本發(fā)明涉及高分子藥物載體
技術領域：
，尤其涉及一種pH調(diào)控的親疏水性反轉、電荷反轉及胞內(nèi)氧化還原響應性的腫瘤微環(huán)境智能響應的納米凝膠及納米凝膠載藥系統(tǒng)，以及二者的制備方法。
背景技術：
：納米載藥系統(tǒng)由于具有EPR效應，能夠提高腫瘤靶向性，增強化療藥物療效并降低毒副作用而被廣泛用于腫瘤治療?？鼓[瘤納米載藥系統(tǒng)通過靜脈注射到達靶部位時需經(jīng)過體內(nèi)多重生理屏障，為突破這些生理屏障，理想的納米載藥系統(tǒng)須具備血液中長循環(huán)、腫瘤部位有效富集、腫瘤深部穿透、被腫瘤細胞有效攝取及胞內(nèi)響應性釋放藥物的能力等。盡管目前有很多策略用來改善納米藥物抗腫瘤治療效果，但這些策略大多不能滿足上述所有條件來克服體內(nèi)的多重生理屏障。納米載藥系統(tǒng)的體內(nèi)行為與其物理化學性質如粒徑、表面電荷、表面功能基團及親疏水性等息息相關，進而影響其抗腫瘤效果。許多研究表明親水性納米材料能有效避免血液中蛋白的吸附及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的調(diào)理，如利用PEG對納米材料進行表面改性能有效提高其親水性而增加其在血液中的長循環(huán)，但納米載藥系統(tǒng)的疏水性更有利于其與細胞膜相互作用而促進腫瘤細胞的有效攝取。因此腫瘤酸性微環(huán)境響應的親疏水性反轉納米載藥系統(tǒng)能有效解決這個矛盾，可兼顧血液中的長循環(huán)及腫瘤細胞攝取的矛盾。目前親疏水性反轉納米材料主要策略為依賴于pH響應性鏈的斷裂去PEG化，而此類化學反應的發(fā)生需要耗費大量時間，這導致pH響應性慢，影響納米藥物的抗腫瘤效果。同時pH敏感性的引入不僅需要復雜的化學合成過程，同時此過程會引入有機試劑，可能會導致副作用的發(fā)生。由于腫瘤組織血管結構高度紊亂、高間質液壓及致密的胞外基質，納米藥物被發(fā)現(xiàn)主要富集在腫瘤血管附近，難以深入腫瘤深部組織，極大妨礙了其抗腫瘤效果。目前很多文獻報道納米特征，如粒徑、表面電位等對納米藥物穿透腫瘤組織的影響，但納米藥物親疏水性如何影響其腫瘤組織深部穿透的能力未見報道。大部分正電荷納米載藥系統(tǒng)通過內(nèi)吞方式進入腫瘤細胞后可通過質子海綿效應從溶酶體逃逸。同時人體細胞內(nèi)具有高谷胱甘肽(GSH)濃度，為胞外及血液環(huán)境中GSH濃度的幾百甚至千倍。因此利用納米載藥系統(tǒng)在溶酶體環(huán)境反轉成正電荷并在胞內(nèi)GSH響應性釋放藥物，有利于納米載藥系統(tǒng)的胞內(nèi)靶向釋放藥物。技術實現(xiàn)要素：為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種制作方法簡單、pH調(diào)控的親疏水性反轉迅速并具有電荷反轉及胞內(nèi)氧化還原響應性的納米凝膠及其制備方法，該納米凝膠在血液pH7.4條件下為親水溶脹的狀態(tài)；而在腫瘤組織pH6.5條件下反轉成疏水收縮的狀態(tài)；在腫瘤細胞內(nèi)溶酶體酸性環(huán)境中該納米凝膠表面電荷由負電荷反轉成為正電荷，依賴質子海綿效應而具備溶酶體逃逸的能力。本發(fā)明也提供了一種載藥納米凝膠及其制備方法，該載藥系統(tǒng)進一步在胞質高GSH環(huán)境中能將納米凝膠降解達到釋放藥物的作用。該載藥納米凝膠依賴于腫瘤酸性微環(huán)境及胞內(nèi)高GSH濃度，能實現(xiàn)血液長循環(huán)、腫瘤部位有效富集及腫瘤深部穿透、腫瘤細胞高效攝取及胞內(nèi)響應性釋放藥物，達到良好的抑瘤效果。本發(fā)明提供的一種pH調(diào)控的親疏水性反轉、電荷反轉及胞內(nèi)氧化還原響應性納米凝膠，由可自由基聚合的溫敏性單體、兩性離子型單體和含有胺基的pH敏感單體，通過含有二硫鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)而成。優(yōu)選地，所述可自由基聚合的溫敏性單體為N-異丙基丙烯酰胺、N,N'-二乙基丙烯酰胺、羧基異丙基丙烯酰胺、N-乙烯基異丁基酰胺、乙烯基甲基醚、N-乙烯基己內(nèi)酰胺、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、N-丙烯?；?N-烷基哌嗪或N-(L)-(1-羥甲基)丙基甲基丙烯酰胺，優(yōu)選為N-異丙基丙烯酰胺；所述兩性離子型單體為磺酸甜菜堿的甲基丙烯酸酯類衍生物、丙烯酰胺類衍生物或乙烯基吡啶衍生物，羧酸甜菜堿的甲基丙烯酸酯類衍生物、丙烯酰胺類衍生物或乙烯基吡啶衍生物，或者磷酸甜菜堿的甲基丙烯酸酯類衍生物、丙烯酰胺類衍生物或乙烯基吡啶衍生物，優(yōu)選為磺基甜菜堿甲基丙烯酸甲酯；所述含有胺基的pH敏感單體為含季銨或仲胺基團的不飽和單體；優(yōu)選為丙烯酰氧烷基季銨鹽陽離子單體、烯丙基季銨鹽陽離子單體或烯丙基仲胺類單體；更優(yōu)選地，所述丙烯酰氧烷基季銨鹽陽離子單體為甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨；所述烯丙基季銨鹽陽離子單體為烯丙基三甲基氯化銨；所述烯丙基仲胺類單體為N-甲基烯丙基胺；所述含有二硫鍵的交聯(lián)劑為N,N'-雙丙烯酰胱胺、二烯丙基三硫醚或二烯丙基二硫醚，優(yōu)選為N,N'-雙丙烯酰胱胺優(yōu)選地，可自由基聚合的溫敏性單體在單體中所占的比例為75-95mol％、兩性離子型單體在單體中所占的比例為1.5-10mol％，含有胺基的pH敏感單體在單體中所占的比例為3.5-15mol％，其中可自由基聚合的溫敏性單體在單體中所占的比例、兩性離子型單體在單體中所占的比例和含有胺基的pH敏感單體在單體中所占的比例之和為100％。優(yōu)選地，所述含有二硫基的交聯(lián)劑的用量為可自由基聚合的溫敏性單體、兩性離子型單體和含有胺基的pH敏感單體總量的0.5-4mol％。本發(fā)明還提供制備上述pH調(diào)控的親疏水性反轉、電荷反轉及胞內(nèi)氧化還原響應性納米凝膠的方法，包括如下步驟：(1)取可自由基聚合的溫敏性單體、兩性離子型單體和含有胺基的pH敏感單體溶解于水中，并加入表面活性劑及含有二硫鍵的交聯(lián)劑，超聲混合；(2)升溫到70℃以上，在氮氣氣氛下，加入過氧化物引發(fā)劑引發(fā)聚合反應，在此溫度和氮氣氣氛下反應4h以上，冷卻后轉入透析袋透析后冷凍干燥，得到pH調(diào)控的親疏水性反轉、電荷反轉及胞內(nèi)氧化還原響應性納米凝膠。優(yōu)選地，所述表面活性劑為十二烷基硫酸鈉，所述過氧化物引發(fā)劑為過硫酸鉀。優(yōu)選地，所述透析袋的截留分子量為12000Da。本發(fā)明還提供一種腫瘤微環(huán)境響應的納米凝膠載藥系統(tǒng)，包括上述的pH調(diào)控的親疏水性反轉、電荷反轉及胞內(nèi)氧化還原響應性納米凝膠和載在所述納米凝膠上的抗腫瘤藥物，優(yōu)選地，更優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物為阿霉素、喜樹堿、紫杉醇、多西紫杉醇或順鉑。優(yōu)選地，載藥量為2-8.0wt％。優(yōu)選地，抗腫瘤藥物的藥物分子通過溶脹吸附或者有機溶劑揮發(fā)法載入所述pH調(diào)控的親疏水性反轉、電荷反轉及胞內(nèi)氧化還原響應性納米凝膠中。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于:1、本發(fā)明提供pH調(diào)控親疏水性反轉、電荷反轉及胞內(nèi)氧化還原響應性的納米凝膠具有pH及GSH雙重響應性。該納米凝膠在pH7.4條件下的VPTT(VolumnPhaseTransitionTemperature，體積相轉變溫度)＞37℃，在體內(nèi)血液環(huán)境中為親水溶脹狀態(tài)，而在pH6.5條件下其VPTT＜37℃，在腫瘤微酸性環(huán)境中為疏水收縮的狀態(tài)；該納米凝膠的表面電荷在pH7.4和6.5條件下為負電荷，在溶酶體pH4.5條件下反轉成正電荷；在胞質高GSH條件下納米凝膠有效瓦解。2、本發(fā)明提供pH調(diào)控的親疏水性反轉、電荷反轉及胞內(nèi)氧化還原響應性載藥納米凝膠，其在血液pH7.4條件下為親水溶脹狀態(tài)，有利于其避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而維持長循環(huán)，而在腫瘤組織微酸性條件下反轉成疏水收縮的狀態(tài)，繼而有利于其在腫瘤部位富集、腫瘤深部穿透及被腫瘤細胞攝取；在腫瘤細胞溶酶體酸性環(huán)境中該納米凝膠表面電荷由負電荷反轉為正電荷，依賴質子海綿效應而具備溶酶體逃逸的能力，進一步在胞質高GSH條件下降解納米凝膠而有效釋放藥物，達到良好的抑瘤效果。3、該納米凝膠負載抗腫瘤藥物阿霉素后，可制得腫瘤微環(huán)境響應的納米凝膠載藥系統(tǒng)，可以延長抗腫瘤藥物(阿霉素)在血液中的循環(huán)時間，加強抗腫瘤藥物(阿霉素)在腫瘤部位的富集、深部穿透能力及被腫瘤細胞攝取，并在胞內(nèi)響應性釋放抗腫瘤藥物，進而提高抗腫瘤藥物對腫瘤的治療效果。4、本發(fā)明的納米凝膠合成過程簡單，并且本發(fā)明能快速有效的實現(xiàn)腫瘤微酸性環(huán)境下的親疏水性反轉、電荷反轉以及胞內(nèi)GSH響應性釋藥。附圖說明圖1為本發(fā)明的H-納米凝膠FTIR圖譜。圖2為H-納米凝膠在不同pH及溫度條件下的透過率。圖3為本發(fā)明的H-納米凝膠在37℃條件下孵育不同時間的透過率。圖4為本發(fā)明的H-納米凝膠不同pH條件下的表面電荷。圖5為巨噬細胞Raw264.7對FITC標記的本發(fā)明H-納米凝膠不同pH條件下的攝取情況。圖6為本發(fā)明H-載藥納米凝膠的藥代動力學研究。圖7為HepG2細胞不同pH條件下對本發(fā)明H-載藥納米凝膠的攝取。圖8為本發(fā)明H-載藥納米凝膠的組織分布行為。圖9為本發(fā)明H-載藥納米凝膠在腫瘤細胞團中的穿透。圖10為本發(fā)明H-載藥納米凝膠在離體腫瘤組織中的穿透。圖11為本發(fā)明H-載藥納米凝膠的腫瘤抑制作用研究。圖12A為本發(fā)明S1-納米凝膠在不同pH及溫度條件下的透過率。圖12B為本發(fā)明S1-納米凝膠在不同pH條件下的表面電荷圖13A為本發(fā)明S2-納米凝膠在不同pH及溫度條件下的透過率。圖13B為本發(fā)明S2-納米凝膠在不同pH條件下的表面電荷。圖14A為本發(fā)明S3-納米凝膠在不同pH及溫度條件下的透過率。圖14B為本發(fā)明S3-納米凝膠在不同pH條件下的表面電荷。具體實施方式為使本領域的技術人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施，下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。一、本發(fā)明實施例部分實施例1(1)準確稱取1.908gN-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)、0.262g磺基甜菜堿甲基丙烯酸甲酯(SBMA)及0.18mlN-甲基烯丙基胺(MAA)溶解于500ml三頸瓶中，用200ml超純水溶解，并加入0.04g十二烷基硫酸鈉作為表面活性劑及0.098g交聯(lián)劑N,N'-雙丙烯酰胱胺，超聲混合。對應N-異丙基丙烯酰胺、磺基甜菜堿甲基丙烯酸甲酯及N-甲基烯丙基胺的摩爾比為85.7:4.8:9.5，N,N'-雙丙烯酰胱胺的交聯(lián)密度為2mol％。(2)向上述反應體系通氮氣，除去混合液中殘留的氧氣。磁熱攪拌下水浴加熱，緩慢升溫至70-75℃后加入0.1g過硫酸鉀引發(fā)聚合反應(3)待溶液變渾濁后，在氮氣氣氛下70-75℃下繼續(xù)反應4.5h。(4)將所得反應液冷卻至室溫，轉移入透析袋中透析1星期，以除去表面活性劑和未反應原料。其中透析袋的截留分子量為12000Da。凍干保存。得到的納米凝膠簡稱為H-納米凝膠。實施例2(1)準確稱取2.012gN-乙烯基異丁基酰胺、0.250g羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯及0.20g甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨溶解于500ml三頸瓶中，用200ml超純水溶解，并加入0.04g十二烷基硫酸鈉作為表面活性劑及0.098g交聯(lián)劑N,N'-雙丙烯酰胱胺，超聲混合。對應N-乙烯基異丁基酰胺、羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯及甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨的摩爾比為89.6:5.5:4.9，N,N'-雙丙烯酰胱胺的交聯(lián)密度為1.9mol％。(2)向上述反應體系通氮氣，除去混合液中殘留的氧氣。磁熱攪拌下水浴加熱，緩慢升溫至70-75℃后加入0.1g過硫酸鉀引發(fā)聚合反應(3)待溶液變渾濁后，在氮氣氣氛下70-75℃下繼續(xù)反應4.5h。(4)將所得反應液冷卻至室溫，轉移入透析袋透析1星期，以除去表面活性劑和未反應原料。其中透析袋的截留分子量為12000Da。凍干保存。得到的凝膠為S1-納米凝膠。實施例3(1)準確稱取1.739gN-乙烯基己內(nèi)酰胺、0.434g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿及0.202gN,N′-二甲基烯丙基胺溶解于500ml三頸瓶中，用200ml超純水溶解，并加入0.04g十二烷基硫酸鈉作為表面活性劑及0.05g交聯(lián)劑二烯丙基二硫醚，超聲混合。對應N-乙烯基己內(nèi)酰胺,2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿及N,N′-二甲基烯丙基胺的摩爾比為74.5:9.0:14.5，二烯丙基二硫醚的交聯(lián)密度為2.1mol％。(2)向上述反應體系通氮氣，除去混合液中殘留的氧氣。磁熱攪拌下水浴加熱，緩慢升溫至70-75℃后加入0.1g過硫酸鉀引發(fā)聚合反應(3)待溶液變渾濁后，在氮氣氣氛下70-75℃下繼續(xù)反應4.5h。(4)將所得反應液冷卻至室溫，轉移入透析袋中透析1星期，以除去表面活性劑和未反應原料。其中透析袋的截留分子量為12000Da。凍干保存。凍干保存。得到的納米凝膠稱為S2-納米凝膠。實施例4(1)準確稱取2.125g乙烯基甲基醚、0.185g磺基甜菜堿甲基丙烯酸甲酯及0.19gN,N′-二甲基烯丙基胺溶解于500ml三頸瓶中，用200ml超純水溶解，并加入0.04g十二烷基硫酸鈉作為表面活性劑及0.05g交聯(lián)劑二烯丙基二硫醚，超聲混合。對應乙烯基甲基醚,磺基甜菜堿甲基丙烯酸甲酯及N,N′-二甲基烯丙基胺的摩爾比為92.7:1.6:5.7，二烯丙基二硫醚的交聯(lián)密度為2.1mol％。(2)向上述反應體系通氮氣，除去混合液中殘留的氧氣。磁熱攪拌下水浴加熱，緩慢升溫至70-75℃后加入0.1g過硫酸鉀引發(fā)聚合反應(3)待溶液變渾濁后，在氮氣氣氛下70-75℃下繼續(xù)反應4.5h。(4)將所得反應液冷卻至室溫，轉移入透析袋透析1星期，以除去表面活性劑和未反應原料。其中透析袋的截留分子量為12000Da。凍干保存。凍干保存。該納米凝膠稱為S3-納米凝膠。實施例5(1)準確稱取1.0mg阿霉素鹽酸鹽，加入1ml氯仿中，在體系中加入10μl三乙胺避光超聲30min，得到反應液A；(2)將H-納米凝膠以2.5mg/ml的濃度溶脹于超純水中，并將反應液A加入8mlH-納米凝膠水溶液中，超聲混勻15min后，得到反應液B；(3)將反應液B用旋轉蒸發(fā)儀旋蒸1h，得到反應液C；(4)將反應液C置于超濾管中，4000rpm，20min離心3次，收集上液，為負載阿霉素的納米凝膠。采用熒光分光度法最終得到H-載藥納米凝膠的載藥量為4.0％。實施例6(1)準確稱取0.8mg紫杉醇，溶解于2ml氯仿中；(2)將H-納米凝膠以2.5mg/ml的濃度溶脹于上述超純水中，將上述紫杉醇溶液滴加到H-納米凝膠水溶液中，超聲混勻15min；(3)將上述乳液用旋轉蒸發(fā)儀旋蒸1h，得到載藥納米凝膠混合液；(4)48h后將上述載藥凝膠置于超濾管中，4000rpm，20min離心3次，收集上液，為負載紫杉醇的納米凝膠。從實施例可看出，本發(fā)明制得的納米凝膠可負載各種疏水性藥物如：阿霉素和紫杉醇等。二、本發(fā)明實驗例部分實驗例1H-納米凝膠的FITR圖譜采用FITR來確證H-納米凝膠中單體的交聯(lián)情況。如圖1所示，1548及1466cm-1處的峰主要為NIPAM及N-甲基烯丙基胺中的-N-H鍵及-C-H鍵的伸縮振動峰。而1172及1040cm-1處則為SBMA結構中的-S＝O鍵，1644cm-1處的波峰則確證了聚SBMA片段中C-N+鍵的存在。該FITR初步驗證了納米凝膠結構中NIPAM、SBMA及MAA的正確交聯(lián)。實驗例2H-納米凝膠的pH調(diào)控的親疏水性反轉能力通過檢測H-納米凝膠不同溫度條件下的透過率變化來得到其在不同pH條件下的VPTT變化，繼而推測該凝膠在37℃條件下的親疏水性變化。溶液配置：PBS中加入10％FBS，即9mlPBS加入1mlFBS，并將H-納米凝膠以15mg/ml溶解于其中，即準確稱取60mg納米凝膠溶解于4ml上述溶液中。用NaOH或HCl調(diào)整H-納米凝膠的pH至7.4、6.5或4.5，檢測H-納米凝膠在不同pH及溫度條件下的透過率變化。具體溫度設定為20、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、53及58℃。每種溫度條件下孵育10min。利用分光光度計檢測560nm下的納米凝膠水溶液的透過率。同時將不同pH條件下的H-納米凝膠水溶液置于37℃條件，孵育0、1、3、5、7、9及11min后，檢測其560nm處的透過率。由圖2所示，隨著溫度的升高，H-納米凝膠不同pH條件下的透過率均下降，曲線通過玻爾茲曼擬合并求導得到不同pH條件下的VPTT如下：pH7.4條件下為41.0℃，大于生理溫度37℃，這意味著H-納米凝膠在生理條件(pH7.4,37℃)為親水溶脹狀態(tài)；pH6.5條件下為35.6℃，小于生理溫度37℃，這意味著H-納米凝膠在腫瘤組織(pH6.5,37℃)為疏水收縮狀態(tài)；而pH4.5條件下其VPTT為34.0℃。我們對H-納米凝膠在不同pH及37℃孵育條件下的透過率也進行了監(jiān)控。如圖3所示，其在pH7.4環(huán)境中的透過率由于凝膠為親水溶脹的狀態(tài)而保持不變，而在pH6.5環(huán)境中的透過率則在11min內(nèi)降至零點，在pH4.5環(huán)境中由于納米凝膠疏水性更強，變化更加迅速。這說明H-納米凝膠在pH6.5及4.5條件下其由親水性迅速反轉成疏水性。實驗例3H-納米凝膠在不同pH條件下的表面電荷溶液配置：將H-納米凝膠用超純水稀釋至0.25mg/ml，并用NaOH及HCl調(diào)其pH至7.4、6.5或4.5。用激光粒度儀檢測H-納米凝膠在不同pH條件下的zeta電位。如圖4所示，H-納米凝膠在pH7.4及6.5條件下的zeta電位均為-17mV左右，而在pH4.5條件下則反轉至+13mV，這種電荷反轉有利于其在溶酶體中的逃逸。實驗例4H-載藥納米凝膠的載藥量通過紫外分光光度法檢測H-載藥納米凝膠的載藥量。通過紫外分光光度法檢測未包載的阿霉素的質量W1mg，而20mg納米凝膠對應阿霉素的投藥量為1mg，根據(jù)公式Wt(％)＝(1-W1)/(1+20-W1)×100％,得到H-載藥納米凝膠的載藥量為4.0％。實驗例5H-載藥納米凝膠的藥物釋放行為藥物溶液的配制：將H-載藥納米凝膠溶解在水中配制成0.5mg/ml的水溶液。釋放液的配制：將PBS作為基本釋放液，用NaOH或HCl將pH分別調(diào)整至7.4、6.5或4.5；取50mlPBS加入150mg谷胱甘肽配制成含有10mMGSH的PBS溶液，并用NaOH或HCl將pH分別調(diào)整至7.4、6.5或4.5；將上述配制的10mMGSHPBS溶液用PBS進一步稀釋至2μM后，用NaOH或HCl將pH分別調(diào)整至7.4、6.5或4.5。將0.2ml藥物溶液裝入透析袋中(分子量截留：12000Da)，密封，然后將裝有藥物溶液的透析袋浸沒在25ml的釋放液中，再置于搖床中震蕩，溫度為37℃，轉速為200rmp。分別在20min、40min、1h、2h、4h、6h、8h、11h、24h時間點取出1ml釋放液，再補充1ml相應的釋放液。每種釋放液中的藥物釋放實驗平行做三組。藥物釋放實驗全程在避光的條件下進行。取出的釋放液通過熒光測定藥物濃度并計算累積釋放量。H-載藥納米凝膠的累積釋放量結果見表1。表1H-載藥納米凝膠在不同釋放液中的累積釋放量從表1可以看出，H-載藥納米凝膠釋放行為具有一定的pH響應性，隨著pH的降低，24h釋放量從pH7.4條件下的9.31％升高至pH6.5條件下的18.47％，而在pH4.5條件下的釋放量則為27.82％。pH7.4條件下，0mMGSH及2μMGSH對其釋放并無影響，而10mMGSH顯著性提高其累計釋放量至26.70％。pH6.5條件下的藥物釋放具有相同的趨勢，而在pH4.5條件下GSH的響應性釋放并不明顯，這可能與pH4.5條件下納米凝膠收縮避免GSH與凝膠二硫鍵作用有關。實驗例6不同pH條件下巨噬細胞對H-納米凝膠的吞噬作用溶液配制：通過氨基與羧基的反應將異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)按照2％耦聯(lián)至H-納米凝膠中，并將FITC耦聯(lián)后的納米凝膠用含有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至0.25mg/ml。將上述溶液用NaOH或HCl調(diào)整pH至7.4或6.5，并置于37℃條件孵育2h。而后添加至鋪有Raw264.7細胞的12孔板中，細胞密度為每孔2.0×104個細胞。繼續(xù)在37℃中孵育1h后收集細胞，并用流式細胞儀進行檢測(FC500，Beckman，F(xiàn)LI)。H-納米凝膠由于在pH7.4條件下呈親水性，而在pH6.5條件下發(fā)生親疏水性反轉，因而其在pH6.5條件下被巨噬細胞吞噬得更多，如圖5所示。實驗例7載藥納米凝膠的藥代動力學實驗藥物的配制：將H-載藥納米凝膠用超純水稀釋至1mg/ml；同時將阿霉素原料藥溶解在水中配制成1mg/ml的阿霉素水溶液。隨機將SD大鼠(250-270g)分為三個實驗組，每組三只大鼠。將載藥納米凝膠和阿霉素原料藥水溶液以4mg(阿霉素當量)/kg的給藥量、1ml的劑量分別通過尾靜脈注射到相應的實驗組。分別在給藥后15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h及48h時間點，從大鼠的眼眶靜脈叢取血0.5ml,5000rmp離心10min后，取血漿100μl，用熒光分光光度法檢測血漿中阿霉素的濃度。從圖6可知，阿霉素原料藥給藥15min后的血藥濃度只有0.73μg/ml，而H-載藥納米凝膠則能保持較高濃度(2.89μg/ml)。同時H-載藥納米凝膠組在血漿中存在時間較長。將血藥濃度-時間曲線用藥代動力學軟件DAS2.0進行二室藥代動力學模型擬合，得到的參數(shù)如表2。其中H-載藥納米凝膠的血漿消除半衰期t1/2z是阿霉素原料藥的7.74倍，血藥濃度-時間曲線下面積AUC(0-∞)是阿霉素原料藥的5.1倍。這表明，H-納米凝膠在pH7.4環(huán)境中的親水性決定了其可以顯著延長阿霉素在血液中的循環(huán)時間。表2載藥納米凝膠及DOX的藥代動力學參數(shù)參數(shù)單位游離阿霉素H-載藥納米凝膠曲線下面積(0-∞)mg/L*h7.76±2.3039.63±5.99半數(shù)清除時間h2.10±0.3816.26±5.99清除率L/h/kg0.65±0.250.09±0.02最高血藥濃度mg/L0.73±0.292.89±0.12分布體積L/kg2.75±2.240.87±0.25實驗例8不同pH條件下HepG2細胞對H-載藥納米凝膠的攝取溶液配制：將H-載藥納米凝膠用含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋至阿霉素濃度10μg/ml。將上述溶液用NaOH或HCl調(diào)整pH至7.4或6.5，而后添加至鋪有HepG2細胞的12孔板中，細胞密度為每孔2.0×104個細胞。繼續(xù)在37℃中孵育2h后收集細胞，并用流式細胞儀進行檢測(FC500，Beckman，F(xiàn)L2)。如圖7所示，HepG2細胞pH6.5條件下對H-載藥納米凝膠的攝取顯著性高于pH7.4條件下的攝取量，提示pH調(diào)控的親疏水性反轉能有效增加腫瘤細胞對H-載藥納米凝膠的攝取。實驗例9載藥納米凝膠在腫瘤組織中的蓄積實驗藥物的配制：將H-載藥納米凝膠用超純水稀釋至500μg/ml；并將阿霉素原料藥溶解在水中配制成500μg/ml的阿霉素水溶液。小鼠肝癌H22皮下瘤模型的建立：在Balb/C小鼠背部右下側近右下肢處皮下接種肝癌H22細胞懸液100μl(細胞數(shù)為1×105)，建立小鼠肝癌H22皮下瘤模型。當小鼠肝癌H22皮下瘤長到體積為0.09～0.12cm3時，隨機將荷有肝癌H22皮下瘤的小鼠(18g-22g)分為2組，每組8只。將載藥納米凝膠和阿霉素原料藥水溶液以4mg(阿霉素當量)/kg的給藥量、200μl的劑量分別通過尾靜脈注射到相應的實驗組。尾靜脈注射24h和72h后各組處死4只小鼠，取出腫瘤并制備成組織勻漿，通過熒光分光光度法檢測其中的藥物含量。從附圖8的組織分布圖可知，尾靜脈注射H-載藥納米凝膠24h后腫瘤中阿霉素的濃度為11.72μg/g組織，而尾靜脈注射阿霉素原料藥24h后腫瘤中阿霉素的濃度僅為1.82μg/g組織。而尾靜脈注射阿霉素原料藥72h后，腫瘤組織中阿霉素含量明顯降低(1.14μg/g組織)，而H-載藥納米凝膠給藥組的含量仍能保持6.15μg/g組織。這表明，H-載藥納米凝膠不僅能更多的蓄積阿霉素于腫瘤中，并且能保持長期滯留。實驗例10不同pH條件下H-載藥納米凝膠在腫瘤細胞團中的穿透溶液配制：T7緩沖液(pH7.4,50mMTris,150mMNaCl)藥物配制：用不同pH(7.4或6.5)的RPMI1640培養(yǎng)基將阿霉素及H-載藥納米凝膠稀釋至5μg/ml。H22腫瘤細胞團預先通過3D軟纖維蛋白膠獲得，具體方法如下：H22細胞預先用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至1.2×104個/ml，將纖維蛋白原膠用T7緩沖液稀釋至2mg/ml，并與H22細胞懸液以1：1混勻。在預冷的96孔板中加入1μl凝血酶(0.1U/μl)，而后與50μl上述混合液吹打混勻。37℃條件下孵育15min后，加入200μlRPMI1640完全培養(yǎng)基。待細胞團生長至第五天，將上述藥物溶液加入細胞團中孵育6h。通過PBS洗3次后用4％多聚甲醛固定30min后用激光共聚焦顯微鏡成像。阿霉素通過Ex＝488nm、Em＝560nm的濾光片進行觀察。由圖9所示(圖中灰度區(qū)域為阿霉素的熒光分布區(qū)域)，pH6.5條件下H-載藥納米凝膠在H22腫瘤細胞團不同層面的阿霉素熒光強度均顯著性高于pH7.4條件下的熒光強度。而游離阿霉素的趨勢則剛好相反。這意味著H-納米凝膠在pH6.5條件的親疏水性反轉有利于其在H22腫瘤細胞團中的穿透。實驗例11不同pH條件下H-載藥納米凝膠在離體腫瘤組織中的穿透實驗藥物的配制：RPMI1640完全培養(yǎng)基用NaOH或HCl調(diào)整pH至7.4或6.5，而后將阿霉素及H-載藥納米凝膠稀釋至5μg/ml。小鼠肝癌H22皮下瘤模型的建立：通過在Balb/C小鼠背部右下側近右下肢處皮下接種肝癌H22細胞懸液100μl(細胞數(shù)為1×105)，建立小鼠肝癌H22皮下瘤模型。待皮下瘤生長至約8.0mm×8.0mm，通過頸椎脫臼法處死小鼠并剝離出腫瘤。并將剝離出來的腫瘤浸沒在上述實驗藥物溶液中。將該體系置于搖床37℃孵育24h。PBS洗2次后進行冷凍切片，并用激光共聚焦顯微鏡Ex＝488nm、Em＝560nm的濾光片觀察腫瘤邊緣區(qū)域阿霉素的分布情況。如圖10所示(圖中灰度區(qū)域為阿霉素的熒光分布區(qū)域)，pH6.5條件下H-載藥納米凝膠中阿霉素的腫瘤分布深度顯著性高于pH7.4條件下的分布深度。而游離阿霉素pH7.4條件下的腫瘤分布深度則顯著性高于pH6.5條件下的分布深度，這表明H-載藥納米凝膠pH6.5條件下的親疏水性反轉有利于負載藥物在腫瘤部位的深部穿透。實驗例12載藥納米凝膠的腫瘤抑制作用實驗藥物的配制：將H-載藥納米凝膠用超純水稀釋至500μg/ml；并將阿霉素原料藥溶解在水中配制成500μg/ml的阿霉素水溶液。小鼠肝癌H22皮下瘤模型的建立：通過在Balb/C小鼠背部右下側近右下肢處皮下接種肝癌H22細胞懸液100μl(細胞數(shù)為1×105)，建立小鼠肝癌H22皮下瘤模型。當小鼠肝癌H22皮下瘤長到體積為60mm3時，隨機將荷H22肝癌皮下瘤的小鼠(18～22g)分為三組，每組5只。將載藥納米凝膠和阿霉素原料藥水溶液以4mg(阿霉素當量)/kg的給藥量、200μl的劑量于第1、4、7、10和13天分別通過尾靜脈注射到相應的實驗組，空白對照組注射200μl的生理鹽水，每兩天用游標卡尺測量腫瘤的最長處(L)和最寬處(W)，計算腫瘤體積V＝L×W2/2，第16天將各實驗組的小鼠處死，剝出皮下瘤并稱重。從附圖11可知，與生理鹽水組相比，載藥納米凝膠組及阿霉素原料藥組腫瘤體積顯著降低。同時給藥結束后，H-載藥納米凝膠組的相對腫瘤體積顯著性低于阿霉素原料藥組。在第16天，H-載藥納米凝膠給藥組的抑瘤率為76.1％，高于阿霉素原料藥組的55.9％。這表明H-載藥納米凝膠對小鼠肝癌H22皮下瘤具有更好的抑制作用。而我們負載紫杉醇的載藥納米凝膠也表現(xiàn)出良好腫瘤抑制作用。實驗例13S1-納米凝膠pH調(diào)控的親疏水性反轉及電荷反轉能力溶液配置：PBS中加入10％FBS，即9mlPBS加入1mlFBS，并將S1-納米凝膠以15mg/ml溶解于其中，即準確稱取60mg納米凝膠溶解于4ml上述溶液中。用NaOH或HCl調(diào)整S1-納米凝膠pH至7.4或6.5，檢測S1-納米凝膠在不同pH及溫度條件下的透過率變化。具體溫度設定為20、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、53及58℃。每種溫度條件下孵育10min。利用分光光度計檢測560nm下的納米凝膠水溶液的透過率。溶液配制：將S1-納米凝膠用超純水稀釋至0.25mg/ml，并用NaOH或HCl調(diào)其pH至7.4、6.5或4.5。用激光粒度儀檢測S1-納米凝膠水溶液在不同pH條件下的zeta電位。如圖12A所示，S1-納米凝膠在pH7.4條件下的VPTT為40.1℃，大于生理溫度37℃，因此在血液及正常組織環(huán)境為親水溶脹狀態(tài)，而在pH6.5條件下的VPTT為36.3℃，小于37℃，表明S2-納米凝膠在腫瘤酸性微環(huán)境可以有效實現(xiàn)親疏水性反轉。S1-納米凝膠在pH7.4及6.5條件下的表面電荷為-15mV左右，而在pH4.5條件下則反轉成為+5.6mV左右(圖12B)，表明S1-納米凝膠在細胞溶酶體酸性環(huán)境中能有效實現(xiàn)電荷反轉。以上結果表明S1-納米凝膠具有pH調(diào)控的親疏水性反轉及電荷反轉特性。實驗例14S2-納米凝膠pH調(diào)控的親疏水性反轉及電荷反轉能力溶液配置：PBS中加入10％FBS，即9mlPBS加入1mlFBS，并將S2-納米凝膠以15mg/ml溶解于其中，即準確稱取60mg納米凝膠溶解于4ml上述溶液中。用NaOH或HCl調(diào)整S2-納米凝膠pH至7.4或6.5，檢測S2-納米凝膠在不同pH及溫度條件下的透過率變化。具體溫度設定為20、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、53及58℃。每種溫度條件下孵育10min。利用分光光度計檢測560nm下的納米凝膠水溶液的透過率。溶液配制：將S2-納米凝膠用超純水稀釋至0.25mg/ml，并用NaOH或HCl調(diào)其pH至7.4、6.5或4.5。用激光粒度儀檢測S2-納米凝膠水溶液在不同pH條件下的zeta電位。如圖13A所示，S2-納米凝膠在pH7.4條件下的VPTT為38.6℃，大于生理溫度37℃，因此在血液及正常組織環(huán)境為親水溶脹狀態(tài)，而在pH6.5條件下的VPTT為35.1℃，小于37℃，表明S3-納米凝膠在腫瘤酸性微環(huán)境可以有效實現(xiàn)親疏水性反轉。S2-納米凝膠在、在pH7.4及6.5條件下的表面電荷為-20mV左右，而在pH4.5條件下則反轉成為+13.5mV左右(圖13B)，表明S2-納米凝膠在細胞溶酶體酸性環(huán)境中能有效實現(xiàn)電荷反轉。以上結果表明S2-納米凝膠具有pH調(diào)控的親疏水性反轉及電荷反轉特性。實驗例15S3-納米凝膠pH調(diào)控的親疏水性反轉及電荷反轉能力溶液配置：PBS中加入10％FBS，即9mlPBS加入1mlFBS，并將S3-納米凝膠以15mg/ml溶解于其中，即準確稱取60mg納米凝膠溶解于4ml上述溶液中。用NaOH或HCl調(diào)整S3-納米凝膠pH至7.4或6.5，檢測S3-納米凝膠在不同pH及溫度條件下的透過率變化。具體溫度設定為20、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、53及58℃。每種溫度條件下孵育10min。利用分光光度計檢測560nm下的納米凝膠水溶液的透過率。溶液配制：將S3-納米凝膠用超純水稀釋至0.25mg/ml，并用NaOH或HCl調(diào)其pH至7.4、6.5或4.5。用激光粒度儀檢測S3-納米凝膠水溶液在不同pH條件下的zeta電位。如圖14A所示，S3-納米凝膠在pH7.4條件下的VPTT為41.5℃，大于生理溫度37℃，因此在血液及正常組織環(huán)境為親水溶脹狀態(tài)，而在pH6.5條件下的VPTT為36.2℃，小于37℃，表明S1-納米凝膠在腫瘤酸性微環(huán)境可以有效實現(xiàn)親疏水性反轉。S3-納米凝膠在pH7.4及6.5條件下的表面電荷為-15mV左右，而在pH4.5條件下則反轉成為+6.8mV左右(圖14B)，表明S3-納米凝膠在細胞溶酶體酸性環(huán)境中能有效實現(xiàn)電荷反轉。以上結果表明S3-納米凝膠具有pH調(diào)控的親疏水性反轉及電荷反轉特性。以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范圍不限于此。本
技術領域：
的技術人員在本發(fā)明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍以權利要求書為準。當前第1頁1 2 3