本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組合物、檢測(cè)盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

牛多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）為巴氏桿菌科巴氏桿菌屬成員，革蘭氏陰性菌，顯微鏡下觀察為短小的桿狀或者球狀，兩端鈍圓、沒有鞭毛、不形成芽孢。生化特性為需氧或兼性厭氧、對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求較高；可分解甘露糖、葡萄糖、蔗糖和果糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。有莢膜的菌株抗性較強(qiáng)，多見于臨床病料新分離菌株。該菌易感染月齡較小的犢牛，引起地方性的新生犢牛肺炎、運(yùn)輸熱或者斷奶牛肺炎；實(shí)際生產(chǎn)中這些疾病的產(chǎn)生通常伴隨著各種應(yīng)激因素，如不利的氣候影響、不良的營(yíng)養(yǎng)狀況、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)?。尤其是該菌在呈急性感染時(shí)會(huì)表現(xiàn)為出血性敗血癥，導(dǎo)致病畜迅速死亡。目前根據(jù)細(xì)菌的莢膜血清反應(yīng)將該菌可以分為A、B、D、E和F5種莢膜血清型，其中臨床上對(duì)牛有致病性的為A、B和E型。至2006年報(bào)道分離A型菌株以來(lái)，我國(guó)其它地區(qū)如天津、寧夏、內(nèi)蒙古、新疆、湖北、吉林和山東等地也相繼報(bào)道分離了A型菌株，表明我國(guó)從北部到中部都存在該病的流行。由于該病對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的危害極大，因此對(duì)該病的診斷就顯得尤為重要。

傳統(tǒng)的牛多殺性巴氏桿菌檢測(cè)方法主要是通過(guò)實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行細(xì)菌的分離和相關(guān)的生化鑒定、血清學(xué)鑒定；近些年也出現(xiàn)了常規(guī)PCR鑒定、套式PCR鑒定和熒光定量PCR鑒定。這些方法往往存在需要精密儀器和特殊實(shí)驗(yàn)條件的限制，制約了現(xiàn)地應(yīng)用。因此，建立一種實(shí)際應(yīng)用性強(qiáng)的檢測(cè)技術(shù)在基層推廣應(yīng)用，具有很強(qiáng)的臨床意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，它是一種靈敏的鏈置換技術(shù)，可以在恒溫條件下和短時(shí)間內(nèi)將目標(biāo)DNA從幾個(gè)拷貝擴(kuò)增到10⁹~10¹⁰拷貝。LAMP技術(shù)的基本原理是針對(duì)靶序列的6個(gè)區(qū)域，設(shè)計(jì)4條特異性引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶-Bst DNA polymerase 在等溫條件下進(jìn)行反應(yīng)。同一鏈上的一組引物順序地退火到靶序列，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，后階段退火的引物置換前面引物所形成的鏈。置換發(fā)生在兩條鏈上，對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求是能形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，鏈的變性是由鏈置換產(chǎn)生的。LAMP反應(yīng)形成一系列不同長(zhǎng)度莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA再通過(guò)特定的方法判斷擴(kuò)增與否。該方法具有方便快速、操作簡(jiǎn)單、敏感性高、適用性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的儀器要求非常低，一臺(tái)普通的水浴鍋就可以完成全部實(shí)驗(yàn)反應(yīng)。

為了實(shí)現(xiàn)牛多殺性巴氏桿菌的快捷、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)易檢測(cè)診斷，很有必要提供一種利用LAMP技術(shù)檢測(cè)牛多殺性巴氏桿菌的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，使其能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，以克服現(xiàn)有方法在臨床實(shí)用性上的不足。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組合物，由正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3組成，其中，各引物的序列分別為：

FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，

BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，

F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，

B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。

本發(fā)明提供了上述牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組合物在檢測(cè)牛多殺性巴氏桿菌中的應(yīng)用。

一種牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包含檢測(cè)溶液，每24μL檢測(cè)溶液中包括：

10×Thermo Pol反應(yīng)緩沖液 2.5μL

正向內(nèi)引物FIP 1.0μmol/L

反向內(nèi)引物BIP 1.0μmol/L

正向外引物F3 0.4μmol/L

反向外引物B3 0.4μmol/L

MgSO₄ 1.0mmol/L

dNTP 1.6nmol/L

Bst DNA聚合酶 320000U/L

顯色試劑 3mmol/L

DEPC水 補(bǔ)足至24μL，

其中，各引物的序列分別為：

FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，

BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，

F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，

B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。

優(yōu)選地，所述顯色試劑為羥基萘酚藍(lán)，在恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)前加入。

本發(fā)明提供了上述牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)牛多殺性巴氏桿菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了利用上述牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒檢測(cè)牛多殺性巴氏桿菌的方法，包括以下步驟：

步驟S1：當(dāng)原始病料樣品為液體樣本時(shí)，取所述液體樣本1mL在12000rpm/min條件下離心2min后起棄掉上清，再用PBS緩沖液1 mL重懸沉淀，12000rpm/min條件下離心2min后再次棄掉上清；然后利用100μL PBS緩沖液將沉淀吹懸后，取1μL作為樣品模板DNA；當(dāng)原始病料樣品為固體樣本時(shí)，取所述固體樣品的病變與正常交界處的組織0.5g，加入10倍的PBS緩沖液無(wú)菌研磨，凍融2次后無(wú)菌紗布過(guò)濾，然后將獲得的濾液采用前述液體樣本的方法進(jìn)行處理，得到樣品模板DNA；

步驟S2：取1μL的樣品模板DNA加入24μL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中的檢測(cè)溶液，62℃恒溫反應(yīng)1小時(shí)；

步驟S3：觀察反應(yīng)結(jié)束后溶液的顏色變化，陽(yáng)性結(jié)果顯示為天藍(lán)色，陰性結(jié)果顯示為紫色。

優(yōu)選地，所述樣品模板DNA，是疑似感染牛多殺性巴氏桿菌的患病動(dòng)物組織樣品的基因組。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

采用LAMP技術(shù)設(shè)計(jì)的4條引物分別針對(duì)6個(gè)不同的區(qū)域，任何一個(gè)不匹配反應(yīng)就無(wú)法進(jìn)行。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的4條引物：正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，分別針對(duì)靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域。其中正向內(nèi)引物是FIP，包括F1c區(qū)段（同靶序列的F1c區(qū)段完全相同）、F2區(qū)段（同靶序列的F2c區(qū)段完全相同）和TTTT連接子；正向外引物是F3，該基因與靶序列的F3c區(qū)段完全互補(bǔ)；反向內(nèi)引物BIP，包括B1c區(qū)段（同靶序列的B1c區(qū)段完全相同）、B2區(qū)段（同靶序列的B2c區(qū)段完全相同）和TTTT連接子；反向外引物B3，同靶序列上的B3c區(qū)段完全互補(bǔ)。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的4條引物分別針對(duì)靶序列上6個(gè)不同的區(qū)域，從而保證反應(yīng)的強(qiáng)特異性性。

本發(fā)明牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，包括提取樣品模板DNA，利用所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組合物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；羥基萘酚藍(lán) (hydroxyl naphthol blue，HNB) 屬于金屬離子指示劑的一種。 HNB是Mg²⁺的滴定劑，其顏色隨溶液pH變化而改變，因此可以通過(guò)監(jiān)測(cè) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中Mg²⁺濃度的變化及溶液pH而起到顏色指示劑的作用。反應(yīng)前將HNB加入到反應(yīng)液中，反應(yīng)體系呈紫色，反應(yīng)過(guò)程中Mg²⁺與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的副產(chǎn)物P₂O₇^4-結(jié)合產(chǎn)生大量沉淀，溶液中Mg²⁺濃度降低，pH發(fā)生變化，從而使HNB的顏色由紫色變?yōu)樘焖{(lán)色。因此，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)反應(yīng)體系的顏色變化，來(lái)判斷牛多殺性巴氏桿菌的有無(wú)：天藍(lán)色表示檢測(cè)為陽(yáng)性，存在牛多殺性巴氏桿菌；紫色表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，不存在牛多殺性巴氏桿菌。

1）強(qiáng)特異性：本發(fā)明利用牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的牛多殺性巴氏桿菌、牛源金黃色葡萄球菌、牛源無(wú)乳鏈球菌和牛源大腸桿菌基因組，同時(shí)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置陰性對(duì)照。擴(kuò)增結(jié)果表明以其它細(xì)菌（牛源金黃色葡萄球菌、牛源無(wú)乳鏈球菌和牛源大腸桿菌基因組）作為模板時(shí)沒有陽(yáng)性擴(kuò)增。本發(fā)明環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組合物對(duì)牛多殺性巴氏桿菌具有特異性。

2）高敏感性：利用牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒和常規(guī)PCR對(duì)倍比稀釋的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：本發(fā)明牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)到10 CFU/mL，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的方法只能檢測(cè)到1000 CFU/mL。由此可見，本發(fā)明提供的牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒具有更高的敏感性。

3）快速性：相對(duì)常規(guī)PCR反應(yīng)長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間和檢測(cè)時(shí)間，本發(fā)明僅需1小時(shí)即可完成整個(gè)反應(yīng)和結(jié)果判定。

4）可操作性：相對(duì)常規(guī)PCR，本發(fā)明牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒不需要昂貴的PCR儀，只需要一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫水浴鍋即可完成反應(yīng)；且結(jié)果的檢測(cè)可以直接肉眼判定，無(wú)需使用凝膠電泳等特殊儀器。因此本發(fā)明試劑盒具有較強(qiáng)的現(xiàn)地可操作性。

本發(fā)明的檢測(cè)方法快速、靈敏高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)便，其靈敏度比常規(guī)PCR高100倍，通過(guò)肉眼可直接觀察到檢測(cè)結(jié)果，可作為牛多殺性巴氏桿菌的特異性檢測(cè)，為疑似感染牛多殺性巴氏桿菌的患病動(dòng)物組織樣品的快速診斷提供了一種新的方法，具有非常高的實(shí)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

圖1為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的特異性檢測(cè)結(jié)果（凝膠檢測(cè)圖），其中，1：陰性對(duì)照；2：牛多殺性巴氏桿菌；3：牛源金黃色葡萄球菌；4：牛源無(wú)乳鏈球菌；5：牛源大腸桿菌；

圖2為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的敏感性檢測(cè)結(jié)果（加入HNB后直接肉眼觀察），其中，1：陰性對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為紫色；2：1 CFU/mL，擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為紫色；3：10 CFU/mL，擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為天藍(lán)色；4：10² CFU/mL，擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為天藍(lán)色；5：10³ CFU/mL，擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為天藍(lán)色；6：10⁴ CFU/mL，擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為天藍(lán)色；

圖3為常規(guī)PCR方法的敏感性檢測(cè)結(jié)果（凝膠檢測(cè)圖），其中，1：陰性對(duì)照；2：1 CFU/mL；3：10 CFU/mL；4：10² CFU/mL；5：10³ CFU/mL；6：10⁴ CFU/mL。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步清楚闡述本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

1、材料準(zhǔn)備

牛多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida CVCC1667）、牛源金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus CVCC3050）、牛源無(wú)乳鏈球菌（streptococcus agalactiae CVCC1886）、牛源大腸桿菌（Escherichia coli CVCC1299）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。Bst DNA聚合酶及10×Thermo Pol反應(yīng)緩沖液 （購(gòu)自New England Biolabs公司），dNTP（購(gòu)自Clontech公司）、Mg²⁺（購(gòu)自Vazyme公司）。

2、引物設(shè)計(jì)與合成

參考目前已發(fā)表的牛多殺性巴氏桿菌的基因序列，針對(duì)牛多殺性巴氏桿菌的基因KMT1的保守區(qū)域，其中，KMT1基因序列如序列表中序列1所示，利用PrimerExplorer V4在線軟件 http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html設(shè)計(jì)用于檢測(cè)牛多殺性巴氏桿菌的LAMP引物，其中，LAMP引物包括：正向內(nèi)引物FIP和反向內(nèi)引物BIP，正向外引物F3和反向外引物B3，引物序列分別如下所示：

FIP： GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG；

BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC；

F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC；

B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。

設(shè)計(jì)完成的引物由蘇州泓迅生物合成。

正向內(nèi)引物FIP的序列如序列表中序列2所示；反向內(nèi)引物BIP的序列如序列表中序列3所示；正向外引物F3的序列如序列表中序列4所示；反向外引物B3的序列如序列表中序列5所示。

3、樣品基因組的提取

當(dāng)原始病料樣品為液體樣本時(shí)，取所述液體樣本1mL在12000rpm/min條件下離心2min后起棄掉上清，再用PBS緩沖液1 mL重懸沉淀，12000 rpm/min條件下離心2min后再次棄掉上清；然后利用100μL PBS緩沖液將沉淀吹懸后，取1μL作為樣品模板DNA；

當(dāng)原始病料樣品為固體樣本時(shí)，取所述固體樣品的病變與正常交界處的組織0.5g，加入10倍的PBS緩沖液無(wú)菌研磨，凍融2次后無(wú)菌紗布過(guò)濾，然后將獲得的濾液采用前述液體樣本的方法進(jìn)行處理，得到樣品模板DNA。

4、牛多殺性巴氏桿菌LAMP反應(yīng)體系的建立

LAMP反應(yīng)體系，以25μL計(jì)，包括如下組分：

10×Thermo Pol反應(yīng)緩沖液 2.5μL

正向內(nèi)引物FIP 1.0μmol/L

反向內(nèi)引物BIP 1.0μmol/L

正向外引物F3 0.4μmol/L

反向外引物B3 0.4μmol/L

MgSO₄ 1.0mmol/L

dNTP 1.6nmol/L

Bst DNA聚合酶 320000U/L

羥基萘酚藍(lán) 3mmol/L

樣品模板DNA 1μL

DEPC水 補(bǔ)足至25μL。

將上述組分混勻后放置于PCR儀內(nèi)或者水浴鍋中恒溫62℃作用1小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后可以進(jìn)行凝膠檢測(cè)或者可視化檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

5、牛多殺性巴氏桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒條件的優(yōu)化

5.1 引物濃度優(yōu)化

在25 μL的LAMP反應(yīng)體系中以一對(duì)引物為變量，其他反應(yīng)底物成分相同，依次對(duì)FIP與BIP（0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L、1.4μmol/L、1.6μmol/L、1.8μmol/L、2.0μmol/L）、F3與B3（0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L、0.6μmol/L）這兩對(duì)引物進(jìn)行濃度梯度優(yōu)化，每個(gè)濃度重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束之后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

5.2 擴(kuò)增時(shí)間優(yōu)化

配置LAMP反應(yīng)體系，每個(gè)時(shí)間條件下樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別在恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min、45 min、60 min、75 min后取出，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

5.3 擴(kuò)增溫度的優(yōu)化

配置LAMP反應(yīng)體系，每個(gè)溫度條件下樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別在不同溫度60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃反應(yīng)1小時(shí)后取出，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

5.4 Mg2⁺濃度優(yōu)化

對(duì)Mg²⁺的濃度設(shè)置梯度為0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L、1.4 mmol/L，每個(gè)濃度梯度下設(shè)置3個(gè)重復(fù)。待所有濃度梯度反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

5.5 Bst DNA聚合酶濃度優(yōu)化

對(duì)Bst DNA聚合酶的濃度進(jìn)行優(yōu)化，其梯度設(shè)置為160000 U/L、320000 U/L、480000 U/L 、640 000U/L、800000 U/L，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。待所有濃度梯度反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

5.6 LAMP反應(yīng)的特異性試驗(yàn)

以臨床上常見的牛細(xì)菌性疾?。号Ｔ唇瘘S色葡萄球菌、牛源無(wú)乳鏈球菌和牛源大腸桿菌的基因組作為檢測(cè)對(duì)象，提取上述三種細(xì)菌的基因組，并以此為模板進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，來(lái)驗(yàn)證其反應(yīng)的特異性，結(jié)果參見圖1所示。

結(jié)果顯示，當(dāng)發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂白色沉淀導(dǎo)致反應(yīng)液的濁度上升，通過(guò)HNB的顯色反應(yīng)結(jié)果所示，牛多殺性巴氏桿菌的反應(yīng)管呈天藍(lán)色，其為陽(yáng)性結(jié)果；而其它牛源金黃色葡萄球菌、牛源無(wú)乳鏈球菌、牛源大腸桿菌和陰性對(duì)照菌反應(yīng)管均呈紫色，為陰性結(jié)果，證明所設(shè)計(jì)的LAMP特異性引物具有種的特異性。 這說(shuō)明該引物組合物可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中病料樣品中牛多殺性巴氏桿菌的快速可靠的檢測(cè)盒鑒定。

5.7 LAMP反應(yīng)的敏感性試驗(yàn)

取已知CFU值的牛多殺性巴氏桿菌液，然后用PBS緩沖液進(jìn)行稀釋，使其分別相當(dāng)于含有1 CFU/mL、10CFU/mL、100 CFU/mL、1000 CFU/mL、10000 CFU/mL，然后提取上述五組牛多殺性巴氏桿菌的基因組，并分成兩部分，一部分用LAMP試劑盒檢測(cè)；另一部分用常規(guī)PCR方法檢測(cè)，將兩者檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證其反應(yīng)的敏感性，結(jié)果參見圖2~3所示。

參閱圖2，LAMP試劑盒檢測(cè)結(jié)果表明：陰性對(duì)照組的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為紫色；1 CFU/mL的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為紫色；10 CFU/mL的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為天藍(lán)色；10² CFU/mL的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為天藍(lán)色；10³ CFU/mL的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為天藍(lán)色；10⁴ CFU/mL的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為天藍(lán)色。

參閱圖3，常規(guī)PCR方法檢測(cè)結(jié)果表明：陰性對(duì)照組無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；1 CFU/mL無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；10 CFU/mL無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；10² CFU/mL無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；10³ CFU/mL在600bp左右出現(xiàn)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；10⁴ CFU/mL在600bp左右出現(xiàn)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

將上述兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較：LAMP試劑盒的檢測(cè)閾值為10CFU/mL，而常規(guī)PCR的檢測(cè)閾值則是10³ CFU/mL；表明LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)敏感性為常規(guī)PCR的100倍，能夠更加有效地檢測(cè)病料，提高臨床診斷的準(zhǔn)確性。

5.8 LAMP實(shí)際應(yīng)用的符合性

臨床采集63頭患呼吸道病牛的鼻腔拭子。提取樣品的基因組，分別利用建立的的LAMP檢測(cè)方法與常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)對(duì)上述方法實(shí)際應(yīng)用中檢測(cè)結(jié)果比較，驗(yàn)證LAMP實(shí)際應(yīng)用的符合性。

6、牛多殺性巴氏桿菌LAMP方法的優(yōu)化結(jié)果

6.1 優(yōu)化體系和條件

通過(guò)上述條件的優(yōu)化，牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的最后優(yōu)化的LAMP體系，以25μL計(jì)，為：

10×Thermo Pol反應(yīng)緩沖液 2.5μL

正向內(nèi)引物FIP 1.0μmol/L

反向內(nèi)引物BIP 1.0μmol/L

正向外引物F3 0.4μmol/L

反向外引物B3 0.4μmol/L

MgSO₄ 1.0mmol/L

dNTP 1.6nmol/L

Bst DNA聚合酶 320000U/L

羥基萘酚藍(lán) 3mmol/L

樣品模板DNA 1μL

DEPC水 補(bǔ)足至25μL。

反應(yīng)條件為62℃反應(yīng)1小時(shí)。

6.2 牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的符合性

利用牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒與常規(guī)PCR方法對(duì)獲得的63份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的檢出率（23/63）顯著高于常規(guī)PCR方法（13/63），且常規(guī)PCR方法檢出的陽(yáng)性樣品都可以被牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒檢出。

最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案所做的其他修改或者等同替換，只要不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。

SEQUENCE LISTING

<110> 南陽(yáng)師范學(xué)院

<120> 一種牛多殺性巴氏桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組合物、檢測(cè)盒及其應(yīng)用

<130> 2017

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 431

<212> DNA

<213> 牛多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）

<400> 1

acccagtggg gcggtgcgaa tgaaccgatt gccgcgaaat tgagttttat gccacttgaa 60

atgggaaatg gcattatttt atggctcgtt gtgagtgggc ttgtcggtag tcttttattt 120

ggcttgtggc aaagaaaagc acagttttgt tgggcagagt ttggtgtgtt gagccaatct 180

gcttccttga caacggcgca actgattgga cgttatttat tactcagctt attgttattt 240

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tacctatttt ggtctttttc ttcgtgttca acggtttgat cgtgtcagtc caaatgaaac 420

aaaaagtggc g 431

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccacaagcc aaataaaaga ctaccaaatg gcattatttt atggctcg 48

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcacagttt tgttgggcag aaaataacgt ccaatcagtt gc 42

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcgaaattg agttttatgc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caaggaaata taaaccggca a 21