本發(fā)明專利涉及獸醫(yī)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的診斷技術(shù)，具體是一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒。

背景技術(shù)：

腹瀉是當(dāng)前威脅養(yǎng)豬業(yè)的一類重要疾病，導(dǎo)致豬腹瀉的原因很多，包括營養(yǎng)性、細(xì)菌性、病毒性和寄生蟲等因素。其中，病毒性因素是非常重要的一種因素，近年來，引起豬腹瀉最主要病毒為豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，它能引起豬的豬流行性腹瀉(PED)，PED是豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和食欲下降為主要特征，發(fā)生與流行呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，多發(fā)生于冬季12月至次年2月寒冬季節(jié)，也可發(fā)生于其它季節(jié)，各日齡豬均可感染發(fā)病，哺乳仔豬、斷奶仔豬和育肥豬的感染發(fā)病率可達(dá)100％，尤其哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，母豬發(fā)病率為15-90%，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1978年，比利時(shí)和英國首次報(bào)道了豬流行性腹瀉，此后在世界多國均見有PEDV感染的報(bào)道。1976年，中國首次出現(xiàn)PEDV感染的報(bào)道，自1980年后期呈現(xiàn)大面積流行。

目前尚無有效的藥物治療豬流行性腹瀉，該病一旦爆發(fā)，給豬場造成毀滅性的打擊，采用疫苗進(jìn)行預(yù)防是控制該病的最有效的手段，弱毒活疫苗與滅活疫苗相比具有免疫作用時(shí)間長，免疫效果牢固，可形成局部和全身免疫等優(yōu)點(diǎn)，

ORF3基因是PEDV的一個(gè)附屬基因，編碼碼一種離子通道蛋白，與病毒的毒力有關(guān)，是造成強(qiáng)弱毒差異的主要基因，是弱毒株重要的分子標(biāo)記。

目前國內(nèi)外商品化的PEDV弱毒疫苗株均為ORF3基因缺失毒株，如我國的CV777株，日本的P-5V株和韓國的KPED-9和DR13株等，這些毒株的ORF3基因在245-294bp均存在核苷酸缺失，而缺失區(qū)域周圍的序列卻相對(duì)保守，不同毒株的 ORF3 基因相似性達(dá)到97.8%，在臨床上如何區(qū)分疫苗免疫與流行毒株，對(duì)仔豬腹瀉疫情的預(yù)警及豬場流行性腹病毒的凈化具有重要意義。

目前，在國內(nèi)有學(xué)者嘗試建立相關(guān)的鑒別診斷方法，如修金生等建立了鑒別豬流行性腹瀉病毒野毒和疫苗弱毒的熒光定量 RT-PCR 檢測方法，對(duì)操作人員要求高，且成本較高，目前只應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測，不適合基層獸醫(yī)部門應(yīng)用。李長龍、朱海俠等建立了鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗株與野毒株的 RT-PCR 檢測方法，均為兩步法RT-PCR檢測方法，且沒檢測的敏感性進(jìn)行研究，操作煩瑣，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間長，模板RNA的易降解。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的是目的在于提供一種用于鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，該試劑盒操作簡便、靈敏度高、特異性好可快速、準(zhǔn)確地區(qū)分豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和流行毒株，對(duì)豬場流行性腹瀉病毒病的早期鑒別診斷、防控及凈化有重要意義。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種用于鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，該試劑盒包括20μL RT-PCR一步法酶、250μL 酶緩沖液、300μL RNaseFreedH₂O、40μL 混合引物、20μL陽性對(duì)照、20μL陰性對(duì)照、80μLDL2000及25μL6×LoadingBuff，

所述的引物 P1 序列為 ：5'-AGTCTGCCAACTTGTCTT-3'

所述的引物 P2 序列為 ：5'-AGTAAAAGCAGACTAAACAAAGCCT-3'

所述的陰性對(duì)照為滅菌的DEPC水。

所述的陽性對(duì)照為豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和流行毒株RNA。

所述混合引物中各條引物的濃度均為15μmo1/L。

所述的RT-PCR一步法酶由PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNase Inhibitor組成，所述PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNase Inhibitor的體積比為1:1:1。

所述的酶緩沖液由dNTP Mixture和One Step Enhancer Solution組成，所述dNTP Mixture的濃度為400μmo1/L。

所述RT-PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行，P1、P2引物各1μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、兩種病毒RNA混合物各0.5μL，，加RNase Freed H₂O至25μL。

所述RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：50℃ 20 min；95℃ 3 min；94℃ 20s；退火溫度 52℃ 20s；72℃ 20s；40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明根據(jù)GenBank中的豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和流行毒株的ORF3基因序列設(shè)計(jì)特異性引物P1/P2，提取病毒RNA，利用一步法RT-PCR方法檢測豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株，擴(kuò)增疫苗弱毒株預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為233bp，擴(kuò)增流行毒株預(yù)計(jì)擴(kuò)增片斷為282bp；本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄步驟PCR 擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行，具有操作簡單，減少的繁瑣的反轉(zhuǎn)錄加樣的過程，不需要單獨(dú)做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增一步完成，減少了反應(yīng)時(shí)間，檢測總時(shí)間控制在3小時(shí)左右，達(dá)到了快速檢測的目的，避免了模板RNA的降解，且目的片段較小，進(jìn)一步提高了檢測的敏感性，更加方便、實(shí)用，適合基層獸醫(yī)工作者使用，本發(fā)明能徹底解決豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和流行毒株鑒別診斷問題，快速、靈敏，特異性好，非常適合豬流行性腹瀉疫情的大面積快速檢測普查，適用于基層獸醫(yī)檢測實(shí)驗(yàn)室及條件具備的大中型養(yǎng)殖場。

附圖說明

圖1為本發(fā)明試劑盒一步法RT-PCR擴(kuò)增電泳圖；

圖1中：M：DL2000 MarKer，1：疫苗毒PEDV +流行毒PEDV擴(kuò)增結(jié)果，2：疫苗毒PEDV 擴(kuò)增結(jié)果，3：流行毒PEDV擴(kuò)增結(jié)果，4：空白對(duì)照；

圖2為本發(fā)明試劑盒的敏感性試驗(yàn)電泳圖；

圖2中：M：DL2000 MarKer，1：1mg疫苗毒PEDV +1mg流行毒PEDV ，2：100ng 疫苗毒PEDV +100ng流行毒PEDV，3：10ng 疫苗毒PEDV +10ng流行毒PEDV，4：1ng 疫苗毒PEDV +1ng流行毒PEDV，5：100pg 疫苗毒PEDV +100pg流行毒PEDV，6：10pg 疫苗毒PEDV +10pg流行毒PEDV，7：1pg 疫苗毒PEDV +1pg流行毒PEDV，8：0.1pg 疫苗毒PEDV +0.1pg流行毒PEDV；

圖3為本發(fā)明試劑盒特異性試驗(yàn)電泳圖；

圖3中：M：DL2000 MarKer，1：疫苗毒PEDV +流行毒PEDV擴(kuò)增結(jié)果，2：疫苗毒PEDV 擴(kuò)增結(jié)果，3：流行毒PEDV擴(kuò)增結(jié)果，4：豬傳染性胃腸炎病毒擴(kuò)增結(jié)果，5：豬A群輪狀病毒擴(kuò)增結(jié)果，6：豬瘟病毒擴(kuò)增結(jié)果，7：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒擴(kuò)增結(jié)果，8：豬捷申病毒擴(kuò)增結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，一邊本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更好的了解本發(fā)明，但并不因此限制本發(fā)明。

實(shí)施例1一種鑒別豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR診斷試劑盒，其包括20μLRT-PCR一步法酶、250μL酶緩沖液、300μL RNase Freed H₂O、40μL混合引物、20μL陽性對(duì)照、20μL陰性對(duì)照、80μL DL2000 25μL 6×Loading Buff，混合引物包括上游引物P1：5'-AGTCTGCCAACTTGTCTT-3'，下游引物P2：5'-AGTAAAAGCAGACTAAACAAAGCCT-3'。陰性對(duì)照為滅菌的DEPC水，陽性對(duì)照為豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株RNA。所述的酶緩沖液由dNTP Mixture和One Step Enhancer Solution組成，所述dNTP Mixture的濃度為400μmo1/L，所述的RT-PCR一步法酶由體積比為1：1：1的PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNase Inhibitor組成。一步法RT-PCR反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行，P1、P2引物各1μL (15μmol/L)，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、2種RNA混合物1μL，加RNase FreedH20至25μL，擴(kuò)增反應(yīng)測程序?yàn)椋?0℃ 20 min；95℃ 3 min；94℃ 20s，退火溫度 52℃ 20s；72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。用于檢測樣品時(shí)擴(kuò)增豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為233bp，擴(kuò)增豬流行性腹瀉流行毒株預(yù)計(jì)擴(kuò)增片斷為282bp。

實(shí)施例2

將采集的糞便樣品、腸道內(nèi)容物用PBS（0.01 mol/L， pH7.2）制成10%的懸液，渦旋震蕩后，4℃條件下12 000 r/min離心10分鐘，取上清，用于病毒核酸的提取。病毒RNA的提取參照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒（康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司）說明書進(jìn)行，將提取的RNA于-70℃保存。

單一病毒一步法RT-PCR擴(kuò)增及條件優(yōu)化。

RT-PCR反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行，P1、P2引物各1μL (10μmol/L)，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、模板1μL（豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株或流行毒株的RNA），加RNase Free dH₂O至25μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 20 min；95℃ 3 min；94℃ 20s；退火溫度 50℃ 20s；72℃ 20s；40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物于15 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。

兩種病毒一步法RT-PCR擴(kuò)增及條件優(yōu)化

RT-PCR反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行，P1、P2引物各1μL (15μmol/L)，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、2種RNA混合物1μL，加RNase Free dH₂O至25μL，優(yōu)化一步法RT-PCR反應(yīng)條件，包括退火溫度(46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃)，引物濃度(5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L)，進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)條件，同時(shí)以RNase Free dH₂O作為空白對(duì)照。兩種病毒一步法RT-PCR反應(yīng)在25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行。確定的最佳引物濃度為15μmol/L，反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 20 min；95℃ 3 min；94℃ 20s；退火溫度 52℃ 20s；72℃ 1 min；40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物于15 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。

結(jié)果判定

陰性對(duì)照不出條帶，陽性對(duì)照出 223bp、282bp 兩個(gè)條帶，說明對(duì)照成立，樣品中出現(xiàn)223bp一個(gè)條帶，即為豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株，樣品中出現(xiàn)282bp一個(gè)條帶，即為豬流行性腹瀉病毒流行毒株，樣品出223bp、282bp兩個(gè)條帶，即為豬流行性腹瀉病毒流行毒株，見圖1。

試劑盒的驗(yàn)證性試驗(yàn)

①敏感性試驗(yàn)

分別提取豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和流行毒株的RNA，定量后，分別作10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，每個(gè)稀釋度取l μL為模板，采用一步法RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，該試劑盒最低能檢出1pg的豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和1pg的流行毒株RNA量，見圖2。

②特異性試驗(yàn)

分別提取豬傳染性胃腸炎病毒、豬A群輪狀病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒和豬捷申病毒的核酸，分別進(jìn)行一步法RT-PCR反應(yīng)，均未擴(kuò)增出條帶，而豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和流行毒株RNA混合物和單一RNA均擴(kuò)增出各病毒的特異性條帶，見圖3。

③重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用建立一步法RT-PCR方法，重復(fù)檢測豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株和流行毒株單一病毒RNA或混合RNA樣品3次，經(jīng)過3次重復(fù)操作，結(jié)果一致。

④穩(wěn)定性試驗(yàn)

本發(fā)明提供的診斷試劑盒保存條件為-20℃，每月 1 次用對(duì)照樣品進(jìn)行檢測試驗(yàn)，連續(xù)檢測6個(gè)月，檢測試劑盒存放的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，6個(gè)月內(nèi)試劑盒檢測結(jié)果完全一致，說明試劑盒有良好的穩(wěn)定性。

⑤一步法RT-PCR試劑盒對(duì)臨床樣品的檢測

應(yīng)用研制的一步法RT-PCR試劑盒對(duì)2015年山東、安徽、河南和江蘇等省等幾個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場和養(yǎng)豬專業(yè)戶采集的32份疑似病料進(jìn)行一步法RT-PCR檢測，結(jié)果32份樣品中有21份能檢測到PEDV，其中豬流行性腹瀉病毒疫苗弱毒株疫苗毒感染2份豬流行性腹瀉病毒流行毒株感染18份，疫苗毒與野毒共感染的為1份。