jù)本發(fā)明，在數(shù)據(jù)標準化后，對各基因標志物的標準化5-hmC含量進行數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)以獲得評分，從而根據(jù)所述評分獲得檢測結(jié)果。如本文所用，“數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)”是指將來自生物樣品的基因標志物的5-hmC含量與腸癌或胃癌診斷結(jié)果相關(guān)聯(lián)的任何計算方法或機器學(xué)習(xí)方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，可選擇不同的計算方法或工具用于提供本發(fā)明的數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)，例如彈性網(wǎng)絡(luò)正則化、決策樹、廣義線性模型、邏輯回歸、最高分值對、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、線性和二次判別式分析(LQA和QDA)、樸素貝葉斯、隨機森林和支持向量機。

在本發(fā)明的一個實施方案中，對各基因標志物的標準化5-hmC含量進行數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)并獲得評分的具體步驟如下：將各基因標志物的標準化5-hmC含量乘以加權(quán)系數(shù)，獲得該基因標志物的預(yù)測因子t；將各基因標志物的預(yù)測因子t相加，獲得總預(yù)測因子T；將總預(yù)測因子T經(jīng)過Logistic轉(zhuǎn)換獲得評分P；若P＞0.5，則該受試者樣品患有腸癌或胃癌；若P＜0.5，則該受試者樣品為正常。本文所述的加權(quán)系數(shù)是指在考慮可能影響5-hmC含量的因素(例如受試者地域、年齡、性別、低于、吸煙史、飲酒史、家族史等)的情況下，通過各種高級統(tǒng)計分析方法獲得的系數(shù)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明中用于檢測腸癌和/或胃癌的方法是基于基因標志物上的5-hmC含量，因此可以使用更為廣泛的DNA樣品來源。因此，本發(fā)明中用于檢測腸癌和/或胃癌的方法具有以下幾個優(yōu)點：(1)安全無創(chuàng)，即使無癥狀人群也對該檢測接受度高；(2)DNA來源廣泛，不存在影像學(xué)中的檢測盲區(qū)；(3)準確性高，有較高的靈敏度和特異性；(4)操作方便，用戶體驗好，容易進行疾病動態(tài)監(jiān)測。

附圖說明

圖1：用本發(fā)明的腸癌基因標志物區(qū)分第一批樣品的結(jié)果。

圖2：用本發(fā)明的腸癌基因標志物區(qū)分第二批樣品的結(jié)果。

圖3：用本發(fā)明的胃癌基因標志物區(qū)分第三批樣品的結(jié)果。

圖4：用本發(fā)明的胃癌基因標志物區(qū)分第四批樣品的結(jié)果。

具體實施方式

下面將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施。需要說明的是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解本發(fā)明的附圖及其實施例僅僅是為了說明的目的，并不能對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。在不矛盾的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。

實施例1.腸癌基因標志物的篩選

(1)抽提血漿DNA：

從來自15位腸癌患者和18位正常人的樣品中分別抽提10ng血漿DNA?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何適用于抽提血漿DNA的方法、和試劑進行此步驟。

(2)將血漿DNA進行末端補齊、懸A并與測序接頭連接：

根據(jù)Kapa Hyper PerpKit說明書制備含有50uL血漿DNA、7uLEnd Repair&A-Tailing Buffer和3uL End Repair&A-Tailing Enzyme mix的反應(yīng)混合液(總體積為60uL)，在20℃溫浴30分鐘，然后在65℃溫浴30分鐘。在1.5mL低吸附EP管中配置以下連接反應(yīng)混合物：5uL Nuclease free water，30uL Ligation Buffer以及10uL DNA Ligase。向45uL連接反應(yīng)混合物中加入5uL的測序接頭，混合，于20℃加熱20分鐘，然后保持于4℃。使用AmpureXP beads對反應(yīng)產(chǎn)物進行純化，用20uL含Tris-HCl(10mM，pH＝8.0)及EDTA(0.1mM)的緩沖液進行洗脫獲得最終的DNA連接樣品。

(3)標記5-羥甲基胞嘧啶：

制備總體積為26uL的標記反應(yīng)混合液：疊氮修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(即UDP-N3-Glu，終濃度為50uM)、β-GT(終濃度為1uM)、Mg²⁺(終濃度為25mM)、HEPES(pH＝8.0，終濃度為50mM)和來自上述步驟的20uL DNA。將混合液在37℃溫浴1小時。取出混合液，用AmpureXP beads純化，獲得純化的20uL DNA。

然后在上述純化的20uL DNA中加入1uL連接有生物素的二苯基環(huán)辛炔(DBCO-Biotin)，于37℃反應(yīng)2小時，接著用AmpureXP beads純化，獲得純化的標記產(chǎn)物。

(4)固相富集含有標記的5-羥甲基胞嘧啶的DNA片段：

首先，按以下步驟準備磁珠：取出0.5uL C1streptadvin beads(life technology)并加入100uL緩沖液(5mM Tris，pH＝7.5，1M NaCl，0.02％Tween20)，渦旋混合30秒，然后用100uL洗滌液(5mM Tris，pH＝7.5，1M NaCl，0.02％Tween20)洗滌磁珠3次，最后加入25uL結(jié)合緩沖液(10mM Tris，pH＝7.5，2M NaCl，0.04％Tween20或其他表面活性劑)，并混合均勻。

然后，在磁珠混合液中加入上述步驟獲得的純化的標記產(chǎn)物，并在旋轉(zhuǎn)混合器中混合15min使其充分結(jié)合。

最后，用100uL洗滌液(5mM Tris，pH＝7.5，1M NaCl，0.02％Tween20)洗滌磁珠3次，離心去掉上清液，加入23.75uL不含核酸酶的水。

(5)PCR擴增：

向上述步驟的最終體系中加入25uL的2X PCR master mix和1.25uL PCR引物(總體積為50uL)，按照下述PCR反應(yīng)循環(huán)的溫度和條件進行擴增：

將擴增產(chǎn)物用AmpureXP beads純化，得到最終測序文庫。

(6)對測序文庫進行質(zhì)檢后進行高通量測序：

將獲得的測序文庫通過qPCR進行濃度測定，并用Agilent2100對文庫中DNA片段大小含量進行確定。將通過質(zhì)檢的測序文庫以相同濃度混合，用Illumina Hiseq 4000進行測序。

(7)確定各基因標志物的5-hmC含量和加權(quán)系數(shù)

將獲得的測序結(jié)果進行初步質(zhì)控評估，清除低質(zhì)量測序位點后，將達到測序質(zhì)量標準的讀段利用Bowtie2工具與人類標準基因組參考序列進行比較。然后利用featureCounts和HtSeq-Count工具來統(tǒng)計讀段數(shù)量以確定各基因標志物的5-hmC含量。同時利用高通量測序結(jié)果，將可能影響5-hmC含量的因素作為共變量，通過邏輯回歸和彈性網(wǎng)絡(luò)正則化獲得各基因標志物的加權(quán)系數(shù)。結(jié)果如表1所示。

表1：本發(fā)明的腸癌基因標志物的平均標準化5-hmC含量和加權(quán)系數(shù)

如上所述，平均標準化5-hmC含量是指腸癌樣品中該基因標志物的平均5-hmC含量與正常樣品中同一基因標志物的平均5-hmC含量之比。從表1可以看出，本發(fā)明的腸癌基因標志物的5-hmC含量在正常樣品中和腸癌樣品中存在顯著差異，并且除NME3之外，其余基因標志物的5-hmC含量相對于正常人均顯著增加。

實施例2.腸癌基因標志物的有效性

本實施例驗證本發(fā)明的腸癌基因標志物用于檢測腸癌的有效性。

根據(jù)實施例1的方法測定第一批59個樣品(24例腸癌和35例對照)中本發(fā)明所述的10個腸癌基因標志物的5-hmC含量，并確定各基因標志物的加權(quán)系數(shù)。

將各基因標志物的標準化5-hmC含量乘以與其對應(yīng)的加權(quán)系數(shù)，獲得該基因標志物的預(yù)測因子t后，將各基因標志物的預(yù)測因子t相加，獲得總預(yù)測因子T，然后將總預(yù)測因子T根據(jù)以下公式經(jīng)過Logistic轉(zhuǎn)換獲得評分P：

若P＞0.5，則該受試者樣品患有腸癌；若P＜0.5，則該受試者樣品為正常。

圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的方法區(qū)分該批樣品的結(jié)果。如圖1所示，本發(fā)明的方法能夠達到83％的靈敏度和94％的特異性。發(fā)明人進一步用本發(fā)明的方法區(qū)分第二批69個樣品(32例腸癌和37例對照)，其結(jié)果表明該方法能夠達到88％的靈敏度和89％的特異性(圖2)。

這些結(jié)果表明，與現(xiàn)有技術(shù)相比，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠以更高的靈敏度和特異性檢測腸癌。

實施例3.胃癌基因標志物的篩選

根據(jù)實施例1所述的方法篩選胃癌的基因標志物，唯一區(qū)別在于所用樣品是來自7位胃癌患者和18位正常人的血漿游離DNA。篩選到的胃癌標志物如表2所示。

表2：本發(fā)明的胃癌基因標志物的平均標準化5-hmC含量和加權(quán)系數(shù)

如上所述，平均標準化5-hmC含量是指胃癌樣品中該基因標志物的平均5-hmC含量與正常樣品中同一基因標志物的平均5-hmC含量之比。從表2可以看出，本發(fā)明的胃癌基因標志物的5-hmC含量在正常樣品中和腸癌樣品中存在顯著差異，其中在胃癌樣品中，3種基因標志物顯示5-hmC含量降低：RDM1、ZNF714和ZNF518B，15種基因標志物顯示5-hmC含量升高：ARHGAP28、BMPER、C9orf92、CADPS2、CDH11、FBXL7、MEOX2、NOS1、OSMR、PALM2、PDE10A、RBMS3、SULF1、WLS和WTIPo

實施例4.胃癌基因標志物的有效性測定

本實施例驗證本發(fā)明的胃癌基因標志物用于檢測胃癌的有效性。

根據(jù)實施例1的方法測定第三批60個樣品(25例胃癌和35例對照)中本發(fā)明所述的18個胃癌基因標志物的5-hmC含量，并確定各基因標志物的加權(quán)系數(shù)。

將各基因標志物的標準化5-hmC含量乘以與其對應(yīng)的加權(quán)系數(shù)，獲得該基因標志物的預(yù)測因子t后，將各基因標志物的預(yù)測因子t相加，獲得總預(yù)測因子T，然后將總預(yù)測因子T根據(jù)以下公式經(jīng)過Logistic轉(zhuǎn)換獲得評分P：

若P＞0.5，則該受試者樣品患有胃癌；若P＜0.5，則該受試者樣品為正常。

圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的方法區(qū)分該批樣品的結(jié)果。如圖3所示，本發(fā)明的方法能夠達到92％的靈敏度和91％的特異性。發(fā)明人進一步用本發(fā)明的方法區(qū)分第四批63個樣品(29例胃癌和37例對照)，其結(jié)果表明該方法能夠達到90％的靈敏度和97％的特異性(圖4)。

這些結(jié)果表明，與現(xiàn)有技術(shù)相比，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠以更高的靈敏度和特異性檢測腸癌。