本發(fā)明屬于生物技術(shù)與家畜育種領(lǐng)域，涉及基因插入/缺失多態(tài)性的檢測，特別涉及一種快速、準(zhǔn)確檢測公豬KDM5B基因NC_010452.3:g.52599_52633位點(diǎn)35-bp插入/缺失多態(tài)性的方法。

背景技術(shù)：

豬作為中國人最主要的肉類消費(fèi)品，在中國存欄量巨大。培育具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的種質(zhì)資源是供給充足豬肉的保障。通過研究豬基因組遺傳信息，尋找與繁殖性能、抵抗力、畜產(chǎn)品品質(zhì)、飼料轉(zhuǎn)化率等性狀相關(guān)基因的多態(tài)性，并將這些基因多態(tài)信息應(yīng)用在豬分子育種領(lǐng)域，有利于培育和改良出更多具有優(yōu)良生產(chǎn)性能的品種。

豬是一種重要的模式動物，應(yīng)用在人類疾病研究和器官移植等領(lǐng)域。同時(shí)豬也是一種重要的經(jīng)濟(jì)動物，全球豬肉產(chǎn)量在過去十年上漲60％，目前豬肉占全球肉產(chǎn)品總量的三分之一左右。農(nóng)業(yè)部公布的數(shù)據(jù)顯示，2015年全國生豬出欄量為70,825萬頭，豬肉產(chǎn)量達(dá)到5,487萬噸，占年肉產(chǎn)品總產(chǎn)量的65％，占全球豬肉總產(chǎn)量的49.9％，總產(chǎn)值為13,325億元。在我國，大力發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)不僅能滿足人民日益增長的消費(fèi)需求，也可以促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展。

提供足夠數(shù)量和質(zhì)量的畜產(chǎn)品需要優(yōu)良的種質(zhì)資源作為保證，而育種技術(shù)關(guān)系到培育品種是否優(yōu)良。相對于以表型和表型值為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)育種方法，運(yùn)用以DNA多態(tài)為基礎(chǔ)的分子育種技術(shù)，可以對那些傳統(tǒng)育種方法難以進(jìn)行選擇的重要經(jīng)濟(jì)性狀(繁殖性狀、畜產(chǎn)品品質(zhì)性狀等)進(jìn)行改良。

得益于近幾十年來生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)已經(jīng)成為現(xiàn)代育種技術(shù)體系的重要組成部分。該技術(shù)首先檢測重要基因的DNA多態(tài)性，隨后分析DNA多態(tài)與遺傳性狀之間的相關(guān)性，最后挑選與遺傳性狀顯著相關(guān)的DNA標(biāo)記進(jìn)行性狀選擇。MAS技術(shù)可以在DNA水平上快速準(zhǔn)確地分析個(gè)體遺傳組成，提高家畜育種的定向性，育種值估計(jì)的準(zhǔn)確性，縮短培育年限。

MAS極大地推動了分子育種技術(shù)的發(fā)展。尋找重要功能基因、篩查重要基因遺傳變異位點(diǎn)、分析重要功能基因遺傳變異位點(diǎn)與生長性能的相關(guān)性，是MAS技術(shù)應(yīng)用的前提和關(guān)鍵。目前，很多分子遺傳標(biāo)記已經(jīng)應(yīng)用在分子育種領(lǐng)域，而新一代的遺傳圖譜標(biāo)記仍在不斷地被發(fā)掘。

天然的遺傳變異形式可以歸納為以下三種，單核苷酸多態(tài)(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)、插入/缺失(Insertions and Deletions，Indels)以及基因組結(jié)構(gòu)變異(Structural Variations，SVs)。Indel是指在近緣物種或同一物種不同個(gè)體之間基因組同一位點(diǎn)的序列發(fā)生不同大小核苷酸片段的插入或缺失。目前將Indel定義為50bp以下插入和缺失的總稱。盡管Indel在人類基因組所有染色體上均有分布，且含量僅次于SNPs，但對它的研究程度遠(yuǎn)不如SNPs和SVs深入。

Indel可以劃分為5個(gè)主要類別：①單個(gè)堿基對的插入或缺失；②只一個(gè)堿基對的擴(kuò)增；③2-15bp的擴(kuò)增；④轉(zhuǎn)座子插入；⑤隨機(jī)DNA序列的插入或缺失。其中第五類Indel所占比例最高，轉(zhuǎn)座子插入所占比例最少。

2006年，Devine等首次在人類基因組上確定并定位了415436個(gè)Indel序列。2008年，Kidd等在人類基因組上報(bào)道了796273個(gè)Indel序列。但兩個(gè)實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)得到的序列只有10％是相同的，這樣低的重復(fù)率說明Indel序列還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有被完全發(fā)現(xiàn)。截止2015年，千人基因組計(jì)劃(The 1000Genomes Project)宣布在人類基因組上發(fā)現(xiàn)360萬個(gè)Indel序列。

Indel通過改變DNA序列影響相關(guān)因子與DNA的結(jié)合，或影響RNA序列，又或影響RNA剪接位點(diǎn)等方式改變基因表達(dá)。在已知的Indel序列中，只有一小部分長度偏短的序列位于編碼區(qū)域，這些序列大多會影響基因表達(dá)。有些位于啟動子區(qū)的Indel可以改變DNA序列的相位與間隔，影響相關(guān)因子與DNA結(jié)合。出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域或者增強(qiáng)子區(qū)域的Indel，可能會抑制甚至終止基因表達(dá)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Indel能夠改變?nèi)祟惐硇蛯?dǎo)致疾病。在基因突變導(dǎo)致的人類疾病中，至少有1％由Indel引起。例如CFTR基因三個(gè)堿基對刪除導(dǎo)致囊性肺纖維病變；FMR1基因啟動子區(qū)三倍重復(fù)擴(kuò)增導(dǎo)致脆性X綜合征；在血友病、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤和癌癥患者基因組中發(fā)現(xiàn)存在轉(zhuǎn)座子插入。近幾年《Genome Research》等雜志報(bào)道了Indel在物種進(jìn)化方面的研究，發(fā)現(xiàn)Indel是造成物種間基因組多樣性的原因之一，并認(rèn)為其可能在生物進(jìn)化中扮演重要角色，促進(jìn)物種形成。

與其他分子標(biāo)記相比，基因組同一位點(diǎn)發(fā)生相同長度Indel突變的概率小，可看作同一來源，所以Indel標(biāo)記準(zhǔn)確性高、變異穩(wěn)定，避免了由于特異性和復(fù)雜性導(dǎo)致的后續(xù)分析模糊。與SNPs分型系統(tǒng)相比，Indel分型技術(shù)對設(shè)備和技術(shù)要求較低，更簡便。

目前，Indel在作物育種領(lǐng)域有較多應(yīng)用。鑒定粳稻與秈稻在水稻育種中具有重要價(jià)值。通過對不同品種水稻相關(guān)Indel位點(diǎn)等位基因頻率進(jìn)行分析，不僅能準(zhǔn)確鑒定水稻粳、秈屬性，也有利于秈粳雜交稻的培育。Hayashi等將抗稻瘟品種與不抗稻瘟品種作為雙親，雜交后分析比對子代水稻相關(guān)基因序列，由此開發(fā)的Indel標(biāo)記可以篩選抗瘟水稻。此外，Indel分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用在其他作物育種領(lǐng)域，如栽培番茄、黃瓜等。

近年來，Indel在家畜育種領(lǐng)域越來越受到重視。研究顯示，一些位于生產(chǎn)性狀相關(guān)基因上的Indel序列，會顯著影響相關(guān)基因的表達(dá)。繁殖方面，豬Tex14基因27外顯子上存在一段51bp的插入序列，該插入序列會導(dǎo)致豬生精障礙。約克夏豬催乳素受體基因3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)存在一段Indel序列，若該序列存在，會使催乳素受體基因的表達(dá)下調(diào)75％。日本和牛雌激素受體2A基因上游序列存在一段3bp Indel，該序列存在會促進(jìn)雌激素受體的轉(zhuǎn)錄，提高雌性個(gè)體的生殖能力。生產(chǎn)方面，二?；视王；D(zhuǎn)移酶基因3’-UTR存在一段13bp的Indel序列。該序列存在時(shí)，二?；视王；D(zhuǎn)移酶的表達(dá)明顯升高，提高豬脂肪沉積能力，使背膘增厚、瘦肉率降低。通過研究家畜基因組遺傳信息，人們能夠發(fā)現(xiàn)影響性狀基因的變異位點(diǎn)，這些變異位點(diǎn)的鑒定對家畜育種具有重要意義。賴氨酸特異性去甲基化酶5B(Lysine(K)-Specific Demethylase 5B，KDM5B)基因又稱JARID1B或PLU-1，該基因編碼一個(gè)能夠使組蛋白H3K4一甲基化(me1)、二甲基化(me2)和三甲基化(me3)去甲基化的酶。通常認(rèn)為，組蛋白H3K4甲基化標(biāo)記可以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，KDM5B作為去甲基化酶去除組蛋白甲基化標(biāo)記，會抑制一些基因的轉(zhuǎn)錄。豬KDM5B基因位于10號染色體上，基因全長85905bp，編碼的蛋白含1552個(gè)氨基酸殘基，屬于含有JmjC結(jié)構(gòu)域的組蛋白賴氨酸去甲基化酶。

KDM5B結(jié)構(gòu)域從N端到C端依次是：JmjN，ARID，PHD1，JmjC，鋅指結(jié)構(gòu)域，PLU1，PHD2和PHD3。在這些結(jié)構(gòu)域中，JmjN和JmjC兩個(gè)結(jié)構(gòu)域參與組蛋白H3K4甲基化標(biāo)記的去除。ARID結(jié)構(gòu)域是一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，結(jié)合CCGCCC和GCACC序列。PLU1是一段保守的結(jié)構(gòu)域。研究證明，KDM5B發(fā)揮催化活性所必需的結(jié)構(gòu)域包括：JmjN、JmjC結(jié)構(gòu)域以及鋅指結(jié)構(gòu)域，而ARID和PHD結(jié)構(gòu)域是非必需的。Fe²⁺和α-酮戊二酸是KDM5B完成去甲基反應(yīng)所必需的輔助因子，這兩種輔助因子與JmjN-JmjC結(jié)構(gòu)域結(jié)合。KDM5B的催化機(jī)制通過羥基化作用實(shí)現(xiàn)。Fe²⁺為分子氧提供共振結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生一個(gè)超氧化自由基，該自由基攻擊α-酮戊二酸，通過一系列的中間反應(yīng)過程，最終產(chǎn)生甲醇胺進(jìn)而釋放甲醛，實(shí)現(xiàn)脫甲基的作用。

KDM5B可調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的自我更新，維持發(fā)育基因的表達(dá)以及造血干細(xì)胞自我更新。KDM5B在調(diào)節(jié)間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌源性細(xì)胞或成骨性細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。在家畜研究領(lǐng)域，KDM5B對豬胚胎移植前的發(fā)育十分重要。研究顯示，KDM5B調(diào)節(jié)H3K4me3和H3K27me3的動態(tài)平衡，這種平衡能夠保證豬胚胎的正常發(fā)育。KDM5B與雄激素受體聯(lián)系，促進(jìn)雄激素受體轉(zhuǎn)錄活性。而雄激素受體會直接影響雄激素發(fā)揮生理作用，與生殖密切相關(guān)。

綜上所述，KDM5B基因可能會對公豬繁殖性狀產(chǎn)生影響。目前，KDM5B基因在公豬遺傳變異領(lǐng)域內(nèi)的研究匱乏，該基因Indel與繁殖性狀之間的關(guān)聯(lián)研究更是空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種公豬KDM5B基因插入/缺失多態(tài)性的檢測方法及其應(yīng)用，從而加快良種選育速度。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種公豬KDM5B基因插入/缺失多態(tài)性的檢測方法，包括以下步驟：以待測公豬全基因組DNA為模板，以引物對P1為引物，通過PCR擴(kuò)增公豬KDM5B基因片段；再對PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果鑒定公豬KDM5B基因NC_010452.3:g.52599-52633內(nèi)含子區(qū)35-bp插入/缺失多態(tài)性；

所述的引物對P1為：

上游引物：5’-GGCGACTGGTGAGCACTA-3’；

下游引物：5’-AATTACTTCAAGCCAACCAAACAG-3’。

所述PCR的擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

95.0℃預(yù)變性3min；95.0℃變性30s，63.9℃復(fù)性30s，72.0℃延伸25s，35個(gè)循環(huán)；之后72.0℃延伸10min，4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。

所述瓊脂糖凝膠電泳采用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為2％。

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定公豬KDM5B基因內(nèi)含子區(qū)35-bp插入/缺失多態(tài)性為：插入/插入(II)基因型表現(xiàn)為279bp一條帶；缺失/缺失(DD)基因型表現(xiàn)244bp一條帶；插入/缺失(ID)基因型表現(xiàn)為279bp和244bp兩條帶。

一種公豬KDM5B基因插入/缺失多態(tài)性的檢測試劑盒，該試劑盒包括用于PCR擴(kuò)增上述公豬KDM5B基因內(nèi)含子區(qū)35-bp插入/缺失多態(tài)位點(diǎn)的引物對P1。

公豬KDM5B基因第52599_52633位的II基因型可以作為公豬(例如長白豬)的DNA標(biāo)記在輔助選擇育種中應(yīng)用。

所述的第52599_52633位II基因型標(biāo)記可作為提高公豬(例如長白豬)睪丸重和睪丸短軸長的分子標(biāo)記。

與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明根據(jù)公豬KDM5B基因序列設(shè)計(jì)引物，以公豬基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序后獲得公豬KDM5B基因的部分序列。

針對公豬KDM5B基因第52599_52633位的插入/缺失多態(tài)性，本發(fā)明通過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，能夠簡單、快速、低成本、精確地檢測該位點(diǎn)插入/缺失多態(tài)性。

本發(fā)明對公豬插入/缺失多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型和基因頻率分析，對上述插入/缺失多態(tài)性位點(diǎn)與公豬繁殖性狀(睪丸重、睪丸長軸長、睪丸短軸長)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)能夠作為公豬(例如長白豬)睪丸重和睪丸短軸長的分子標(biāo)記，選擇具有插入/插入(II)基因型的個(gè)體，有利于快速建立遺傳資源優(yōu)良的公豬種群，從而加快具有優(yōu)良繁殖性狀的公豬的良種選育速度。

附圖說明

圖1為引物對P1擴(kuò)增公豬KDM5B基因產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果；M表示Marker。

圖2為公豬KDM5B基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序圖；A表示基因型為DD，B表示基因型為II，黑色方框標(biāo)出的部分表示 35-bp缺失序列：NC_010452.3:g.5259952633delAGCTGATCATTCAGCATACCATTGATCCAGAGGG。

圖3為公豬KDM5B基因35-bp Indel序列分析圖；圖中黑色方框中的序列為上下游引物序列，陰影部分的序列為Indel序列，參考序列為NCBI網(wǎng)站上公布的豬KDM5B基因序列NC_010452.3。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明利用PCR擴(kuò)增方法對公豬KDM5B基因在NC_010452.3:g.52599_52633位點(diǎn)突變可能產(chǎn)生的插入/缺失多態(tài)性進(jìn)行檢測，并將其與公豬繁殖性狀(睪丸重、睪丸長軸長、睪丸短軸長)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證其是否可以作為公豬分子育種中輔助選擇的分子標(biāo)記。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

1.實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

1.1生化試劑與生物學(xué)試劑：①Taq DNA聚合酶(購自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(購自華美生物工程公司)③Marker(購自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通試劑：普通試劑從華美生物工程公司購買，為進(jìn)口分裝產(chǎn)品：Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris飽和酚、氯仿、無水乙醇、醋酸鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴化乙錠(EB)、溴酚藍(lán)、乙酸、蔗糖、硼酸、瓊脂糖等。

1.3溶液與緩沖液：所有溶液與緩沖液均采用去離子超純水配制。高壓滅菌條件為15bf/in(1.034×10⁵Pa)，25min。試劑配制方法均參考Sambrook等編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。具體的溶液與緩沖液如下：

1)采集睪丸樣品所用溶液：PBS緩沖液：NaCl 8g,KCl 0.2g,Na₂HPO₄ 1.44g,KH₂PO₄0.24g,加超純水至1000mL，調(diào)整pH至7.4，高壓滅菌，4℃保存。

2)提取組織樣DNA所用溶液：除了基因組DNA提取時(shí)的公用溶液外，還配制以下試劑：①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高壓滅菌。②組織DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-Cl(pH 8.0)l mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。

3)瓊脂糖電泳分析所用溶液:①0.5×TBE緩沖液：取10×TBE 50mL定容至1000mL。②上樣緩沖液：0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯青FF，40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.設(shè)計(jì)公豬KDM5B基因Indel引物

在NCBI上檢索豬KDM5B基因的序列，并利用Primer 5.0設(shè)計(jì)PCR引物對P1(圖3)，其引物序列如下：

上游引物：5’-GGCGACTGGTGAGCACTA-3’(18nt)；

下游引物：5’-AATTACTTCAAGCCAACCAAACAG-3’(24nt)；

用上述引物對P1對公豬基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增包含公豬KDM5B基因在NC_010452.3:g.52599_52633delAAGCTGATCATTCAGCATACCATTGATCCAGAGGG位點(diǎn)不同的Indel基因型片段。理論上，當(dāng)52599nt與52633nt之間的序列缺失時(shí)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后會有一條244bp大小的條帶；52599nt與52633nt之間的序列插入時(shí)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后會有一條279bp大小的條帶。52599nt與52633nt之間的插入/缺失時(shí)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后會出現(xiàn)279bp和244bp兩條帶。如圖1擴(kuò)增后電泳結(jié)果所示，第1泳道為Marker(由大到小依次是500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp)，2-10泳道為檢測樣本。根據(jù)理論分析結(jié)果，II基因型表現(xiàn)為一條279bp大小的條帶，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1中第3、7、10泳道，測序峰圖為圖2B所示；ID基因型表現(xiàn)為279bp和244bp兩條帶，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1中第2、5、6、8、9泳道；DD基因型表現(xiàn)為一條244bp大小的條帶，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1中第4泳道，測序峰圖為圖2A所示。

3.引物對P1擴(kuò)增豬KDM5B基因片段

3.1公豬睪丸組織樣本的采集

實(shí)驗(yàn)所用的動物為2個(gè)品種共計(jì)381個(gè)樣本，其中15和40日齡大白豬樣品共319份，40日齡長白豬樣品62份均采自陜西省安康市國家生豬養(yǎng)殖場。采用隨機(jī)采樣方式采取個(gè)體睪丸組織樣品，這些樣品為放在PBS緩沖液中保存，冰盒低溫帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-80℃凍存。

表1公豬睪丸樣本采集表

3.2組織樣品DNA的分離、提取

①從-80℃冰箱中取出凍存的睪丸樣本。剪取約10mg豬睪丸組織，放到2.0mL離心管中，用小剪刀盡量剪碎；

②加入600μL SE緩沖液，濃度為20mg/mL的蛋白酶K 20mL，口底顛倒混勻，37.0℃水浴消化過夜，最好保證組織較均勻地分布在組織提取液中；

③第二天將2.0mL離心管從水浴鍋中取出，待溶液冷卻至室溫，加入6mol/L的NaCl200μL充分混勻，隨后加入1mL Tris飽和酚，蓋緊管蓋，放在冰上緩慢地口底顛倒離心管，持續(xù)20min，隨后4℃12000r/min離心10min；

④離心完畢后，取大約600μL上清液至一個(gè)新的2.0mL離心管中，隨后加入Tris飽和酚和氯仿各0.5mL，蓋緊管蓋，在冰上緩慢地口底顛倒離心管，持續(xù)20min，4℃12000r/min離心10min；

⑤離心完畢后，取上清液500μL左右加入到一個(gè)新的2.0mL離心管中，加入1mL氯仿，蓋緊管蓋，在冰上緩慢地口底顛倒離心管，持續(xù)20min，隨后4℃12000r/min離心10min；

⑥離心完畢后，取大約300μL上清液至一個(gè)新的1.5mL離心管中，加入1mL預(yù)冷的無水乙醇，蓋緊管蓋，緩慢地口底顛倒離心管數(shù)分鐘，隨后-20℃放置半小時(shí)，出現(xiàn)白色絮狀DNA沉淀；

⑦4℃12000r/min離心10min，棄掉上清。加入1mL 70％乙醇，蓋緊管蓋，在冰上緩慢地來回顛倒離心管10min，4℃12000r/min離心10min，小心倒掉乙醇；

⑧再一次向離心管中加入500μL 70％乙醇，蓋緊管蓋，緩慢地口底顛倒離心管，然后4℃12000r/min離心3-5min，小心倒掉乙醇，將管倒置于吸水紙上；

⑨待干燥后，加入30-50μL滅菌超純水溶解。從溶解后的原液中吸取1μL至PCR管中，用滅菌水稀釋十倍，隨后用核酸定量儀測OD₂₆₀和OD₂₈₀比值，檢測提取DNA的濃度和純度。

3.3瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

①將凝膠電泳槽洗干凈，將干凈的制膠底板放入膠盒中，插上梳子；

②制作2％濃度的瓊脂糖凝膠。稱取0.80g瓊脂糖，轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入1×TBE 40mL使其懸浮，微波爐中加熱。待煮沸至溶液透明，沒有半透明的顆粒存在是拿出，待其冷卻至不燙手時(shí)(約60℃)加入終濃度為0.5μg/mL的EB，輕微搖動；

③混勻后立即將瓊脂糖溶液到入槽內(nèi)。如出現(xiàn)氣泡，用移液器槍頭移出；

④約30-40min后凝膠完全冷卻凝固，拔掉梳子，將凝膠移入電泳槽中；

⑤向電泳槽中加入1×TBE緩沖液，使液面高出膠面2-5mm；

⑥取DNA樣品6μL，統(tǒng)一上樣，并將DNA Marker加在一邊。110V電壓電泳35min；

⑦在紫外分析儀上觀察，如果有RNA則需要純化，如果有明顯降解不能用，需重新提取相應(yīng)樣品的DNA。

3.4DNA的純化

①500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其終濃度為0.1％，加入蛋白酶K至終濃度達(dá)到100μg/mL，55℃保溫10h左右；

②等體積苯酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)和氯仿分別抽提一次；

③12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中；

④加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀DNA；

⑤倒掉液體，70％乙醇洗滌后涼干，加入60μL滅菌超純水溶解，4℃待檢測。

3.5分光光度法檢測DNA

用紫外光光度計(jì)測定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計(jì)算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。DNA濃度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀釋倍數(shù)。DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μL，存于-20℃?zhèn)溆?，其余的存放?40℃。

3.6PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個(gè)反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和1次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個(gè)數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個(gè)1.5mL離心管中，充分混勻后瞬時(shí)離心，再分裝到每個(gè)0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系包括2×Taq PCR MasterMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，濃度為2×)6.0μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL(上下游引物濃度為10pmol/μL)；基因組DNA(濃度為100ng/μL豬基因組DNA)0.5μL；去離子水5.0μL；共12.5μL體積的PCR擴(kuò)增體系。

3.7PCR反應(yīng)的程序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5.0℃，預(yù)變性3min；95.0℃，變性30s；63.9℃復(fù)性30s；72.0℃延伸25s，35個(gè)循環(huán)之后，72.0℃延伸10min，4.0℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。

3.8擴(kuò)增PCR產(chǎn)物后瓊脂糖凝膠電泳分析

①制作2％的瓊脂糖凝膠，點(diǎn)樣后110V電壓電泳35min；

②待分子量不同的DNA片段分離清晰時(shí)，在BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)成像；

③根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳成像分析Indel多態(tài)性。

利用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)照相分析，判斷Indel的多態(tài)性：

公豬基因組KDM5B基因35-bp Indel多態(tài)性的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果為：ID基因型表現(xiàn)為279bp和244bp兩條帶，II基因型表現(xiàn)為279bp一條帶，DD基因型表現(xiàn)為244bp一條帶。

4.公豬KDM5B基因indel位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析

基因型頻率是指一個(gè)群體中某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。P_TT＝N_TT/N，其中P_TT代表某一位點(diǎn)的TT基因型頻率；N_TT表示群體中具有TT基因型的個(gè)體數(shù)；N為檢測群體的總數(shù)量。

基因頻率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對其等位基因總數(shù)的相對比率。計(jì)算的公式可以寫成：P_T＝(2N_TT+N_Ta1+N_Ta2+N_Ta3+N_Ta4+……+N_Tan)/2N

式中，P_T表示等位基因T頻率，N_TT表示群體中具有TT基因型的個(gè)體數(shù)量，N_Tai表示群體中具有Tai基因型個(gè)體數(shù)量，a1～an為等位基因T的n個(gè)互不相同的復(fù)等位基因。不同品種公豬KDM5B基因35-bp Indel位點(diǎn)的等位基因型頻率及等位基因頻率如表2所示。長白豬、大白豬的等位基因“I”的頻率分別為0.419和0.671，相應(yīng)的等位基因“D”的頻率為0.581和0.329，等位基因“I”和“D”的頻率大于1％，屬于穩(wěn)定存在的Indel類型。

表2公豬KDM5B基因35-bp Indel基因頻率及基因型頻率分布表

5.公豬KDM5B基因Indel位點(diǎn)基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析

基因型數(shù)據(jù)：PCR擴(kuò)增后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判斷的基因型。

生產(chǎn)數(shù)據(jù)：40日齡長白豬公豬、15日齡和40日齡大白豬公豬的睪丸重、睪丸長軸長、睪丸短軸長數(shù)據(jù)。

關(guān)聯(lián)分析模型：利用SPSS(18.0)軟件來分析品種，環(huán)境等因素與生產(chǎn)性狀相關(guān)性。首先要對所得數(shù)據(jù)描述性的統(tǒng)計(jì)分析，來確定是不是存在離群值。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的特性，利用方差分析、多元線性模型或者t分析進(jìn)而來分析基因型的效應(yīng)。在數(shù)據(jù)處理的過程中，依據(jù)影響體重、體尺生長發(fā)育的指標(biāo)的因素的不同，考慮到個(gè)體的效應(yīng)，基因之間的互作以及基因型的效應(yīng)，采用固定的模型來進(jìn)行相關(guān)分析。此外，根據(jù)實(shí)際條件來進(jìn)行取舍，完整模型如下所示：Y＝μ+G+E，其中，Y：個(gè)體表型記錄；u：總體均值；G：標(biāo)記基因型效應(yīng)；E：隨機(jī)誤差。

結(jié)果表明：公豬KDM5B基因不同基因型頻率與等位基因頻率的分布對公豬繁殖性狀(睪丸重、睪丸短軸長)均有顯著影響。

由表3可以看出，在對62頭40日齡長白豬公豬群體的研究中，KDM5B基因35-bp Indel多態(tài)性對40日齡長白豬公豬的睪丸重(P＝0.028)和睪丸短軸長(P＝0.013)均具有顯著影響(P<0.05)。

因此，KDM5B基因NC_010452.3:g.52599_52633位點(diǎn)35-bp Indel是長白豬公豬繁殖性狀篩選的Indel遺傳標(biāo)記。

表3 KDM5B基因35-bp Indel位點(diǎn)與40日齡長白豬公豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析

注：平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差右上角的不同字母(a，b)代表差異的顯著性(*P<0.05)

因此，選擇具有II基因型的個(gè)體，從而加快具有優(yōu)良繁殖性狀的公豬的良種選育速度。

核苷酸序列表

<110> 西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120>一種公豬KDM5B基因插入/缺失多態(tài)性的檢測方法及其應(yīng)用

<160> 3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggcgactggt gagcacta 18

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aattacttca agccaaccaa acag 24

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> NC 010452.3:g.52599 52633 插入/缺失序列

<400> 3

aagctgatca ttcagcatac cattgatcca gaggg 35