本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于鑒定核果和仁果上六種褐腐病菌的實(shí)時熒光PCR檢測試劑盒、檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

褐腐病(Brown Rot)是桃、杏、櫻桃等核果及蘋果、梨等仁果上重要的病害。褐腐病可以危害多種核果仁果植物引起花腐、枝干潰瘍、果實(shí)腐爛等不同癥狀，其中危害最嚴(yán)重的是造成產(chǎn)中和產(chǎn)后的果實(shí)腐爛。2001年，美國南部的喬治亞州桃上褐腐病大面積發(fā)生，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)430萬美元，由于防治褐腐病購買殺菌劑帶來的間接經(jīng)濟(jì)損失為150萬美元(Phillips,2002)。根據(jù)對北京地區(qū)桃褐腐病的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，桃褐腐病的發(fā)病率為20％，嚴(yán)重時發(fā)病率達(dá)100％，嚴(yán)重影響果實(shí)的食用價值和果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入(陳笑瑜等，2003)。其它地區(qū)也經(jīng)常報道褐腐病的發(fā)生和危害(林永安等，2004；孫寶海，2006；毛立仁等，2007)。

褐腐病的病原菌為鏈核盤菌屬(Monilinia)，分類上屬于子囊菌門(Ascomycete)，盤菌綱(Discomycete)，柔膜菌目(Helotiales)，核盤菌科(Sclerotiniaceae)；無性態(tài)屬于串珠霉屬(Monilia)。根據(jù)最新的研究進(jìn)展，目前世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了6種褐腐病菌：Monilinia fructicola、Monilinia fructigena、Monilinia laxa、Monilia polystroma、Monilia mumecola以及Monilia yunnanensis。這些褐腐病菌在世界各地的分布不同，M.fructicola主要分布在北美和亞洲地區(qū)，仍然是歐州地區(qū)的重要檢疫對象。M.fructigena主要分布在歐州。M.laxa分布在歐洲、北美洲。在我國，發(fā)現(xiàn)了所有世界上已經(jīng)報道的種類，普遍存在M.yunnanensis，在一些地區(qū)發(fā)現(xiàn)了M.fructicola、M.polystroma，在局部地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了M.mumecola。M.fructigena和M.laxa僅在新疆的野果林中檢測到。因此，一些種群屬于國際間或國內(nèi)地區(qū)間的檢疫對象。我國是桃、蘋果、梨等核果仁果重要的進(jìn)出口國家，隨著各國果品貿(mào)易的不斷加強(qiáng)，急切需要加強(qiáng)對褐腐病菌的檢疫工作。

褐腐病菌的準(zhǔn)確檢測和鑒定顯得尤為重要。幾種褐腐病菌的形態(tài)特征非常相似，缺少經(jīng)驗(yàn)時很難準(zhǔn)確判斷。近年發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)也在褐腐病菌的種類鑒定中得到了廣泛應(yīng)用(Ioos et al.,2000；Hughes,et al.2000；Ma et al.,2003；Cote et al.,2004；Gell et al.,2007)。但根據(jù)文獻(xiàn)報道以及本研究小組的測試，這些方法都不能用于準(zhǔn)確鑒定6種褐腐病菌。在6種褐腐病菌中，M.mumecola與M.laxa最相近，M.yunnanensis與M.polystroma和M.fructigena最相近，在褐腐病菌的鑒定中難以區(qū)分。

Real-time PCR方法是近年發(fā)展起來可用于快速檢測病原菌的分子方法，目前在褐腐病菌的研究中已經(jīng)開發(fā)用于檢測Monilinia fructicola、M.laxa等。目前仍然缺少區(qū)分6種褐腐病菌的Real-time PCR檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何鑒定或輔助鑒定褐腐病菌。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供一種用于鑒定或輔助鑒定褐腐病菌的成套引物。

本發(fā)明提供的用于鑒定或輔助鑒定褐腐病菌的成套引物包括Mfc引物探針組合物、Mla引物探針組合物、Mmu引物探針組合物、Mfg引物探針組合物、Myu引物探針組合物和Mpo引物探針組合物；

所述Mfc引物探針組合物由Mfc引物對和Mfc探針組成；所述Mfc引物對由上游引物MfcF和下游引物MfcR組成；所述上游引物MfcF的核苷酸序列為序列表的序列1，所述下游引物MfcR的核苷酸序列為序列表的序列2；所述Mfc探針的核苷酸序列為序列表的序列3；

所述Mla引物探針組合物由Mla引物對和Mla探針組成；所述Mla引物對由上游引物MlaF和下游引物MlaR組成；所述上游引物MlaF的核苷酸序列為序列表的序列4，所述下游引物MlaR的核苷酸序列為序列表的序列5；所述Mla探針的核苷酸序列為序列表的序列6；

所述Mmu引物探針組合物由Mmu引物對和Mmu探針組成；所述Mmu引物對由上游引物MmuF和下游引物MmuR組成；所述上游引物MmuF的核苷酸序列為序列表的序列7，所述下游引物MmuR的核苷酸序列為序列表的序列8；所述Mmu探針的核苷酸序列為序列表的序列9；

所述Mfg引物探針組合物由Mfg引物對和Mfg探針組成；所述Mfg引物對由上游引物MfgF和下游引物MfgR組成；所述上游引物MfgF的核苷酸序列為序列表的序列10，所述下游引物MfgR的核苷酸序列為序列表的序列11；所述Mfg探針的核苷酸序列為序列表的序列12；

所述Myu引物探針組合物由Myu引物對和Myu探針組成；所述Myu引物對由上游引物MyuF和下游引物MyuR組成；所述上游引物MyuF的核苷酸序列為序列表的序列13，所述下游引物MyuR的核苷酸序列為序列表的序列14；所述Myu探針的核苷酸序列為序列表的序列15；

所述Mpo引物探針組合物由Mpo引物對和Mpo探針組成；所述Mpo引物對由上游引物MpoF和下游引物MpoR組成；所述上游引物MpoF的核苷酸序列為序列表的序列16，所述下游引物MpoR的核苷酸序列為序列表的序列17；所述Mpo探針的核苷酸序列為序列表的序列18。

上述成套引物中，

每個所述引物探針組合物中的上游引物和下游引物的摩爾比均為1：1。

上述成套引物中，

在所述探針的5’末端均修飾熒光基團(tuán)FAM；

在所述Mfc探針的3’末端修飾熒光基團(tuán)BHQ；

在所述Mla探針、所述Mfg探針、所述Myu探針、所述Mmu探針和所述Mpo探針的3’末端均修飾熒光基團(tuán)MGB。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明又提供了一種用于鑒定或輔助鑒定褐腐病菌的實(shí)時熒光PCR試劑。

本發(fā)明提供的用于鑒定或輔助鑒定褐腐病菌的實(shí)時熒光PCR試劑包括上述成套引物。

上述實(shí)時熒光PCR試劑中，

每個所述引物探針組合物中的兩條引物在所述實(shí)時熒光PCR試劑中的終濃度均為0.5μM。

上述實(shí)時熒光PCR試劑中，

所述Mfc探針在所述實(shí)時熒光PCR試劑中的最佳濃度為0.2μM；

所述Mla探針在所述實(shí)時熒光PCR試劑中的最佳濃度為0.8μM；

所述Mmu探針在所述實(shí)時熒光PCR試劑中的最佳濃度為1μM；

所述Mfg探針在所述實(shí)時熒光PCR試劑中的最佳濃度為0.5μM；

所述Myu探針在所述實(shí)時熒光PCR試劑中的最佳濃度為0.8μM；

所述Mpo探針在所述實(shí)時熒光PCR試劑中的最佳濃度為1μM。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種用于鑒定或輔助鑒定褐腐病菌的試劑盒。

本發(fā)明提供的用于鑒定或輔助鑒定褐腐病菌的試劑盒包括上述成套引物或上述實(shí)時熒光PCR試劑。

上述試劑盒中，每種引物探針組合物均單獨(dú)包裝，每種引物探針組合物中的引物和探針均單獨(dú)包裝。

上述試劑盒還可包括實(shí)時熒光PCR反應(yīng)緩沖液、熱啟動DNA聚合酶和dNTP。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了上述成套引物或上述實(shí)時熒光PCR試劑或上述試劑盒的新用途。

本發(fā)明提供了上述成套引物或上述實(shí)時熒光PCR試劑或上述試劑盒在如下(1)-(10)中任一種中的應(yīng)用：

(1)鑒定或輔助鑒定Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和/或Monilia polystroma；

(2)制備鑒定或輔助鑒定Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和/或Monilia polystroma的產(chǎn)品；

(3)鑒定或輔助鑒定待測菌株是否為褐腐病菌；

(4)制備鑒定或輔助鑒定待測菌株是否為褐腐病菌的產(chǎn)品；

(5)鑒定或輔助鑒定待測菌株為褐腐病菌中的哪一種；

(6)制備鑒定或輔助鑒定待測菌株為褐腐病菌中的哪一種的產(chǎn)品；

(7)檢測或輔助檢測待測樣品是否感染褐腐病菌；

(8)制備檢測或輔助檢測待測樣品是否感染褐腐病菌的產(chǎn)品；

(9)區(qū)分或輔助區(qū)分Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和Monilia polystroma；

(10)制備區(qū)分或輔助區(qū)分Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和Monilia polystroma的產(chǎn)品。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種鑒定或輔助鑒定待測菌株是否為褐腐病菌的方法。

本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測菌株是否為褐腐病菌的方法包括以下步驟：

以待測菌株的基因組DNA為模板，分別采用上述成套引物中的所述Mfc引物探針組合物、所述Mla引物探針組合物、所述Mmu引物探針組合物、所述Mfg引物探針組合物、所述Myu引物探針組合物和所述Mpo引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR；

若實(shí)時熒光PCR滿足如下1)-6)中的至少一種，則待測菌株為或候選為褐腐病菌：

1)采用所述Mfc引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

2)采用所述Mla引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

3)采用所述Mmu引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

4)采用所述Mfg引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

5)采用所述Myu引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

6)采用所述Mpo引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

若實(shí)時熒光PCR不滿足如上1)-6)中的任一種，則待測菌株不為或候選不為褐腐病菌。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種鑒定或輔助鑒定待測菌株為褐腐病菌中的哪一種的方法。

本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測菌株為褐腐病菌中的哪一種的方法包括如下步驟：

以待測菌株的基因組DNA為模板，分別采用上述成套引物中的所述Mfc引物探針組合物、所述Mla引物探針組合物、所述Mmu引物探針組合物、所述Mfg引物探針組合物、所述Myu引物探針組合物和所述Mpo引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR；

如果采用所述Mfc引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)，則待測菌株為或候選為M.fructicola；

如果采用所述Mla引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)，則待測菌株為或候選為M.laxa；

如果采用所述Mmu引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)，則待測菌株為或候選為M.mumecola；

如果采用所述Mfg引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)，則待測菌株為或候選為M.fructigena；

如果采用所述Myu引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)，則待測菌株為或候選為M.yunnanensis；

如果采用所述Mpo引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)，則待測菌株為或候選為M.polystroma。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明最后提供了一種檢測或輔助檢測待測樣品是否感染褐腐病菌的方法。

本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測樣品是否感染褐腐病菌的方法包括以下步驟：

以待測菌株的基因組DNA為模板，分別采用上述成套引物中的所述Mfc引物探針組合物、所述Mla引物探針組合物、所述Mmu引物探針組合物、所述Mfg引物探針組合物、所述Myu引物探針組合物和所述Mpo引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR；

若實(shí)時熒光PCR滿足如下1)-6)中的至少一種，則待測樣品感染或候選感染褐腐病菌：

1)采用所述Mfc引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

2)采用所述Mla引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

3)采用所述Mmu引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

4)采用所述Mfg引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

5)采用所述Myu引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

6)采用所述Mpo引物探針組合物進(jìn)行實(shí)時熒光PCR顯示陽性反應(yīng)；

若實(shí)時熒光PCR不滿足如上1)-6)中的任一種，則待測樣品未感染或候選未感染褐腐病菌。

上述方法中，實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)數(shù)據(jù)由熒光定量PCR儀qTOWER2.0自帶軟件自動收集和分析，生成擴(kuò)增曲線圖。在獲得的擴(kuò)增曲線圖中：當(dāng)dRn超過閾值，且Ct值小于30，則被認(rèn)為是陽性反應(yīng)；否則，被認(rèn)為是陰性反應(yīng)。Ct值是指熒光值開始達(dá)到指數(shù)增長時的循環(huán)數(shù)；dRn是指熒光強(qiáng)度增長指數(shù)；閾值是指熒光本底信號。

上述成套引物或上述實(shí)時熒光PCR試劑或上述試劑盒或上述應(yīng)用或上述方法，其特征在于：所述褐腐病菌為Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis或Monilia polystroma。

本發(fā)明以6種褐腐病菌為研究對象，開發(fā)區(qū)分M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.fructigena、M.polystroma以及M.yunnanensis的Real-time PCR引物、探針及快速檢測方法，為國際貿(mào)易中果品的快速通關(guān)提供有力的技術(shù)支持。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2中針對M.fructicola的Real-time PCR特異性檢測擴(kuò)增結(jié)果。其中，1-5:M.fructicola；6-8:M.laxa；9-11:M.yunnanensis；12-14:M.fructigena；15-17:M.polystroma；18-20:M.mumecola；21:Botryosphaeria dothidea；22:Alternaria sp.；23:Botrytis cinerea；24:Colletotrichum fructicola；25:Penicillium spp.；26:陰性對照。

圖2為實(shí)施例2中檢測M.fructicola的定量PCR靈敏度結(jié)果。

圖3為實(shí)施例3中針對M.laxa的Real-time PCR特異性檢測結(jié)果。其中，1-5:M.laxa；6-8:M.fructicola；9-11:M.yunnanensis；12-14:M.fructigena；15-17:M.polystroma；18-20:M.mumecola；21:Botryosphaeria dothidea；22:Alternaria sp；23:Botrytis cinerea；24:Colletotrichum fructicola；25:Penicillium spp.；26:陰性對照。

圖4為實(shí)施例3中檢測M.laxa的定量PCR靈敏度結(jié)果。

圖5為實(shí)施例4中針對M.mumecola的Real-time PCR特異性檢測結(jié)果。其中，1-3:M.mumecola；4-6:M.fructicola；7-9:M.laxa；10-12:M.fructigena；13-15:M.yunnanensis；16-18:M.polystroma；19:Botryosphaeria dothidea；20:Alternaria spp.；21:Botrytis cinerea；22:Colletotrichum fructicola；23:Penicillium spp.；24:陰性對照。

圖6為實(shí)施例4中檢測M.mumecola的定量PCR靈敏度結(jié)果。

圖7為實(shí)施例5中針對M.fructigena的Real-time PCR特異性檢測結(jié)果。其中，1-5:M.fructigena；6-8:M.fructicola；9-11:M.laxa；12-14:M.yunnanensis；15-17:M.polystroma；18-20:M.mumecola；21:Botryosphaeria dothidea；22:Alternaria sp.；23:Botrytis cinerea；24:Colletotrichum fructicola；25:Penicillium spp.；26:陰性對照。

圖8為實(shí)施例5中檢測M.fructigena的定量PCR靈敏度結(jié)果。

圖9為實(shí)施例6中針對M.yunnanensis的Real-time PCR特異性檢測結(jié)果。其中，1-5:M.yunnanensis；6-8:M.fructicola；9-11:M.laxa；12-14:M.fructigena；15-17:M.polystroma；18-20:M.mumecola；21:Botryosphaeria dothidea；22:Alternaria sp.；23:Botrytis cinerea；24:Colletotrichum fructicola；25:Penicillium spp.；26:陰性對照。

圖10為實(shí)施例6中特異性檢測M.yunnanensis的定量PCR靈敏度結(jié)果。

圖11為實(shí)施例7中針對M.polystroma的Real-time PCR特異性檢測結(jié)果。其中，1-5:M.polystroma；6-8:M.fructicola；9-11:M.laxa；12-14：fructigena；15-17:M.yunnanensis；18-20:M.mumecola；21:Botryosphaeria dothidea；22:Alternaria sp.；23:Botrytis cinerea；24:Colletotrichum fructicola；25:Penicillium spp.；26:陰性對照。

圖12為實(shí)施例7中特異性檢測M.polystroma的定量PCR靈敏度結(jié)果。

圖13為對比例1中的褐腐病菌的檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的6種褐腐病菌：

美澳型核果褐腐病菌Monilinia fructicola(Mfc)、核果褐腐病菌Monilinia laxa(Mla)和仁果褐腐病菌Monilinia fructigena(Mfg)均在非專利文獻(xiàn)“Ioos&Frey，2000，European Journal of Plant Pathology 106:373-378”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；

Monilia polystroma(Mpo)在非專利文獻(xiàn)“van Leeuwen et al.,2002,Mycological Research 106:444-451”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；

Monilia mumecola(Mmu)在非專利文獻(xiàn)“Harada et al.,2004,Journal of general Plant Pathology 70:297-307”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；

Monilia yunnanensis(Myu)在非專利文獻(xiàn)“Hu et al.,2011,Plos One 6:e24990”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；

下述實(shí)施例中的果實(shí)上的常見病菌：

灰葡萄孢Botrytis cinerea在非專利文獻(xiàn)“Jiang,J et al.,2009，Pesticide Biochemistry and Physiology 93:72-76”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；

菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum在非專利文獻(xiàn)“Liu et al.,2009,Pesticide Biochemistry and Physiology,95,106-112”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；

蘋果腐輪紋病菌Botryosphaeria dothidea在非專利文獻(xiàn)“Tang et al.,2012,Plant Disease 96(4):486-496.”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；

Alternaria在非專利文獻(xiàn)“Zhu&Xiao,2015,Phytopathology Phytopathology 105(12):1555-1567.”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；

Colletotrichum fructicola在非專利文獻(xiàn)“Zhang et al.,2015,European Journal of Plant Pathology,143(4):651-662”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；

實(shí)施例1、檢測6種褐腐病菌的試劑盒及其檢測方法

一、針對6種褐腐病菌的特異性引物和TaqMan探針的設(shè)計

選擇6種褐腐病菌(美澳型核果褐腐病菌Monilinia fructicola、核果褐腐病菌Monilinia laxa、仁果褐腐病菌Monilinia fructigena、Monilia polystroma、Monilia mumecola、Monilia yunnanensis)及其他參考菌株的漆酶基因序列及延伸因子基因序列(朱小瓊，2010)，用DNAMAN Version 6比對截齊，找到種特異性的序列區(qū)域，根據(jù)基因差異序列分別設(shè)計6種褐腐病菌特異性引物及探針：Mfc引物探針組合物、Mla引物探針組合物、Mmu引物探針組合物、Mfg引物探針組合物、Myu引物探針組合物和Mpo引物探針組合物；

Mfc引物探針組合物由Mfc引物對和Mfc探針組成；Mfc引物對由上游引物MfcF和下游引物MfcR組成；引物MfcF的核苷酸序列為序列表的序列1，引物MfcR的核苷酸序列為序列表的序列2；Mfc探針的核苷酸序列為序列表的序列3；

Mla引物探針組合物由Mla引物對和Mla探針組成；Mla引物對由上游引物MlaF和下游引物MlaR組成；引物MlaF的核苷酸序列為序列表的序列4，引物MlaR的核苷酸序列為序列表的序列5；Mla探針的核苷酸序列為序列表的序列6；

Mmu引物探針組合物由Mmu引物對和Mmu探針組成；Mmu引物對由上游引物MmuF和下游引物MmuR組成；引物MmuF的核苷酸序列為序列表的序列7，引物MmuR的核苷酸序列為序列表的序列8；Mmu探針的核苷酸序列為序列表的序列9；

Mfg引物探針組合物由Mfg引物對和Mfg探針組成；Mfg引物對由上游引物MfgF和下游引物MfgR組成；引物MfgF的核苷酸序列為序列表的序列10，引物MfgR的核苷酸序列為序列表的序列11；Mfg探針的核苷酸序列為序列表的序列12；

Myu引物探針組合物由Myu引物對和Myu探針組成；Myu引物對由上游引物MyuF和下游引物MyuR組成；引物MyuF的核苷酸序列為序列表的序列13，引物MyuR的核苷酸序列為序列表的序列14；Myu探針的核苷酸序列為序列表的序列15；

Mpo引物探針組合物由Mpo引物對和Mpo探針組成；Mpo引物對由上游引物MpoF和下游引物MpoR組成；引物MpoF的核苷酸序列為序列表的序列16，引物MpoR的核苷酸序列為序列表的序列17；Mpo探針的核苷酸序列為序列表的序列18。

設(shè)計的探針與引物通過Primer Express 3.0計算Tm值，保證引物的Tm值在58-60℃，探針的Tm值在68-70℃(Real-time PCR的引物與探針由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成)。

上述探針均為TaqMan探針，每一TaqMan探針中，在DNA分子的5’末端修飾熒光基團(tuán)FAM；在Mfc探針DNA分子的3’末端修飾熒光基團(tuán)BHQ，在Mla探針、Mfg探針、Myu探針、Mmu探針或Mpo探針DNA分子的3’末端修飾熒光基團(tuán)MGB。

本發(fā)明設(shè)計的針對6種褐腐病菌的特異引物和TaqMan探針具體見表1。

表1、針對6種褐腐病菌的特異引物和探針

二、檢測6種褐腐病菌的試劑盒

本發(fā)明的檢測6種褐腐病菌的試劑盒包括步驟一中的針對6種褐腐病菌的特異引物和探針，以及實(shí)時熒光PCR反應(yīng)緩沖液、熱啟動DNA聚合酶和dNTP。

本發(fā)明的試劑盒中，每種引物探針組合物均單獨(dú)包裝，每種引物探針組合物中的引物和探針均單獨(dú)包裝。

三、檢測6種褐腐病菌的試劑盒的使用方法

1、采用CTAB法提取待測菌株菌絲和孢子的基因組DNA。

2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，分別采用Mfc引物探針組合物、Mla引物探針組合物、Mmu引物探針組合物、Mfg引物探針組合物、Myu引物探針組合物和Mpo引物探針組合物進(jìn)行單重實(shí)時熒光PCR。設(shè)置以滅菌去離子水代替基因組DNA為空白對照。

實(shí)時熒光PCR在qTOWER2.0熒光定量PCR儀(Analytik Jena AG，Jena，Germany)中進(jìn)行。

實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)體系(20μl)：2×Master Mix 10μl(上?；瞪镉邢薰?，滅菌去離子水2μl，上游引物MfcF 1μL(引物濃度為10μmol/L)，下游引物MfcR 1μL(引物濃度為10μmol/L)，探針Mfc 4μL(探針濃度為1μmol/L)，模板DNA 2μL(10-15ng/μl)。

實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)體系中，每種引物探針組合物中的兩條引物在實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度均為0.5μM，在實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系中，Mfc探針的濃度為0.2μM，Mla探針的濃度為0.8μM，Mmu探針的濃度為1μM，Mfg探針的濃度為0.5μM，Myu探針的濃度為0.8μM，Mpo探針的濃度為1μM。

實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，最佳退火溫度退火30s，共40個循環(huán)。

實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)數(shù)據(jù)由熒光定量PCR儀qTOWER2.0自帶軟件自動收集和分析，生成擴(kuò)增曲線圖。擴(kuò)增曲線圖中：當(dāng)dRn超過閾值，且Ct值小于30(Ct值是指熒光值開始達(dá)到指數(shù)增長時的循環(huán)數(shù)，dRn是指熒光強(qiáng)度增長指數(shù)；閾值是指熒光本底信號)，則被認(rèn)為是陽性反應(yīng)；否則，被認(rèn)為是陰性反應(yīng)。

實(shí)施例2、應(yīng)用Mfc引物探針組合物鑒定M.fructicola的特異性和靈敏度

用于鑒定M.fructicola的引物探針組合物為Mfc引物探針組合物，由Mfc引物對和Mfc探針組成。Mfc引物對由表1中的MfcF和MfcR組成。Mfc探針為表1中的MfcP。該實(shí)施例的步驟一和步驟二中的供試菌株均在文獻(xiàn)“Zhu et al.2011Plant Disease95(10):1284-1291；Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物學(xué)報35(10)：1-12”中公開過。

一、引物的特異性檢測

1、供試菌株

特異性實(shí)驗(yàn)中的待測褐腐病菌都是在前期實(shí)驗(yàn)中鑒定過的菌株，具體如下：

M.fructicola菌株：來自中國的菌株323031、324051，來自美國的菌株KAC3-4、RI37和來自新西蘭的菌株NE18各1株；

M.laxa菌株：來自美國的B-C11、來自荷蘭的CBS298.31和來自法國的P3菌株各1株；

M.mumecola菌株：來自日本的3231、來自中國的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；

M.yunnanensis菌株：來自中國的ABC15、AK9-1和AL1-2各1株；

M.fructigena菌株：來自中國的HX17-1、來自英國的EA-3和來自荷蘭的CBS101502各1株；

M.polystroma菌株：來自中國的LHX12、來自日本的2319和CBS102686各1株。

特異性實(shí)驗(yàn)中的待測菌株同時還包含了近似種群B.cinerea，以及來自果實(shí)上的病菌Alternaria sp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。

2、實(shí)時熒光PCR

(1)采用CTAB法提取待測菌株菌絲和孢子的基因組DNA。

(2)以步驟(1)得到的基因組DNA為模板，采用Mfc引物探針組合物進(jìn)行單重實(shí)時熒光PCR。設(shè)置以滅菌去離子水代替基因組DNA為空白對照。

實(shí)時熒光PCR在qTOWER2.0熒光定量PCR儀(Analytik Jena AG，Jena，Germany)中進(jìn)行。

實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)體系(20μl)：2×Master Mix 10μl(上?；瞪镉邢薰?，滅菌去離子水2μl，上游引物MfcF 1μL(引物濃度為10μmol/L)，下游引物MfcR 1μL(引物濃度為10μmol/L)，探針Mfc 4μL(探針濃度為1μmol/L)，模板DNA 2μL(10-15ng/μl)。

實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，最佳退火溫度退火30s，共40個循環(huán)。

檢測結(jié)果如圖1所示。5個M.fructicola菌株均顯示陽性反應(yīng)(熒光信號呈指數(shù)增長，Ct值為24-26)。M.laxa、M.mumecola、M.fructigena、M.yunnanensis、M.polystroma均顯示陰性反應(yīng)，空白對照顯示陰性反應(yīng)。結(jié)果表明，應(yīng)用Mfc引物探針組合物鑒定M.fructicola具有良好的特異性。

二、引物的靈敏度檢測

1、供試菌株

待測褐腐病菌為M.fructicola的菌株323031。

2、實(shí)時熒光PCR

(1)采用CTAB法提取待測菌株菌絲和孢子的基因組DNA。

(2)以步驟(1)得到的基因組DNA為模板進(jìn)行梯度稀釋，采用Mfc引物探針組合物進(jìn)行單重實(shí)時熒光PCR。設(shè)置以滅菌去離子水代替基因組DNA為空白對照。

實(shí)時熒光PCR在qTOWER2.0熒光定量PCR儀(Analytik Jena AG，Jena，Germany)中進(jìn)行。

實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)體系(20μl)：2×Master Mix 10μl(上?；瞪镉邢薰?，滅菌去離子水2μl，上游引物MfcF 1μL(引物濃度為10μmol/L)，下游引物MfcR 1μL(引物濃度為10μmol/L)，探針Mfc 4μL(探針濃度為1μmol/L)，模板DNA 2μL(DNA含量為10ng、1ng、10^-1ng、10^-2ng、10^-3ng、10^-4ng、10^-5ng)。

實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，最佳退火溫度退火30s，共40個循環(huán)。

檢測結(jié)果見圖2。采用各個濃度的M.fructicola菌株的基因組DNA作為模板，Ct值隨著DNA模板濃度的降低明顯增大，當(dāng)濃度分別為10ng、1ng、10^-1ng、10^-2ng、10^-3ng、10^-4ng或10^-5ng時，Ct值依次分別為19、23、27、29、33、35或40。結(jié)果表明：應(yīng)用Mfc引物探針組合物鑒定M.fructicola，檢測限度可達(dá)10^-5ng(但此濃度下擴(kuò)增效率很低，熒光反應(yīng)在達(dá)到40個循環(huán)時才出現(xiàn)指數(shù)增長，即Ct值大于30)；當(dāng)模板濃度大于等于0.01ng時，Ct值均小于30，說明實(shí)時熒光PCR方法檢測M.fructicola的適宜模板濃度應(yīng)高于0.01ng。

實(shí)施例3、應(yīng)用Mla引物探針組合物鑒定M.laxa的特異性和靈敏度

用于鑒定M.laxa的引物探針組合物為Mla引物探針組合物，由Mla引物對和Mla探針組成。Mla引物對由表1中的MlaF和MlaR組成。Mla探針為表1中的MlaP。該實(shí)施例的步驟一和步驟二中的供試菌株均在文獻(xiàn)“Zhu et al.2011Plant Disease 95(10):1284-1291；Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物學(xué)報35(10)：1-12”中公開過。

一、引物的特異性檢測

1、供試菌株

特異性實(shí)驗(yàn)中的待測褐腐病菌都是在前期實(shí)驗(yàn)中鑒定過的菌株，具體如下：

M.laxa：來自美國的B-C11、MDA12-1，來自荷蘭的CBS298.31、CBS489.50，和來自法國的P3菌株各1株；

M.fructicola：來自中國323031、來自美國的菌株KAC3-4和來自新西蘭的菌株NE18各1株；

M.mumecola：來自日本的3231、來自中國的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；

M.yunnanensis：為來自中國的ABC15、AK9-1和AL1-2各1株；

M.fructigena：來自中國的HX17-1、來自荷蘭的CBS101502、CBS101499各1株；

M.polystroma：來自中國的LHX12、來自日本的2319和CBS102686各1株。

待測菌株同時包含了近似種群B.cinerea，以及來自果實(shí)上的病菌Alternaria sp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。

2、實(shí)時熒光PCR

實(shí)時熒光PCR方法同實(shí)施例2的步驟1。

檢測結(jié)果見圖3。5個M.laxa菌株均顯示陽性反應(yīng)(熒光信號呈指數(shù)增長，Ct值為23-27)。M.fructicola、M.mumecola、M.fructigena、M.yunnanensis、M.polystroma及其他參考菌株均顯示陰性反應(yīng)，空白對照顯示陰性反應(yīng)。結(jié)果表明，應(yīng)用Mla引物探針組合物鑒定M.laxa具有良好的特異性。

二、引物的靈敏度檢測

1、供試菌株

靈敏度實(shí)驗(yàn)中的待測褐腐病菌為M.laxa的菌株CBS298.31。

2、實(shí)時熒光PCR

實(shí)時熒光PCR方法同實(shí)施例2的步驟2。

檢測結(jié)果見圖4。采用各個濃度的M.laxa菌株的基因組DNA作為模板，Ct值隨著DNA模板濃度的降低明顯增大，當(dāng)濃度分別為10ng、1ng、10^-1ng、10^-2ng、10^-3ng、10^-4ng或10^-5ng時，Ct值依次分別為20、25、29、32、34、34或36。結(jié)果表明：應(yīng)用Mla引物探針組合物鑒定M.laxa，檢測限度可達(dá)10^-5ng(但此濃度下擴(kuò)增效率很低，熒光反應(yīng)在達(dá)到36個循環(huán)時才出現(xiàn)指數(shù)增長，即Ct值大于30)；當(dāng)模板濃度大于等于0.1ng時，Ct值均小于30，說明實(shí)時熒光PCR方法檢測M.laxa的適宜模板濃度應(yīng)高于0.1ng。

實(shí)施例4、應(yīng)用Mmu引物探針組合物鑒定M.mumecola的特異性和靈敏度

用于鑒定M.mumecola的引物探針組合物為Mmu引物探針組合物，由Mmu引物對和Mmu探針組成。Mmu引物對由表1中的MmuF和MmuR組成。Mmu探針為表1中的MmuP。該實(shí)施例的步驟一和步驟二中的供試菌株均在文獻(xiàn)“Zhu et al.2011Plant Disease 95(10):1284-1291；Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物學(xué)報35(10)：1-12”中公開過。

一、引物的特異性檢測

1、供試菌株

特異性實(shí)驗(yàn)中的待測褐腐病菌都是在前期實(shí)驗(yàn)中鑒定過的菌株，具體如下：

M.mumecola：來自日本的3231、來自中國的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；

M.laxa：來自美國的B-C11、MDA12-1，來自荷蘭的CBS298.31、CBS489.50，以及來自法國的P3菌株各1株；

M.fructicola：來自中國323031，來自美國的菌株KAC3-4，來自新西蘭的菌株NE18各1株；

M.yunnanensis：為來自中國的ABC15、AK9-1以及AL1-2各1株；

M.fructigena：來自中國的HX17-1、來自荷蘭的CBS101502、CBS101499各1株；

M.polystroma：來自中國的LHX12、來自日本的2319和CBS102686各1株。

待測菌株同時包含了近似種群B.cinerea，以及來自果實(shí)上的病菌Alternaria sp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。

2、實(shí)時熒光PCR

實(shí)時熒光PCR方法同實(shí)施例2的步驟1。

檢測結(jié)果見圖5。3個M.mumecola菌株均顯示陽性反應(yīng)(熒光信號呈指數(shù)增長，Ct值為23-24)。M.fructicola、M.laxa、M.fructigena、M.yunnanensis、M.polystroma及其他參考菌株均顯示陰性反應(yīng)，空白對照顯示陰性反應(yīng)。結(jié)果表明，應(yīng)用Mmu引物探針組合物鑒定M.mumecola具有良好的特異性。

二、引物的靈敏度檢測

1、供試菌株

靈敏度實(shí)驗(yàn)中的待測褐腐病菌為M.laxa的菌株HWL10-4b。

2、實(shí)時熒光PCR

實(shí)時熒光PCR同實(shí)施例2的步驟2。

檢測結(jié)果見圖6。采用各個濃度的M.mumecola菌株的基因組DNA作為模板，Ct值隨著DNA模板濃度的降低明顯增大，當(dāng)濃度分別為10ng、1ng、10^-1ng、10^-2ng、10^-3ng、10^-4ng或10^-5ng時，Ct值依次分別為23、26、30、33、36、35或36。結(jié)果表明：應(yīng)用Mmu引物探針組合物鑒定M.mumecola，檢測限度可達(dá)10^-5ng(但此濃度下擴(kuò)增效率很低，熒光反應(yīng)在達(dá)到36個循環(huán)時才出現(xiàn)指數(shù)增長，即Ct值大于30)；當(dāng)模板濃度大于等于1ng時，Ct值均小于30，說明實(shí)時熒光PCR方法檢測M.mumecola的適宜模板濃度應(yīng)高于1ng。

實(shí)施例5、應(yīng)用Mfg引物探針組合物鑒定M.fructigena的特異性和靈敏度

用于鑒定M.fructigena的引物探針組合物為Mfg引物探針組合物，由Mfg引物對和Mfg探針組成。Mfg引物對由表1中的MfgF和MfgR組成。Mfg探針為表1中的MfgP。該實(shí)施例的步驟一和步驟二中的供試菌株均在文獻(xiàn)“Zhu et al.2011Plant Disease 95(10):1284-1291；Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物學(xué)報35(10)：1-12”中公開過。

一、引物的特異性檢測

1、供試菌株

特異性實(shí)驗(yàn)中的待測褐腐病菌都是在前期實(shí)驗(yàn)中鑒定過的菌株，具體如下：

M.fructigena：來自中國的HX17-1、來自荷蘭的CBS101502、CBS101499，來自英國的EA-2和EA-3各1株；

M.mumecola：來自日本的3231、來自中國的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；

M.laxa菌株：來自美國的B-C11、MDA12-1，來自荷蘭的CBS298.31、CBS489.50，和來自法國的P3菌株各1株；

M.fructicola：來自中國323031、來自美國的菌株KAC3-4和來自新西蘭的菌株NE18各1株；

M.yunnanensis：為來自中國的ABC15、AK9-1和AL1-2各1株；

M.polystroma：來自中國的LHX12、來自日本的2319和CBS102686各1株。

待測菌株同時還包含了近似種群B.cinerea，以及來自果實(shí)上的病菌Alternaria sp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。

2、實(shí)時熒光PCR

實(shí)時熒光PCR方法同實(shí)施例2的步驟1。

檢測結(jié)果見圖7。5個M.fructigena菌株均顯示陽性反應(yīng)(熒光信號呈指數(shù)增長，Ct值為18-22)。M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.yunnanensis、M.polystroma及其他參考菌株均顯示陰性反應(yīng)，空白對照顯示陰性反應(yīng)。結(jié)果表明，應(yīng)用Mfg引物探針組合物鑒定M.fructigena具有良好的特異性。

二、引物的靈敏度檢測

1、供試菌株

靈敏度實(shí)驗(yàn)中的待測褐腐病菌為M.laxa的菌株CBS98.312。

2、實(shí)時熒光PCR

實(shí)時熒光PCR方法同實(shí)施例2的步驟2。

檢測結(jié)果見圖8。采用各個濃度的M.fructigena菌株的基因組DNA作為模板，Ct值隨著DNA模板濃度的降低明顯增大，當(dāng)濃度分別為10ng、1ng、10^-1ng、10^-2ng、10^-3ng、10^-4ng或10^-5ng時，Ct值依次分別為21、25、29、32、35、37或無Ct值。結(jié)果表明：應(yīng)用Mfg引物探針組合物鑒定M.fructigena，檢測限度可達(dá)10^-4ng(但此濃度下擴(kuò)增效率很低，熒光反應(yīng)在達(dá)到37個循環(huán)時才出現(xiàn)指數(shù)增長，即Ct值大于30)；當(dāng)模板濃度大于等于0.1ng時，Ct值均小于30，說明實(shí)時熒光PCR方法檢測M.fructigena的適宜模板濃度應(yīng)高于0.1ng。

實(shí)施例6、應(yīng)用Myu引物探針組合物鑒定M.yunnanensis的特異性和靈敏度

用于鑒定M.yunnanensis的引物探針組合物為Myu引物探針組合物，由Myu引物對和Myu探針組成。Myu引物對由表1中的MyuF和MyuR組成。Myu探針為表1中的MyuP。該實(shí)施例的步驟一和步驟二中的供試菌株均在文獻(xiàn)“Zhu et al.2011Plant Disease 95(10):1284-1291；Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物學(xué)報35(10)：1-12”中公開過。

一、引物的特異性檢測

1、供試菌株

特異性實(shí)驗(yàn)中的待測褐腐病菌都是在前期實(shí)驗(yàn)中鑒定過的菌株，具體如下：

M.yunnanensis：來自中國的ABC15、AK5-1、AK7-1、AK9-1和AL1-2各1株；

M.fructigena：來自中國的HX17-1、來自荷蘭的CBS101502、CBS101499各1株；

M.mumecola：來自日本的3231、來自中國的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；

M.laxa菌株：來自美國的B-C11、MDA12-1，來自荷蘭的CBS298.31、CBS489.50，以及來自法國的P3菌株各1株；

M.fructicola：來自中國323031，來自美國的菌株KAC3-4，來自新西蘭的菌株NE18各1株；

M.polystroma：來自中國的LHX12、來自日本的2319和CBS102686各1株。

待測菌株同時還包含了近似種群B.cinerea，以及來自果實(shí)上的病菌Alternaria sp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。

2、實(shí)時熒光PCR

實(shí)時熒光PCR方法同實(shí)施例2的步驟1。

檢測結(jié)果見圖9。5個M.yunnanensis菌株均顯示陽性反應(yīng)(熒光信號呈指數(shù)增長，Ct值為24-26)。M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.fructigena、M.polystroma及其他參考菌株均顯示陰性反應(yīng)，空白對照顯示陰性反應(yīng)。結(jié)果表明，應(yīng)用Mfg引物探針組合物鑒定M.yunnanensis具有良好的特異性。

二、引物的靈敏度檢測

1、供試菌株

靈敏度實(shí)驗(yàn)中的待測褐腐病菌為M.yunnanensis的菌株AL1-2。

2、實(shí)時熒光PCR

實(shí)時熒光PCR方法同實(shí)施例2的步驟2。

檢測結(jié)果見圖10。采用各個濃度的M.yunnanensis菌株的基因組DNA作為模板，Ct值隨著DNA模板濃度的降低明顯增大，當(dāng)濃度分別為10ng、1ng、10^-1ng、10^-2ng、10^-3ng、10^-4ng或10^-5ng時，Ct值依次分別為27、31、33、37、36、36或36。結(jié)果表明：應(yīng)用Myu引物探針組合物鑒定M.yunnanensis，檢測限度可達(dá)10^-5ng(但此濃度下擴(kuò)增效率很低，熒光反應(yīng)在達(dá)到36個循環(huán)時才出現(xiàn)指數(shù)增長，即Ct值大于30)；當(dāng)模板濃度大于等于10ng時，Ct值均小于30，說明實(shí)時熒光PCR方法檢測M.yunnanensis的適宜模板濃度應(yīng)高于10ng。

實(shí)施例7、應(yīng)用Mpo引物探針組合物鑒定M.polystroma的特異性和靈敏度

用于鑒定M.polystroma的引物探針組合物為Mpo引物探針組合物，由Mpo引物對和Mpo探針組成。Mpo引物對由表1中的MpoF和MpoR組成。Mpo探針為表1中的MpoP。該實(shí)施例的步驟一和步驟二中的供試菌株均在文獻(xiàn)“Zhu et al.2011Plant Disease 95(10):1284-1291；Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物學(xué)報35(10)：1-12”中公開過。

一、引物的特異性檢測

1、供試菌株

特異性實(shí)驗(yàn)中的待測褐腐病菌都是在前期實(shí)驗(yàn)中鑒定過的菌株，具體如下：

M.polystroma：來自中國的LHX12、LS25、SS3，來自日本的2319和CBS102686各1株；

M.yunnanensis：為來自中國的ABC15、AK5-1、AK7-1、AK9-1和AL1-2各1株；

M.fructigena：來自中國的HX17-1、來自荷蘭的CBS101502和CBS101499各1株；

M.mumecola：來自日本的3231、來自中國的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；

M.laxa菌株：來自美國的B-C11、MDA12-1，來自荷蘭的CBS298.31、CBS489.50，和來自法國的P3菌株各1株；

M.fructicola：來自中國323031，來自美國的菌株KAC3-4和來自新西蘭的菌株NE18各1株。

待測菌株同時還包含了近似種群B.cinerea，以及來自果實(shí)上的病菌Alternaria sp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。

2、實(shí)時熒光PCR

實(shí)時熒光PCR方法同實(shí)施例2的步驟1。

檢測結(jié)果見圖11。5個M.polystroma菌株均顯示陽性反應(yīng)(熒光信號呈指數(shù)增長，Ct值為21-26)。M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.fructigena、M.yunnanensis及其他參考菌株均顯示陰性反應(yīng)，空白對照顯示陰性反應(yīng)。結(jié)果表明，應(yīng)用Mfg引物探針組合物鑒定M.polystroma具有良好的特異性。

二、引物的靈敏度檢測

1、供試菌株

靈敏度實(shí)驗(yàn)中的待測褐腐病菌為M.polystroma的菌株CBS102686。

2、實(shí)時熒光PCR

實(shí)時熒光PCR方法同實(shí)施例2的步驟2。

檢測結(jié)果見圖12。采用各個濃度的M.polystroma菌株的基因組DNA作為模板，Ct值隨著DNA模板濃度的降低明顯增大，當(dāng)濃度分別為10ng、1ng、10^-1ng、10^-2ng、10^-3ng、10^-4ng或10^-5ng時，Ct值依次分別為20、24、27、30、32、34或33。結(jié)果表明：應(yīng)用Myu引物探針組合物鑒定M.polystroma，檢測限度可達(dá)10^-5ng(但此濃度下擴(kuò)增效率很低，熒光反應(yīng)在達(dá)到33個循環(huán)時才出現(xiàn)指數(shù)增長，即Ct值大于30)；當(dāng)模板濃度大于等于0.1ng時，Ct值均小于30，說明實(shí)時熒光PCR方法檢測M.polystroma的適宜模板濃度應(yīng)高于0.1ng。

對比例1、檢測褐腐病菌的方法

以如下褐腐病菌：323031M.fructicola、ABC15M.yunnanensis、3231M.mumecola、P3M.laxa、CBS102686M.polystroma和HX17-1M.fructigena為研究對象，采用根據(jù)beta-tubulin基因序列差異開發(fā)的多重普通PCR方法進(jìn)行檢測，檢測的具體步驟參照文獻(xiàn)“Hu et al.,2011,Plos One 6:e24990”中方法。

檢測結(jié)果如圖13所示。從圖中可以看出，文獻(xiàn)“Hu et al.,2011,Plos One 6:e24990”中方法僅能區(qū)分M.fructicola、M.yunnanensis和M.mumecola菌株，無法區(qū)分M.laxa、M.polystraoma和M.fructigena菌株，且檢測方法在檢測速度和靈敏性方面也不及本發(fā)明的方法。

對比例2、檢測褐腐病菌的方法

以如下褐腐病菌：M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.fructigena、M.yunnanensis和M.polystraoma六種褐腐病菌為研究對象，采用根據(jù)laccase基因序列差異開發(fā)的普通PCR方法進(jìn)行檢測，檢測的具體步驟參照文獻(xiàn)“Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250”中的方法。

結(jié)果表明：文獻(xiàn)“Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250”中的方法僅可以區(qū)分M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.yunnanensis和M.polystraoma五種褐腐病菌，不能鑒定M.fructigena，且文獻(xiàn)“Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250”中的方法在檢測速度和靈敏性方面也不及本發(fā)明的方法。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>用于鑒定六種褐腐病菌的實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

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<210>1

<211>24bp

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>

<400>1

tgtcactcaa gtaagttgat ctgc 24

<210>2

<211>19bp

<212>DNA

<213>人工序列

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tccatcgccg tattgaagt 19

<210>3

<211>25bp

<212>DNA

<213>人工序列

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tacctccatc aagtgcccta tcgct 25

<210>4

<211>24bp

<212>DNA

<213>人工序列

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tcaatcgata ccaactggta cgat 24

<210>5

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<212>DNA

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ttctcaactg aaagccaata ttctttag 28

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cactagaggt aagtgatatg acat 24

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<212>DNA

<213>人工序列

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aattgatacc aactggtacg atgtg 25

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<212>DNA

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aaagccaata ttcttgatat caagttagtg 30

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aggtaagtga taaaacatcc ttt 23

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ataccaactg gtacgatgtt actcctac 28

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ctagaggtaa gtgatatggc a 21

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atgaccaggg gcatctgtaa tt 22

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<212>DNA

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