本發(fā)明屬于植物遺傳育種和蘋(píng)果種質(zhì)創(chuàng)新研究領(lǐng)域，具體為一種鑒定嘎拉蘋(píng)果后代植株的SSR分子標(biāo)記IV及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蘋(píng)果（Malus domestica Borkh.）生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，果品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是世界上栽培面積廣、消費(fèi)量大、經(jīng)濟(jì)效益較好的果樹(shù)樹(shù)種之一。我國(guó)是蘋(píng)果栽培面積最廣、總產(chǎn)量最高的國(guó)家之一。尤其在我國(guó)北方，蘋(píng)果是栽培面積最大的果樹(shù)樹(shù)種，其產(chǎn)量和面積均居全國(guó)水果之首。這種產(chǎn)業(yè)已成為我國(guó)許多省市的支柱產(chǎn)業(yè)，它們?cè)谔岣咿r(nóng)民收入、促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著越來(lái)越重要的作用。蘋(píng)果屬自花不孕植物，生產(chǎn)中的蘋(píng)果品種均為雜合二倍體品種，蘋(píng)果基因組高度雜合，遺傳背景十分復(fù)雜，加之其童期漫長(zhǎng)，使得常規(guī)雜交育種周期長(zhǎng)，效率低。

利用純合基因型種質(zhì)育種則可以大大提高定向育種效率。花藥培養(yǎng)可以獲得單倍體植株，經(jīng)過(guò)染色體加倍后可以迅速得到純合的二倍體種質(zhì)。由于蘋(píng)果是高度雜合的二倍體品種，通常在單一位點(diǎn)由復(fù)等位基因控制，即同一位點(diǎn)含有兩種不同的等位基因，而單倍體品種只含一種基因。通過(guò)花藥培養(yǎng)所獲得植株，如果其為單倍體起源，應(yīng)只具有其親本之一的一種等位基因。通過(guò)花藥培養(yǎng)可以得到純合的二倍體種質(zhì)，還可以直接獲得性狀優(yōu)良的隱性基因材料和誘變育種材料，這些材料對(duì)蘋(píng)果遺傳育種研究有重要意義。

分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在蘋(píng)果主要農(nóng)藝性狀的早期選擇中得到應(yīng)用，如紅肉、紅皮、黑星病、蘋(píng)果綿蚜和火疫病等，參與完成蘋(píng)果基因組測(cè)序工作并聯(lián)合開(kāi)發(fā)了8 K（CHAGNé D等，Genome-wide SNP detection, validation, and development of an 8K SNP array for apple[J]. PLoS ONE, 2012, 7: e31745. doi:10.1371/journal.pone.0031745）和20 K（BIANCO L等，Development and validation of a 20K Single Nucleotide Polymorphism（SNP）whole genome genotyping array for apple ( Malus × domestica Borkh) [J]. PLoS One ,2014，9(10): e110377. dio：10.1371/journal.pone.0110377）的蘋(píng)果SNP芯片，第1次在世界蘋(píng)果育種項(xiàng)目中使用基因組選擇（GS）方法來(lái)代替表型篩選加快育種步伐。

簡(jiǎn)單序列重復(fù) (simple sequence repeat， SSR) 是一類(lèi) 1-6bp 核苷酸基序構(gòu)成重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物基因組的編碼區(qū)、非編碼區(qū)，SSR 標(biāo)記利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)的側(cè)翼保守序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增， 根據(jù)條帶的大小來(lái)反映DNA序列的多態(tài)性。與其它分子標(biāo)記如 RFLP、AFLP ISSR 等相比，SSR 標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，近年來(lái)成為遺傳多樣性研究、遺傳作圖、重要功能基因定位、分子輔助育種等領(lǐng)域應(yīng)用最多的一種標(biāo)記。

SSR標(biāo)記因其具有良好的穩(wěn)定性和可傳遞性，在果實(shí)品質(zhì)性狀標(biāo)記篩選、品種鑒定和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中被廣泛使用（Liu, 等. Identification of apple cultivars on the basis of simple sequence repeat markers. Genet Mol Res, 2014, 13 ( 3) : 7377-7387; Moriya, 等. Aligned genetic linkage maps of apple rootstock cultivar ‘JM7’ and Malus sieboldii ‘Sanashi 63’ constructed with novel EST - SSRs. Tree Genet Genomes, 2012, 8 (4) : 709-723.）。

到目前為止，對(duì)于嘎拉蘋(píng)果花藥培養(yǎng)植株的SSR分子標(biāo)記還未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定嘎拉蘋(píng)果后代植株的SSR分子標(biāo)記IV及其應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種鑒定嘎拉蘋(píng)果后代植株的SSR分子標(biāo)記IV，在檢測(cè)過(guò)程中同時(shí)使用，所述分子標(biāo)記為具有如下所示核苷酸序列的2對(duì)SSR引物：

LG5 標(biāo)記Hi04d02：

上游：5^，- TTCGTGGCTGAGAAAGGAGT -3^，

下游：5^，- GTTTGTACGGTGCATTGTGAAAG -3^，

LG10 標(biāo)記Hi05b02：

上游：5^，- GATGCGGTTTGACTTGCTTC -3^，

下游：5^，- GTTTCTCCAGCTCCCATAGATTGC -3^，。

一種鑒定嘎拉蘋(píng)果后代植株的SSR分子標(biāo)記IV的應(yīng)用，包括以下步驟：

（1）以嘎啦蘋(píng)果基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，分別以上述SSR分子標(biāo)記為引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為15μL，其中含10×PCR Buffer 1.5 μL、2.5 mM dNTPs mixture 1.2μL、10ng/μL Primers F 1.5μL、10ng/μL Primers R 1.5μL、5U Taq 聚合酶0.15μL、100ng/μL DNA模板0.75 μL，去離子水補(bǔ)足至15μL；（2）擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min 30 s，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min，4℃保存?zhèn)溆茫唬?）PCR產(chǎn)物檢測(cè)，用8%非變性聚丙烯酰胺電泳，將PCR的每個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物加入1/2的非變性L(fǎng)oading Buffer，混勻，150V恒定電壓150min，冰醋酸固定，AgNO₃ 染色拍照；（4）用于遺傳連鎖鑒定時(shí)，如能擴(kuò)增出上述2對(duì)SSR引物相對(duì)應(yīng)的任意一條特異性條帶，說(shuō)明待測(cè)蘋(píng)果種質(zhì)中含有的遺傳物質(zhì)位于相應(yīng)的遺傳連鎖群，反之，則待測(cè)蘋(píng)果種質(zhì)含有的遺傳物質(zhì)不存在相應(yīng)的遺傳連鎖群；（5）用于花藥培養(yǎng)植株鑒定時(shí)，待測(cè)蘋(píng)果能擴(kuò)增出上述2對(duì)SSR引物相對(duì)應(yīng)的單獨(dú)的一條特異性條帶，說(shuō)明待測(cè)蘋(píng)果植株為純合材料，如出現(xiàn)兩條條帶，則待測(cè)蘋(píng)果植株不是純合材料；（6）用于品種來(lái)源鑒定時(shí)，待測(cè)蘋(píng)果能擴(kuò)增出上述2對(duì)SSR引物相對(duì)應(yīng)的任意一條特異性條帶，說(shuō)明待測(cè)蘋(píng)果植株來(lái)源于嘎拉蘋(píng)果，如無(wú)特異性條帶擴(kuò)增出來(lái)，則待測(cè)蘋(píng)果植株不是嘎拉蘋(píng)果培育的后代品種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明在國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道了用SSR分子標(biāo)記對(duì)鑒定材料所處蘋(píng)果連鎖群進(jìn)行鑒定，同時(shí)也報(bào)道了蘋(píng)果的5號(hào)和10號(hào)染色體上連鎖的SSR分子標(biāo)記；

2、本發(fā)明所述分子標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，可以快速、準(zhǔn)確對(duì)嘎拉蘋(píng)果遺傳連鎖群、花藥培養(yǎng)植株及嘎啦培育后代品種進(jìn)行鑒定；

3、這些研究結(jié)果為下一步加快嘎拉蘋(píng)果與重要農(nóng)藝性狀連鎖基因的利用及蘋(píng)果純合植株遺傳育種提供了分子水平的支持；

4、為快速鑒定嘎拉培育植株進(jìn)行分子水平驗(yàn)證提供了方法。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)嘎拉蘋(píng)果花藥培養(yǎng)植株的5號(hào)和10號(hào)染色體上連鎖的2對(duì)SSR分子標(biāo)記鑒定，不僅可以系統(tǒng)準(zhǔn)確地了解嘎拉蘋(píng)果基因型類(lèi)型及其遺傳多樣性，為豐富與發(fā)展蘋(píng)果等位基因體系奠定基礎(chǔ)，也為今后科學(xué)利用嘎拉蘋(píng)果提供理論依據(jù)，而且也為鑒定嘎拉蘋(píng)果花藥培養(yǎng)植株的基因型，及其純合性進(jìn)行了佐證。本發(fā)明對(duì)于蘋(píng)果新品種選育及分子標(biāo)記輔助育種都具有積極的推動(dòng)作用。同時(shí)，本發(fā)明篩選出的2對(duì)SSR分子標(biāo)記也為嘎拉蘋(píng)果后代品種從分子水平上進(jìn)行來(lái)源驗(yàn)證提供了支持。

附圖說(shuō)明

圖1為L(zhǎng)G5 標(biāo)記Hi04d02的毛細(xì)管電泳圖譜；圖2為L(zhǎng)G10 標(biāo)記Hi05b02的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果圖譜。

具體實(shí)施方式

純合基因型對(duì)于高等植物遺傳機(jī)理研究和育種應(yīng)用均具有十分重要作用（Murovec, 等. Haploids and doubled haploids in plant breeding. In: Abdurakhmonov I (ed) Plant Breeding: 2012: 87-106.）。蘋(píng)果是基因組高度雜合的果樹(shù)樹(shù)種，利用單倍體基因組可以大大降低基因組的組裝難度（Dunwell. Haploids in flowering plants: origins and ex-ploitation. Plant Biotechnol J，2010，8 ( 4) : 377-424.）。蘋(píng)果屬多年生草本植物，生殖周期長(zhǎng)，加之自交不親和，導(dǎo)致通過(guò)多代自交獲得純合植株的方法難以實(shí)現(xiàn)。利用花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體獲得純合基因型株系，對(duì)基因型高度雜合的蘋(píng)果育種及遺傳分析有重要意義（Germanà. Gametic embryogenesis and haploid technology as valuable support to plant breeding. Plant Cell Rep, 2011，30(5): 839-857；Maria. Doubled haploid production in fruit crops. Plant Cell, Tissue and Organ Culture，2006, 86：131-146.）。通過(guò)花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體獲得再生植株，并對(duì)獲得的再生植株倍性以及來(lái)源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，對(duì)創(chuàng)新種質(zhì)遺傳分析具有重要意義。為更好地利用這些種質(zhì)材料，本發(fā)明對(duì)嘎拉蘋(píng)果及其花藥培養(yǎng)獲得的植株進(jìn)行連鎖群和基因型鑒定，為加快嘎拉蘋(píng)果與重要農(nóng)藝性狀連鎖基因的利用及蘋(píng)果純合植株遺傳育種提供了分子水平的支持。

嘎拉蘋(píng)果花藥培養(yǎng)

4月上旬嘎拉蘋(píng)果現(xiàn)蕾后，采取混合采樣的方法，選取生長(zhǎng)健壯的嘎拉蘋(píng)果成年樹(shù)，采集發(fā)育良好的花蕾，用密封袋封好置于冰箱4℃冷藏室進(jìn)行低溫預(yù)處理。低溫處理后，將花蕾在超凈工作臺(tái)內(nèi)用0.1%次氯酸鈉滅菌，然后用鑷子從花蕾內(nèi)取出花藥接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，25℃下暗培養(yǎng)，3~5個(gè)月后待胚狀體長(zhǎng)至8~10mm，轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基上進(jìn)行植株再生，并進(jìn)行繼代培養(yǎng)后經(jīng)繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化、室內(nèi)移栽獲得再生植株。

SSR分子標(biāo)記分析

基因組總DNA提取

選取嘎拉蘋(píng)果和嘎拉花藥培育再生植株6株，采用CTAB法（曹秋芬等，2003）分別提取花藥的總DNA。從HiDRAS網(wǎng)站和Okada等構(gòu)建的蘋(píng)果高密度微衛(wèi)星遺傳圖譜上，選取分布于蘋(píng)果5號(hào)和10號(hào)染色體的2對(duì)SSR引物，再生植株連鎖群HIDRAS 標(biāo)記見(jiàn)表1；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1：

PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系總體積為為15μL，由其中含10×PCR Buffer 1.5 μL、2.5 mM dNTPs 1.2μL、10ng/μL Primers F 1.5μL、10ng/μL Primers R 1.5μL、5U Taq 聚合酶0.15μL、100ng/μL DNA模板0.75 μL，去離子水補(bǔ)足至15μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min 30 s，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物檢測(cè)

用8%非變性聚丙烯酰胺電泳，將PCR的每個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物加入1/2的非變性L(fǎng)oading Buffer，混勻，150V恒定電壓150min左右，冰醋酸固定，AgNO3染色拍照。

對(duì)8%非變性聚丙烯酰胺電泳獲得的條帶，進(jìn)行篩選，對(duì)在嘎拉及其花藥培養(yǎng)植株中產(chǎn)生多態(tài)性的標(biāo)記進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)。選取在嘎拉蘋(píng)果中兩個(gè)等位基因/位點(diǎn)都擴(kuò)增出條帶，而在嘎拉蘋(píng)果花藥培養(yǎng)植株中只有一個(gè)等位基因/位點(diǎn)擴(kuò)增出來(lái)?xiàng)l帶的引物。嘎啦蘋(píng)果在引物Hi09b04（LG 5）中，擴(kuò)增產(chǎn)物有220 bp和232 bp的特異性條帶；在引物Hi04d02（LG 5）中，擴(kuò)增產(chǎn)物有200 bp和250 bp的特異性條帶；在引物Hi05b02（LG 10）中，擴(kuò)增產(chǎn)物有170 bp和121 bp的特異性條帶；結(jié)果表明，篩選出分布于第5和第10條染色體上的2對(duì)SSR分子標(biāo)記，在嘎拉蘋(píng)果及其花藥培育植株中擴(kuò)增出等位基因位點(diǎn)。

再生株系的染色體倍性分析：取再生植株葉片在500 μL 裂解液中用刀片切碎，靜置2 min后過(guò)濾于EP管中，PI染色后用BD Accuri C5 流式細(xì)胞儀分析葉片中的DNA含量。以莖尖培養(yǎng)獲得的雜合二倍體“嘎啦”試管苗葉片為倍性鑒定的參考標(biāo)準(zhǔn)。

采用流式細(xì)胞儀對(duì)成活再生株系進(jìn)行染色體倍性鑒定。以雜合二倍體“嘎啦”供體為對(duì)照，結(jié)果表明：Gala1- Gala5再生株系均為二倍體。

再生株系的基因型鑒定：

基因組DNA的提取：采用改良CTAB法提取葉片總DNA后，經(jīng)核酸蛋白儀（Bio-Rad）檢測(cè)DNA濃度，再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量。

對(duì)篩選得到引物的5’端TAM、FAM、HEX熒光標(biāo)記，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，含dNTP mixture（10 mM）0.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、25 mM MgCl₂ 2.0 μL、rTaq酶（5 U/μL）0.2 μL、DNA模板（100 ng/μL）1 μL 、去離子水 17.8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊?5℃ 預(yù)變性3min；第二步94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán)；第三步95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)；第四步72℃充分延伸6 min，4℃ 保存。反應(yīng)板每孔先加入9.9 μL 去離子甲酰胺和 0. 1μL ROX500或LIZ500 分子量?jī)?nèi)標(biāo)，再吸取加入50 pg擴(kuò)增產(chǎn)物加入樣品孔中。98℃變性 5 min，急速冷卻，置放于 ABI 3730XL DNA分析儀上。使用Gene Mapper 軟件分析擴(kuò)增片段峰型并讀取相應(yīng)數(shù)據(jù)。

SSR 鑒定嘎啦再生植株基因型結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果顯示，連鎖群上的2個(gè)SSR標(biāo)記顯示雜合體為兩個(gè)峰，而再生株系只有其中的一個(gè)峰。證明，嘎啦再生株系Gala1- Gala5均為純合基因型植株。

再生株系植物學(xué)觀(guān)察：對(duì)再生植株試管苗進(jìn)行植物學(xué)特征調(diào)查。再生植株植物學(xué)觀(guān)察結(jié)果見(jiàn)表3，表3結(jié)果顯示嘎啦雜合供體株高為5.67 cm（n=1）和純合二倍體平均株高 2.96 cm ± 0.44 cm（n=28）。同時(shí)我們也觀(guān)察到純合二倍體長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)于嘎啦雜合供體較弱。不同二倍體純合植株的植物學(xué)特征也存在差異，Gala5植株相對(duì)較高，葉基變寬，葉尖漸尖。

表3：

結(jié)果與分析

單倍體育種是獲得優(yōu)勢(shì)親本供體材料的最有效方法之一。花藥的花藥壁是雜合體細(xì)胞，同時(shí)也可能誘導(dǎo)成雜合二倍體的再生植株，所以獲得的二倍體植株并非一定為純合體。通過(guò)鑒定再生植株的等位基因就可以把花藥培養(yǎng)再生植株的雜合二倍體和純合二倍體區(qū)分開(kāi)。以前的技術(shù)包括同工酶標(biāo)記、S等位基因及SSR分子標(biāo)記都曾被應(yīng)用于花藥再生植株的純合性鑒定。本發(fā)明也采用了SSR鑒定方法。首先選用的SSR標(biāo)記（來(lái)自HIDRAS數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.hidras.unimi.it/））對(duì)所有的再生植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩出可區(qū)分再生植株為純合的SSR標(biāo)記。為了進(jìn)一步區(qū)分再生植株的基因型，我們又篩選出分布于蘋(píng)果5號(hào)和10號(hào)染色體上連鎖群的SSR標(biāo)記。這個(gè)SSR標(biāo)記能明確標(biāo)記“嘎啦”蘋(píng)果不同的植株，為今后進(jìn)行“嘎啦”蘋(píng)果的基因型鑒定提供了技術(shù)指標(biāo)。

親本蘊(yùn)含的等位基因在花藥培養(yǎng)來(lái)的植株中能檢測(cè)到，但是花藥培養(yǎng)來(lái)的植株中只有一個(gè)等位基因/位點(diǎn)擴(kuò)增出來(lái)。這表明花藥培養(yǎng)來(lái)的植株其基因型是純合的，即來(lái)源于親本的單倍體。

結(jié)論

通過(guò)花藥培養(yǎng)還可獲得倍性豐富的純合體植株，這為今后開(kāi)展蘋(píng)果倍性遺傳育種研究提供了豐富的試材。

本發(fā)明獲得的再生株系以及SSR鑒定體系對(duì)分析鑒定“嘎啦”優(yōu)良性狀基因研究，田間嫁雜交育種，以及表型-基因型關(guān)聯(lián)分析具有重要意義。

下一步結(jié)合嘎拉蘋(píng)果全基因組測(cè)序結(jié)果，在基因組范圍內(nèi)對(duì)親本及其花藥培養(yǎng)植株進(jìn)行更為徹底的分析和比較，以便解析嘎拉蘋(píng)果重要性狀（特性）的分子機(jī)制。

序列表

〈110〉山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所

〈120〉一種鑒定嘎拉蘋(píng)果后代植株的SSR分子標(biāo)記IV及其應(yīng)用

〈160〉4

〈210〉1

〈211〉20

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG5標(biāo)記Hi04d02的上游引物

〈400〉1

TTCGTGGCTGAGAAAGGAGT

〈210〉2

〈211〉23

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG5標(biāo)記Hi04d02的下游引物

〈400〉2

GTTTGTACGGTGCATTGTGAAAG

〈210〉3

〈211〉20

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG10 標(biāo)記Hi05b02的上游引物

〈400〉3

GATGCGGTTTGACTTGCTTC

〈210〉4

〈211〉24

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG10 標(biāo)記Hi05b02的下游引物

〈400〉4

GTTTCTCCAGCTCCCATAGATTGC