本發(fā)明涉及一種用作藥物的fc融合高親和力ige受體α鏈(fc-fusedhighaffinityigereceptorα-chain)。

更詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及一種在低ph值下具有優(yōu)異穩(wěn)定性的fc融合高親和力ige受體α鏈、以及其藥物用途。

背景技術(shù)：

免疫球蛋白e(ige)是負(fù)責(zé)過敏反應(yīng)的免疫球蛋白類之一。由b細(xì)胞分泌、或在b細(xì)胞表面上表達(dá)的ige會與肥大細(xì)胞以及嗜堿性粒細(xì)胞等表面上已知的高親和力ige受體(fcεri)結(jié)合。當(dāng)抗原蛋白與肥大細(xì)胞表面受體上的ige結(jié)合時，則形成ige與抗原發(fā)生交聯(lián)的形態(tài)。之后，細(xì)胞內(nèi)顆粒中儲存的組織胺和血清素等化學(xué)介質(zhì)等會被釋放出來。其結(jié)果會誘發(fā)炎癥反應(yīng)，引起毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管通透性亢進(jìn)等i型過敏癥狀(非專利文獻(xiàn)1)。

因此，抑制ige與fcεri結(jié)合的化合物或蛋白由于會抑制ige與肥大細(xì)胞以及嗜堿性粒細(xì)胞等表面上已知的fcεri結(jié)合，而作為支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎等i型過敏性疾病的治療劑受到期待(非專利文獻(xiàn)2)。

近年來，除了開發(fā)以現(xiàn)有的低分子化合物為有效成分的藥物以外，還開發(fā)了較強(qiáng)地與生物體內(nèi)的特定受體等結(jié)合，并表現(xiàn)出優(yōu)異的治療效果的蛋白藥物。例如，作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療劑，已知有依那西普。依那西普是在生物體內(nèi)以腫瘤壞死因子(tnf)可溶性受體發(fā)揮抑制tnf作用的效果為目的而開發(fā)出的全人源性可溶性tnfα/ltα受體制劑。

蛋白藥物可以期待較高的治療效果，但另一方面，在其制造工序中，也可能會產(chǎn)生蛋白藥物所特有的問題。

通常在將抗體和fc融合蛋白制成藥物時，會使用利用蛋白a(proteina)的純化方法。在該方法中，為了洗脫與蛋白a結(jié)合的目的蛋白，會使用低ph值的緩沖液。另外，為了使病毒滅活，希望對目的蛋白在一定時間內(nèi)及低ph值下進(jìn)行處理。

在低ph值下穩(wěn)定性差的蛋白容易產(chǎn)生聚集體。當(dāng)聚集體的比例較高時，在蛋白藥物的制造中會導(dǎo)致純化效率及產(chǎn)量降低。另外，藥物中混入聚集體，也可能會引起免疫反應(yīng)，導(dǎo)致過敏反應(yīng)等嚴(yán)重副作用。

因此，在蛋白藥物的制造中，在低ph值下目的蛋白的不穩(wěn)定性成為了問題。

專利文獻(xiàn)1記載了一種包含免疫球蛋白和細(xì)胞外區(qū)域而成的多肽(免疫黏附素)。專利文獻(xiàn)1中，作為免疫黏附素的示例之一，記載有高親和力ige受體。但是，上述文獻(xiàn)中并未具體記載高親和力ige受體與免疫球蛋白的融合蛋白。

非專利文獻(xiàn)3記載了高親和力ige受體α鏈(fcεriα-chain，以下稱作“fcer1a”)與免疫球蛋白g1(igg1)的融合蛋白(以下稱作“融合蛋白a”(fusionproteina))。但是，上述文獻(xiàn)中記載的融合蛋白a與本發(fā)明的蛋白相比，fcer1a與igg1(fc)的結(jié)合形式大不相同。即，本發(fā)明的蛋白，在其fcεri與igg1之間的接頭片段區(qū)域中具有特征性氨基酸序列。

專利文獻(xiàn)2記載了高親和力ige受體(fcεri)的水溶性片段與人fc區(qū)域通過連接肽連接而成的融合蛋白(npb301)。但是，本發(fā)明的蛋白并不包含專利文獻(xiàn)2中記載的連接肽。另外，專利文獻(xiàn)2并未記載及暗示本發(fā)明的接頭片段區(qū)域的特征性氨基酸序列。

專利文獻(xiàn)3記載了fcer1a與免疫球蛋白g2(igg2)的融合蛋白。但是，該融合蛋白與上述igg2的融合蛋白和本發(fā)明的蛋白相比，在接頭片段區(qū)域和fc區(qū)域中，氨基酸序列有所不同。

專利文獻(xiàn)4記載了非人靈長類fcer1a與igg1的融合蛋白。另外，專利文獻(xiàn)5～7記載了fcer1a與igg1的融合蛋白。但是，上述文獻(xiàn)并未記載及暗示本發(fā)明的接頭片段區(qū)域的特征性氨基酸序列。

上述非專利文獻(xiàn)3和專利文獻(xiàn)1～7并未記載及暗示本發(fā)明的蛋白。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：美國專利第5,565,335號說明書

專利文獻(xiàn)2：國際公開第2012/169735號

專利文獻(xiàn)3：中國專利申請公開第101633698號說明書

專利文獻(xiàn)4：國際公開第2008/028068號

專利文獻(xiàn)5：國際公開第2011/056606號

專利文獻(xiàn)6：國際公開第2008/099178號

專利文獻(xiàn)7：國際公開第2008/099188號

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：羅智靖，“アレルギーの分子細(xì)胞機(jī)構(gòu)”bioindustry，2008年，第25卷，第9號，p.23-39

非專利文獻(xiàn)2：chiseira等，“internationalimmunology”，1993年，第5卷，第1號，p.47-54

非專利文獻(xiàn)3：m.haak-frendscho等，“journalofimmunology”，1993年，第151卷，第1號，p.351-358

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

本發(fā)明的課題在于提供一種在低ph值下具有優(yōu)異穩(wěn)定性的fc融合高親和力ige受體α鏈。

解決課題的手段

為了獲得針對低ph值及熱的穩(wěn)定性高的fc融合高親和力ige受體α鏈，本發(fā)明人進(jìn)行了潛心研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在包含高親和力ige受體α鏈與igg1的fc區(qū)域的融合蛋白中，通過使用包含3個cys的接頭片段，能夠獲得穩(wěn)定性高的fc融合高親和力ige受體α鏈，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明如下。

本發(fā)明涉及以下〔1〕～〔5〕等。

〔1〕一種fc融合蛋白，其特征在于，含有：

(i)高親和力ige受體α鏈，以及

(ii)igg1的fc區(qū)域，

并且所述(i)和(ii)之間的接頭片段區(qū)域為seqidno:2的氨基酸序列。

〔2〕一種fc融合蛋白，其為權(quán)利要求1所述的fc融合蛋白，其特征在于，所述蛋白為包含seqidno:3的氨基酸序列的蛋白；或者其為包含seqidno:3的氨基酸序列c末端缺失賴氨酸(k)而成的氨基酸序列的fc融合蛋白。

〔3〕根據(jù)〔1〕或〔2〕的fc融合蛋白，其為二聚體。

〔4〕根據(jù)〔3〕的fc融合蛋白，其中，接頭片段區(qū)域的半胱氨酸殘基相互形成3個二硫鍵。

〔5〕一種藥物組合物，其含有〔1〕～〔4〕中任一項的fc融合蛋白作為有效成分。

本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請?zhí)?015-032231號、2015-252231號的公開內(nèi)容。

發(fā)明效果

本發(fā)明的蛋白在低ph值下具有優(yōu)異穩(wěn)定性。另外，本發(fā)明的蛋白具有針對ige的優(yōu)異中和活性。因此，本發(fā)明的蛋白能夠用作預(yù)防和治療由ige介導(dǎo)的i型過敏性疾病的蛋白藥物。

附圖說明

圖1表示針對人ige的結(jié)合抑制活性。圖中，橫軸表示各藥物的濃度(mol/l)，縱軸表示以添加了一定量的ige時的結(jié)合量為基準(zhǔn)，將對與固定在孔板上的蛋白1(protein1)結(jié)合的ige的量表示為百分率的值(游離ige(相對于對照的％))。圖中，圓圈表示蛋白1，方塊表示奧馬珠單抗(omalizumab)的值。

圖2表示在低ph值下聚集體含有率變化(％)的推移。圖中，橫軸表示天數(shù)(天)，縱軸表示聚集體含有率的變化(％)。圖中，圓圈表示蛋白1，方塊表示融合蛋白a(fusionproteina)的值。

圖3表示熱處理下的聚集體含有率變化(％)的推移。圖中，橫軸表示天數(shù)(天)，縱軸表示聚集體含有率的變化(％)。圖中，圓圈表示蛋白1，方塊表示融合蛋白a的值。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明中，只要沒有特別說明，各術(shù)語則具有以下含義。

本發(fā)明中，“高親和力ige受體α鏈(fcer1a)”是指包含高親和力ige受體的細(xì)胞外區(qū)域即α鏈部分的蛋白。高親和力ige受體α鏈，例如是指以下seqidno:1所示的蛋白。

seqidno:1：

vpqkpkvslnppwnrifkgenvtltcngnnffevsstkwfhngslseetnsslnivnakfedsgeykcqhqqvnesepvylevfsdwlllqasaevvmegqplflrchgwrnwdvykviyykdgealkywyenhnisitnatvedsgtyyctgkvwqldyeseplnitvikaprekywl

上述高親和力ige受體α鏈中，包括對于seqidno:1所示的氨基酸序列，例如使用blast(basiclocalalignmentsearchtoolatthenationalcenterforbiologicalinformation(美國國家生物技術(shù)信息中心的基本局部比對搜索工具))等(例如，使用默認(rèn)即初始設(shè)置的參數(shù))計算時，包含具有90％以上、95％以上、97％以上、或99％以上同一性的氨基酸序列，且具有針對ige的結(jié)合能力的蛋白。另外，包括對于seqidno:1所示的氨基酸序列，包含取代、缺失和/或添加1個或多個或數(shù)個(1～10個，優(yōu)選為1～5個、更優(yōu)選為1個或2個)氨基酸的氨基酸序列，且具有針對ige的結(jié)合能力的蛋白。

本發(fā)明中，“igg1的fc區(qū)域”是指免疫球蛋白g1的fc片段，即，天然免疫球蛋白g1的ch2和ch3恒定區(qū)。所述igg1的fc區(qū)域中，包括天然突變體、人工變異體、以及截短的形態(tài)中任一個。

本發(fā)明中，“高親和力ige受體α鏈和igg1的fc區(qū)域的接頭片段區(qū)域”是指從上述高親和力ige受體α鏈與上述igg1的fc區(qū)域的連接點(diǎn)起沿fc區(qū)域方向的14個氨基酸殘基的區(qū)域。

本發(fā)明中，“fc融合蛋白”是指包含高親和力ige受體α鏈和免疫球蛋白的fc片段的重組蛋白。

本發(fā)明蛋白的特征在于，其高親和力ige受體α鏈和igg1的fc區(qū)域之間的接頭片段區(qū)域為以下seqidno:2所示的氨基酸序列。

seqidno:2：

epkscdkthtcppc

本發(fā)明的蛋白優(yōu)選為包含以下seqidno:3所示的氨基酸序列的fc融合蛋白(以下稱作“蛋白1”(protein1))。

seqidno:3：

vpqkpkvslnppwnrifkgenvtltcngnnffevsstkwfhngslseetnsslnivnakfedsgeykcqhqqvnesepvylevfsdwlllqasaevvmegqplflrchgwrnwdvykviyykdgealkywyenhnisitnatvedsgtyyctgkvwqldyeseplnitvikaprekywlepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

seqidno:3所示的氨基酸序列，具有按照如下順序?qū)eqidno:1所示的氨基酸序列(seqidno:3所示的氨基酸序列中從第1位的val至第179位的leu)、seqidno:2所示的氨基酸序列(seqidno:3所示的氨基酸序列中從第180位的glu至第193位的cys)、以及免疫球蛋白的fc片段的氨基酸序列(seqidno:3所示的氨基酸序列中從第194位的pro至第411位的lys)融合而成的序列。該fc融合蛋白，包括對于seqidno:3所示的氨基酸序列中除了相當(dāng)于seqidno:2的氨基酸序列的從第180位的glu至第193位的cys的氨基酸序列以外的氨基酸序列，例如使用blast(basiclocalalignmentsearchtoolatthenationalcenterforbiologicalinformation(美國國家生物技術(shù)信息中心的基本局部比對搜索工具))等(例如，使用默認(rèn)即初始設(shè)置的參數(shù))計算時，包含具有90％以上、95％以上、97％以上、或99％以上同一性的氨基酸序列，且具有針對ige的結(jié)合能力的蛋白。另外，包括對于seqidno:3所示的氨基酸序列中除了相當(dāng)于seqidno:2的氨基酸序列的從第180位的glu至第193位的cys的氨基酸序列以外的氨基酸序列，包含取代、缺失和/或添加1個或多個或數(shù)個(1～10個，優(yōu)選為1～5個、更優(yōu)選為1個或2個)氨基酸的氨基酸序列，且具有針對ige的結(jié)合能力的蛋白。

在制造重組抗體時，c末端的賴氨酸可能會因翻譯后修飾而缺失。因此，本發(fā)明的蛋白也可以是包含上述蛋白1的c末端缺失賴氨酸(k)而成的氨基酸序列的fc融合蛋白。例如，包含seqidno:3所示蛋白的蛋白1的c末端缺失賴氨酸(k)而成的氨基酸序列的fc融合蛋白，是由seqidno:3所示的氨基酸序列第1位至第410位的氨基酸序列組成的。

本發(fā)明的蛋白，其高親和力ige受體α鏈和igg1的fc區(qū)域既包含通過由seqidno:2的氨基酸序列組成的接頭片段而成的fc融合蛋白的單體，也包含二聚體。上述接頭片段區(qū)域中存在3個cys殘基(seqidno:3所示的氨基酸序列第184位、第190位和第193位的cys)，通過二硫鍵可以形成二聚體。通常，2個fc融合蛋白單體會通過上述3個cys在相同位置的cys之間相互形成3個二硫鍵來形成二聚體。上述3個二硫鍵使得二聚體變得穩(wěn)定，對于低ph值、熱具有較高的穩(wěn)定性。對低ph值、熱的穩(wěn)定性高，例如是指在低ph值條件下、加熱下很少形成聚集體。例如，在低ph值處理或加熱處理后，可以通過利用凝膠過濾層析測定聚集體的含量來確認(rèn)。例如，即使將本發(fā)明的fc融合蛋白在2～8℃、優(yōu)選4℃的低溫下；在ph值1～5、優(yōu)選ph值2～4下保存1天～1個月、優(yōu)選1天～14天、更優(yōu)選5～12天，或者在25～45℃、優(yōu)選30～40℃下保存1天～1個月、優(yōu)選1天～14天、更優(yōu)選1天～7天，聚集體含有率變化也很少。例如，當(dāng)根據(jù)凝膠過濾層析的峰面積計算本發(fā)明蛋白的聚集體含有率變化時，為10％以下，優(yōu)選8％以下。另外，作為接頭片段，與具有含有2個以下cys的接頭片段的fc融合蛋白相比，本發(fā)明蛋白的聚集體含有率變化較小。

本發(fā)明的蛋白，例如可以按照以下方法或者以其為基準(zhǔn)的方法、或文獻(xiàn)中記載的方法或者以其為基準(zhǔn)的方法制造。

本發(fā)明的蛋白可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基因重組技術(shù)來制造。例如，制備編碼本發(fā)明蛋白的dna，構(gòu)建含有該dna的表達(dá)載體。然后，可以使用所述載體對原核或真核細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，從獲得的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中分離或純化出目的蛋白。

本發(fā)明的蛋白可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的蛋白表達(dá)細(xì)胞制造。例如，在將編碼seqidno:3的氨基酸序列的cdna轉(zhuǎn)入到哺乳類表達(dá)質(zhì)粒載體中制備蛋白表達(dá)質(zhì)粒后，導(dǎo)入到中國倉鼠卵巢細(xì)胞(cho)等動物細(xì)胞中，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。培養(yǎng)該細(xì)胞，可以從培養(yǎng)上清液中獲得本發(fā)明的蛋白。

根據(jù)需要，本發(fā)明的蛋白可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的分離和純化方法來分離和純化。例如，作為分離和純化方法，列舉有：親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、混合模式層析、透析、分步沉積法、電泳等。也可以將這些方法適當(dāng)組合，來分離或純化本發(fā)明的蛋白。

本發(fā)明的蛋白也可以進(jìn)行本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的化學(xué)修飾。例如，化學(xué)修飾可以列舉：糖基化、聚乙二醇(peg)化、乙酰化、酰胺化等。

本發(fā)明的蛋白由于具有針對ige的優(yōu)異中和活性，因此可以用作由ige介導(dǎo)的各種疾病的預(yù)防或治療藥。例如，本發(fā)明的蛋白能夠用作與支氣管哮喘、嗜酸性粒細(xì)胞性中耳炎、嗜酸性粒細(xì)胞性鼻竇炎、過敏性結(jié)膜炎、過敏性鼻炎、花粉癥、食物過敏、蜱過敏疾病、蕁麻疹、過敏性休克等i型過敏相關(guān)的疾病等的預(yù)防或治療藥。

本發(fā)明的蛋白具有針對ige的優(yōu)異親和力。因此，像抗體藥物偶聯(lián)物(adc)那樣，本發(fā)明的蛋白也可以作為利用了該親和力的“蛋白藥物偶聯(lián)物”而使用。例如，列舉有“蛋白1-藥物”、“蛋白1-接頭-藥物”等使用方式。作為藥物可以使用抗過敏劑等，偶聯(lián)物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制造。

根據(jù)用法，本發(fā)明的藥物組合物使用各種劑型的組合物。例如，作為口服劑，列舉有：片劑、散劑、顆粒劑、細(xì)粒劑、膠囊劑等。作為非口服劑，可列舉：注射劑、吸入粉末劑、吸入液劑、滴眼劑、液劑、洗劑、噴霧劑、滴鼻劑、點(diǎn)滴劑、軟膏劑、栓劑、貼劑等。

根據(jù)用法，本發(fā)明的藥物組合物使用各種給藥方法。例如，列舉有：經(jīng)口給藥、靜脈內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、皮下給藥、局部給藥、肌肉內(nèi)給藥等。

本發(fā)明的藥物組合物使用本發(fā)明的蛋白和至少一種藥物添加劑來制備。根據(jù)其劑型，本發(fā)明的藥物組合物可以通過制劑學(xué)的公知方法來制備。例如，作為藥物添加劑，列舉有：賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、稀釋劑、緩沖劑、等張化劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、助溶劑等藥物添加劑。所述藥物添加劑中也含有生理鹽水、注射用水等。本發(fā)明的藥物組合物可以通過與所述藥物添加劑混合、稀釋或溶解來制備。

當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物用于預(yù)防或治療時，其有效成分即本發(fā)明蛋白的給藥量要根據(jù)患者的年齡、性別、體重、疾病程度、劑型、給藥途徑等適當(dāng)確定。對于成人的給藥量，在經(jīng)口給藥的情況下，例如可在0.1μg/kg～1000mg/kg/天的范圍內(nèi)確定。根據(jù)劑型，經(jīng)口給藥的1天給藥量優(yōu)選為0.1mg/kg～10mg/kg/天的范圍。也可以將1天給藥量分為1次、2次或3次給藥。另外，對于成人的給藥量，在非經(jīng)口給藥的情況下，也可以在0.01μg/kg～1000mg/kg/天的范圍內(nèi)確定。根據(jù)劑型，非經(jīng)口給藥的1天給藥量優(yōu)選為0.1μg/kg～10μg/kg/天、1μg/kg～100μg/kg/天、或10μg/kg～1000μg/kg/天的范圍。

實施例

下面通過以下實施例和試驗例對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行更加詳細(xì)的說明。但是，本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。

實施例1

蛋白1的表達(dá)及制備

(1)蛋白1表達(dá)載體的制備

將編碼seqidno:3的氨基酸序列的cdna轉(zhuǎn)入到哺乳類表達(dá)質(zhì)粒載體中，制備蛋白1表達(dá)質(zhì)粒。

(2)蛋白1表達(dá)細(xì)胞的制備

將蛋白1表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到中國倉鼠卵巢細(xì)胞(cho)中，建立蛋白1的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。通過sds-page確認(rèn)蛋白1在培養(yǎng)上清液中的分泌。

試驗例1

ige結(jié)合抑制活性(ige中和活性)

(1)酶聯(lián)板的制備

將蛋白1溶解在包被緩沖液中，并向微孔板中添加一定量。在4℃下放置18小時以上后，用洗滌緩沖液(pbs-tween20)洗滌，添加封閉液(assaydiluent)(bd生物科學(xué)公司)。在室溫下放置1小時后除去封閉液，用洗滌緩沖液洗滌，以用于結(jié)合抑制活性測定。

(2)結(jié)合抑制活性的測定方法

用奧馬珠單抗(抗人ige抗體)作為陽性對照，通過以下方法測定蛋白1的ige結(jié)合抑制活性。

將一定量的人ige(antibodyshop公司)與任意濃度的蛋白1或奧馬珠單抗(諾華公司)混合，添加到上述(1)中制備的孔板上，在室溫下放置約2小時。棄去混合液后，用洗滌緩沖液洗滌，添加hrp標(biāo)記抗人ige抗體(bd生物科學(xué)公司)，在室溫下放置約1小時。棄去抗體液后，用洗滌緩沖液洗滌。添加tmb(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺)溶液，在一定時間后加入磷酸使顯色反應(yīng)停止。之后，用讀板儀測定吸光度(od450)。根據(jù)與固定在孔板上的蛋白1結(jié)合的ige量，對蛋白1和奧馬珠單抗的ige結(jié)合抑制活性(ige中和活性)進(jìn)行評價(圖1)。

(3)結(jié)果

本發(fā)明的蛋白1濃度依賴性地抑制ige與fcer1a的結(jié)合。

試驗例2

低ph值下的穩(wěn)定性試驗

(1)樣本的制備

純化操作使用aktaexplorer10s(gehealthcare公司)來實施。通過與實施例1中記載的方法相同的方法來表達(dá)蛋白1，將其培養(yǎng)上清液用d-pbs(-)(dulbecco’s磷酸緩沖鹽溶液)進(jìn)行2倍稀釋，加載到hitraprproteinaff(gehealthcare公司，17-5079-01)。用d-pbs(-)洗滌所述層析柱后，用100mm甘氨酸-鹽酸緩沖液(ph值2.2)洗脫，以1.0ml/管的量分離蛋白a吸附級分。將峰級分混合，作為低ph值處理樣本(ph值2.9)。將所述低ph值處理樣本在4℃下保存，將這種樣本作為評價用樣本。在規(guī)定時間內(nèi)(自4℃保存起5天～12天后)從評價用樣本中取樣0.25ml，加入0.05ml的1mtris-hcl緩沖液(ph值9.0)進(jìn)行中和，獲得中和處理樣本。

作為比較對照，使用非專利文獻(xiàn)3中記載的融合蛋白a。通過與實施例1相同的方法表達(dá)融合蛋白a，通過與上述方法相同的方法獲得中和處理樣本。需要說明的是，本試驗所使用的融合蛋白a是以下seqidno:4的氨基酸序列所示的蛋白。seqidno:4的氨基酸序列包含由從第180位的asp至第188位的cys組成的接頭片段，該接頭片段中所包含的cys的數(shù)量為2個。

seqidno:4：

vpqkpkvslnppwnrifkgenvtltcngnnffevsstkwfhngslseetnsslnivnakfedsgeykcqhqqvnesepvylevfsdwlllqasaevvmegqplflrchgwrnwdvykviyykdgealkywyenhnisitnatvedsgtyyctgkvwqldyeseplnitvikaprekywldkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

(2)聚集體含量的分析方法

聚集體的分析操作使用aktaexplorer10s(gehealthcare公司)，通過使用流動相為d-pbs(-)的superdex20010/300gl(gehealthcare公司，17-5175-01)進(jìn)行凝膠過濾層析來確認(rèn)。計算出洗脫位置為單體的峰面積，以及在高分子區(qū)域洗脫的聚集體峰面積，對蛋白1和融合蛋白a在低ph值處理的聚集體含有率變化(％)推移進(jìn)行評價(圖2)。

(3)結(jié)果

本發(fā)明的蛋白與融合蛋白a相比，隨著低ph值處理時間延長形成聚集體的增加量大幅減少，表現(xiàn)出暴露在低ph值下的高穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明的蛋白在低ph值下穩(wěn)定性優(yōu)異，可以期待在制造工序中提高純化效率和產(chǎn)率。

試驗例3

對熱的穩(wěn)定性試驗

(1)樣本的制備

純化操作使用aktaexplorer10s(gehealthcare公司)來實施。通過與實施例1中記載的方法相同的方法來表達(dá)蛋白1，將其培養(yǎng)上清液加載在hitrapmabselectsure(gehealthcare公司，17-0034-94)。用d-pbs(-)和100mm檸檬酸緩沖液(ph值4.0)洗滌所述層析柱后，用100mm甘氨酸-鹽酸緩沖液(ph值3.3)洗脫蛋白a吸附物。在回收的級分中加入1/10容量的1mtris-hcl緩沖液(ph值9.0)進(jìn)行中和，獲得蛋白a純化蛋白。將該蛋白a純化蛋白用1n的hcl調(diào)整為ph值4.0，加載到填充有疏水相互作用陽離子交換的混合模式樹脂的層析柱。用50mm醋酸緩沖液(ph值4.0)洗滌非吸附蛋白后，進(jìn)行50mmtris-hcl緩沖液(ph值9.0)的100％線性梯度洗脫，回收峰級分，獲得純化蛋白。對于獲得的蛋白，使用流動相為d-pbs(-)的hiload16/60superdex200prepgrade(gehealthcare公司，17-1069-01)進(jìn)行凝膠過濾分離?；厥障喈?dāng)于單體的峰級分，獲得凝膠過濾純化樣本。使用d-pbs(-)再次制備該凝膠過濾純化樣本并分注到微型管中，將在37℃下溫育的樣本作為評價用樣本。在規(guī)定時間內(nèi)(自37℃保存起1天～7天后)從評價用樣本中進(jìn)行取樣，獲得熱處理樣本。

作為比較對照，使用非專利文獻(xiàn)3中記載的融合蛋白a。通過與實施例1相同的方法表達(dá)融合蛋白a，通過與上述方法相同的方法獲得熱處理樣本。需要說明的是，試驗所使用的融合蛋白a是與試驗例2所使用的蛋白為相同的氨基酸序列的蛋白。

(2)聚集體含有量的分析方法

聚集體的分析操作使用aktaexplorer10s(gehealthcare公司)，通過使用流動相為d-pbs(-)的superdex20010/300gl(gehealthcare公司，17-5175-01)進(jìn)行凝膠過濾層析來確認(rèn)。計算出洗脫位置為單體的峰面積，以及在高分子區(qū)域洗脫的聚集體峰面積，對蛋白1和融合蛋白a在熱處理下的聚集體含有率變化(％)推移進(jìn)行評價(圖3)。

(3)結(jié)果

本發(fā)明的蛋白與融合蛋白a相比，在37℃下保存時聚集體含量的增加較少，表現(xiàn)出對暴露在37℃下時更加穩(wěn)定。因此，本發(fā)明的蛋白除了在低ph值下穩(wěn)定性優(yōu)異以外，對熱的穩(wěn)定性也很優(yōu)異，可以期待在制造工序中提高純化效率和生產(chǎn)率。

工業(yè)實用性

本發(fā)明的蛋白由于具有針對ige的優(yōu)異中和活性，因此可以用作由ige介導(dǎo)的各種疾病的預(yù)防或治療用的蛋白藥物。

序列表自由文本

seqidno:2合成

本說明書中所引用的全部刊物、專利以及專利申請通過直接引用而并入本說明書中。

序列表

<110>橘生藥品工業(yè)株式會社

<120>fc融合高親和力ige受體α鏈

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