本發(fā)明涉及一種東方鲀的分子鑒別方法，屬生物分子檢測領域，主要用于東方鲀屬魚雌雄性別的鑒別。
背景技術：
：河鲀魚主要是指硬骨魚綱、腹鰭亞綱、鱸形總目、鲀形目、東方鲀屬(Takifugu.sp)的魚。常見的養(yǎng)殖經(jīng)濟品種有紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)、暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)和菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)等。在我國魚類養(yǎng)殖業(yè)中，東方鲀屬魚是重要養(yǎng)殖品種，目前年總產(chǎn)量已達3萬噸以上。隨著農(nóng)業(yè)部辦公廳、國家食品藥品監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布了《關于有條件放開養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀加工經(jīng)營的通知》，相信河鲀養(yǎng)殖業(yè)將得到進一步的發(fā)展。但由于其養(yǎng)殖大部分是粗放式，品質(zhì)無法保證，養(yǎng)殖者時虧時贏，收入無法保證。如何提高品質(zhì)改變這一狀況，越來越引起了魚類研究者的重視。相對于制備細膩鮮美生魚片的魚肉，被稱為“白子”的河鲀雄魚精巢更是價格十倍于魚肉的奢侈品。帶有‘白子’的雄魚售價是雌魚的1.5--2倍。因此，全雄化技術開發(fā)成了河鲀養(yǎng)殖業(yè)界的共識。全雄魚苗種培育的技術路線是：通過餌料中添加雌性激素或浸浴的方法誘導XY雄魚轉(zhuǎn)性為“偽雌魚”，“偽雌魚”與正常XY雄魚交配產(chǎn)生YY“超雄魚”，“超雄魚”與XX的正常雌魚交配的后代全部為雄魚。在這個過程中需要將XY“偽雌魚”和YY“超雄魚”從正常的魚苗群中檢出。由于河鲀雌雄個體不具第二性征不能通過外觀鑒別；并且在育種研究中，更不可能采用解剖的方法。以往的方法是通過后代測交的方法來檢出。所以整個過程需要五代半的時間。由于上述三種河鲀魚的成熟周期雄魚為2年，雌魚為3年，這樣整個的實驗過程起碼在十年以上。由于其個體較大，長時間的保養(yǎng)需要大量的水體，餌料，人工成本，加之病害的風險使得這個有重大前途的育種項目幾乎不可能得到開展。因此開發(fā)一種準確鑒別河鲀基因性別的分子方法對于開展全雄河鲀育種具有十分重大的意義。發(fā)明專利CN200510045128.0公開了一種東方鲀屬河豚魚早期性別的鑒別方法，該方法首先提取成熟河豚魚尾鰭組織mRNA，利用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成雙鏈cDNA，以此為模板，利用cDNA-AFLP法經(jīng)過預擴增和選擇性擴增、AFLP電泳檢測，獲得雌雄河豚魚尾鰭組織的差異核酸片段，進一步克隆該片段并測序，后根據(jù)測得序列設計出特異引物；利用該引物對1齡以上雌雄河豚魚進行驗證。該發(fā)明需要經(jīng)過mRNA提取、反轉(zhuǎn)錄、AFLP-PCR、電泳等多個過程，不僅實驗過程繁瑣、不易操作而且所需的內(nèi)切酶等試劑的價格也相對昂貴。發(fā)明專利CN201310278876.8公開了一種快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的引物和方法，該方法使用一組引物，能夠快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別，具體是采用上游引物F1和下游引物R1進行第一輪PCR擴增，進行電泳檢測，呈現(xiàn)625bp條帶的為性別差異基因序列；將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋后作為模板，采用上游引物F1和下游引物InnerR5進行第二輪PCR擴增，進行電泳檢測，擴增出334bp條帶的為紅鰭東方鲀雄性個體，該位置無擴增條帶的為紅鰭東方鲀雌性個體。這一發(fā)明所述的方法適用范圍窄，并不適用于其它東方鲀屬魚類的鑒別，并且該發(fā)明方法包括兩輪PCR擴增鑒定步驟，仍較為繁瑣，更重要的是上述兩種方法均不能鑒別YY“超雄魚”。因此，建立一種準確、快速、簡便的只通過一輪PCR檢測就能夠鑒定多數(shù)東方鲀屬河鲀魚基因性別的方法顯得尤為重要。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在提供利用分子標記方法對東方鲀屬魚類基因性別進行鑒定的方法及其引物與試劑盒，有助于快速、準確鑒別不同基因性別的東方鲀屬魚類，在東方鲀性別選擇育種和遺傳保種中有極大的應用價值。為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種用于準確、快速、簡便的能夠鑒定多數(shù)東方鲀屬魚類性別的引物，所述引物包括兩條正向引物和一條反向引物，序列如下：本發(fā)明還提供了一種準確、快速、簡便檢測東方鲀屬魚類性別的方法，所述方法包括以下步驟：提取待測東方鲀的DNA樣品；采用所述引物，對DNA樣品進行PCR擴增；將擴增產(chǎn)物進行電泳測試，通過電泳測試結(jié)果判斷東方鲀性別。如果提取的DNA樣品該位點為G，那么ZQ_F4(以下稱F4)和ZQ_R(以下稱R)引物有擴增，而ZQ_F3(以下稱F3)和R引物沒有擴增；反之，如果該位點為C，那么F3和R引物有擴增，而F4和R引物沒有擴增。如果該位點為G/C雜合，那么F4/R引物和F3/R引物都有擴增。當該位點為C時，表明該樣本為XX雌魚；當該位點為G/C雜合時，表明樣本為XY雄魚；該位點為G時，表明樣本為YY超雄魚。所述PCR電泳測試中，PCR反應體系20μL，所述體系包括模板DNA25ng、10×Buffer2μL、10mMdNTPs0.4μL、10μMF-primer0.25μL、10μMR-primer0.25μL、5U/μLTaq酶0.2μL。所述PCR電泳測試中，PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性35s，TM退火35s，72℃延伸40s，循環(huán)33次；72℃延伸5min；4℃保存。所述PCR電泳測試中，PCR退火溫度為55℃至75℃。進一步的，所述PCR電泳測試中，PCR退火溫度可以為56.7℃、59℃、62.3℃、65.9℃、67.7℃、69.5℃或72.2℃。優(yōu)選的，所述PCR電泳測試中，PCR退火溫度為65℃。本發(fā)明還涉及一種鑒定東方鲀屬魚類雌雄不同表達的引物和方法，其特征在于，所述引物和方法適用于東方鲀屬魚類的紅鰭東方鲀、暗紋東方鲀和菊黃東方鲀。有益的技術效果本發(fā)明通過提取檢測樣本的基因組DNA，并應用東方鲀屬魚類性別特異性引物，進行簡單PCR擴增電泳測試，即可快速鑒定包括紅鰭東方鲀、暗紋東方鲀和菊黃東方鲀等在內(nèi)的東方鲀屬魚類幼魚或成魚性別，具有方法簡單、速度快，應用廣泛的優(yōu)點。附圖說明圖1是實施例1所得48尾紅鰭東方鲀DNA經(jīng)PCR反應后的電泳檢測結(jié)果；圖2是實施例2所得48尾菊黃東方鲀DNA經(jīng)PCR反應后的電泳檢測結(jié)果；圖3是實施例3所得48尾暗紋東方鲀DNA經(jīng)PCR反應后的電泳檢測結(jié)果；圖4是雌雄個體不同退火溫度擴增電泳結(jié)果。具體實施方式以下采用實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，借此對本發(fā)明如何應用技術手段來解決技術問題，并達成技術效果的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。下述實施例中PCR退火溫度的確定選擇已知雌性個體6號和雄性個體9號為模板，對PCR的退火溫度進行梯度檢測，PCR儀設定的梯度為65℃±8度。將做好的PCR體系分別放置在退火溫度為56.7，59，62.3，65.9，67.7，69.5，72.2℃的PCR儀孔中，PCR結(jié)束后取5微升PCR產(chǎn)物，在2％的瓊脂糖中電泳檢測。電泳設定為90v，25min。雌雄個體不同退火溫度擴增電泳結(jié)果如圖4所示，依據(jù)電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)實驗中退火溫度為65℃時效果最好。實施例1選取48尾紅鰭東方鲀6月齡幼魚進行檢測。取鰭條DNA樣，使用正向引物ZQ_F3：TCCTGGAAGGCTCTGTCC、正向引物ZQ_F4：TCCTGGAAGGCTCTGTCG、反向引物ZQ_R：AGTGTTGCGGTATGTAAGG，進行PCR擴增及電泳測試，PCR反應體系20μL，所述體系包括模板DNA25ng、10×Buffer2μL、10mMdNTPs0.4μL、10μMF-primer0.25μL、10μMR-primer0.25μL、5U/μLTaq酶0.2μL，其余用水補齊。PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性35s，TM退火35s，72℃延伸40s，循環(huán)33次；72℃延伸5min；4℃保存。退火溫度65℃。電泳結(jié)果見附圖1，取性腺樣品用波恩氏液固定24h后保存于體積分數(shù)為70％的酒精中。樣本經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟包埋后，作連續(xù)切片，切片厚度為5～μm，HE染色，OlympusE-300光學顯微鏡觀察拍照。觀察性腺組織結(jié)構，根據(jù)結(jié)構圖判定樣本性別用以鑒定PCR結(jié)果的準確性。表1紅鰭東方鲀鑒定結(jié)論序號雌/雄序號雌/雄序號雌/雄序號雌/雄序號雌/雄序號雌/雄25雌＊33雌41雄49雄57雌65雄26雌34雌42雄50雄58雄66雄27雌35雌43雄51雄59雄67雄28雄36雌44雌52雄60雌68雄29雌37雄45雄53雄61雄＊69雌＊30雌38雄46雌54雄62雄＊70雌＊31雄39雄47雄55雌63雌71雄32雄40雌48雌56雌64雌72雄表1中：＊：樣本不能根據(jù)PCR電泳結(jié)果判定雌雄。DNA：部分樣本經(jīng)重提DNA后可由電泳結(jié)果判定雌雄，第二次仍不能判定時，將PCR產(chǎn)物直接測序判定雌雄。結(jié)果顯示，采用本發(fā)明所述引物和方法能夠快速、準確、有效的鑒定紅鰭東方鲀性別。實施例2選取48尾菊黃東方鲀6月齡幼魚進行檢測。取鰭條DNA樣，使用正向引物ZQ_F3：TCCTGGAAGGCTCTGTCC、正向引物ZQ_F4：TCCTGGAAGGCTCTGTCG、反向引物ZQ_R：AGTGTTGCGGTATGTAAGG，進行PCR電泳測試，PCR反應體系20μL，所述體系包括模板DNA25ng、10×Buffer2μL、10mMdNTPs0.4μL、10μMF-primer0.25μL、10μMR-primer0.25μL、5U/μLTaq酶0.2μL，其余用水補齊。PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性35s，TM退火35s，72℃延伸40s，循環(huán)33次；72℃延伸5min；4℃保存。退火溫度65℃。電泳結(jié)果見附圖2。PCR結(jié)果準確性驗證方法同實施例1。表2菊黃東方鲀鑒定結(jié)論結(jié)果顯示，采用本發(fā)明所述引物和方法能夠快速、準確、有效的鑒定菊黃東方鲀性別。實施例3選取48尾暗紋東方鲀6月齡幼魚進行檢測。取鰭條DNA樣，使用正向引物ZQ_F3：TCCTGGAAGGCTCTGTCC、正向引物ZQ_F4：TCCTGGAAGGCTCTGTCG、反向引物ZQ_R：AGTGTTGCGGTATGTAAGG，進行PCR電泳測試PCR反應體系20μL，所述體系包括模板DNA25ng、10×Buffer2μL、10mMdNTPs0.4μL、10μMF-primer0.25μL、10μMR-primer0.25μL、5U/μLTaq酶0.2μL，其余用水補齊。PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性35s，TM退火35s，72℃延伸40s，循環(huán)33次；72℃延伸5min；4℃保存。退火溫度65℃。電泳結(jié)果見附圖3。PCR結(jié)果準確性驗證方法同實施例1。表3暗紋東方鲀鑒定結(jié)論121DNA129雄137雄145雄153雌161雌122雌130雄138雄146雌154雄162雌123雌131雄139雄147雄155雄163雄124雌132雄140雌＊148雄156雌164雄125雄133雄141雄149雌157雄165雄126雄134雌142雄150雌158雌166雄＊127雌135雌143雌151雌159雄167雌128雌136雌144雄152雄160雄168雌結(jié)果顯示，采用本發(fā)明所述引物和方法能夠快速、準確、有效的鑒定暗紋東方鲀性別。所有上述的首要實施這一知識產(chǎn)權，并沒有設定限制其他形式的實施這種新產(chǎn)品和/或新方法。本領域技術人員將利用這一重要信息，上述內(nèi)容修改，以實現(xiàn)類似的執(zhí)行情況。但是，所有修改或改造基于本發(fā)明新產(chǎn)品屬于保留的權利。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員可能利用上述揭示的技術內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍。當前第1頁1 2 3