抗CD70嵌合抗原受體的制作方法

文檔序號(hào)：11284491閱讀：364來源：國知局

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發(fā)明背景

癌癥是公共健康問題。盡管在諸如化療的治療中取得進(jìn)步，但許多癌癥的預(yù)后可能較差，所述癌癥包括腎細(xì)胞癌(rcc)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤。因此，對(duì)癌癥，特別是rcc、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、nhl、cll、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤的其它治療存在未滿足的需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明的實(shí)施方案提供具有針對(duì)cd70的抗原特異性的嵌合抗原受體(car)，所述car包含：抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域，其含有缺乏cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的全部或部分的cd27氨基酸序列，其中所述部分為seqidno:2所限定的至少氨基酸殘基237至260；4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；以及任選地，cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供具有針對(duì)cd70的抗原特異性的car，其包含與seqidno：11-13中任一項(xiàng)至少約90％相同的氨基酸序列。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供與本發(fā)明的car相關(guān)的相關(guān)核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、細(xì)胞群以及藥物組合物。

本發(fā)明另外的實(shí)施方案提供檢測(cè)哺乳動(dòng)物中癌癥的存在的方法以及治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中癌癥的方法。

附圖幾個(gè)視圖的簡要描述

圖1a和1b是顯示施用mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(實(shí)心圓)、未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(空心圓)、磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)(×)或pmel+vi(正方形)并進(jìn)行輻射(500rad)之后一段時(shí)間(天數(shù))內(nèi)，b16/mcd70-(a)或b16-(b)荷瘤小鼠的腫瘤大小(mm²)的圖。

圖1c和1d是顯示在施用每只小鼠1×10⁵(實(shí)心正方形)、或1×10⁷(實(shí)心圓)個(gè)細(xì)胞的劑量的mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞；pbs(空心正方形)；轉(zhuǎn)導(dǎo)有空載體的細(xì)胞(空心圓)；或者pmel+vi(菱形)，進(jìn)行(c)或不進(jìn)行(d)輻射(500rad)之后一段時(shí)間(天數(shù))內(nèi)，b16/mcd70荷瘤小鼠的腫瘤大小(mm²)的圖。

圖1e是顯示在施用每只小鼠1×10⁴(菱形)、或1×10⁷(實(shí)心圓)個(gè)細(xì)胞的劑量的mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞；pbs(空心正方形)；轉(zhuǎn)導(dǎo)有空載體的細(xì)胞(空心圓)；或者pmel+vi(△)，隨后進(jìn)行輻射(500rad)之后一段時(shí)間(天數(shù))內(nèi)，b16/mcd70荷瘤小鼠的存活(％)的圖。

圖1f是顯示在施用mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(正方形)、未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(△)、轉(zhuǎn)導(dǎo)有空載體的細(xì)胞或者pmel+vi(環(huán))，隨后進(jìn)行輻射并施用il-2之后一段時(shí)間(天數(shù))內(nèi)，b16/mcd70荷瘤小鼠的腫瘤大小(mm²)的圖。

圖2a-2d是顯示在施用mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(實(shí)心圓)、未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(空心正方形)、磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)或pmel+vi(△)，進(jìn)行(a和c)或不進(jìn)行(b和d)輻射(500rad)之后一段時(shí)間(天數(shù))內(nèi)，b16/mcd70-(a和b)或b16-(c和d)荷瘤小鼠的平均體重(g)的圖。

圖2e-2h是顯示在施用mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(交叉線柱)、未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(無陰影柱)或者轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼綠色熒光蛋白(gfp)的載體的細(xì)胞(斜紋柱)，進(jìn)行(e和g)或不進(jìn)行(f和h)輻射(500rad)之后一段時(shí)間(天數(shù))內(nèi)，b16/mcd70荷瘤小鼠的絕對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(k/μl)(e和f)或脾細(xì)胞計(jì)數(shù)(x10⁷/脾)(g和h)的圖。

圖2i是顯示在施用mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，進(jìn)行(黑柱)或不進(jìn)行(橫紋柱)輻射；或者施用轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼gfp的載體，進(jìn)行(方格柱)或不進(jìn)行(無陰影柱)輻射(500rad)之后一段時(shí)間(天數(shù))內(nèi)，b16/mcd70荷瘤小鼠的血清干擾素(ifn)γ(pg/ml)水平的圖。

圖3是顯示在單獨(dú)培養(yǎng)(培養(yǎng)基)轉(zhuǎn)導(dǎo)有空的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(對(duì)照)(msgv1)或者fcd27-cd3ζ(seqidno:7)、δcd27-cd28–cd3ζ(seqidno:8)、δcd27-4-1bb–cd3ζ(seqidno:9)、δcd27-cd28–4-1bb–cd3ζ(seqidno:10)、fcd27-cd28–cd3ζ(seqidno:11)、fcd27-4-1bb–cd3ζ(seqidno:12)或fcd27-cd28–4-1bb–cd3ζ(seqidno:13)之一的人t細(xì)胞時(shí)(豎紋柱)；或者在與對(duì)照靶細(xì)胞624mel(方格柱)、624/cd70(黑柱)、938mel(點(diǎn)狀柱)或938/cd70(白柱)、或rcc靶細(xì)胞rcc2245r(正斜杠柱)、rcc2246r(反斜杠柱)、rcc2361r(有橫紋的柱)或者rcc1764(人字紋柱)共培養(yǎng)時(shí)，分泌的ifn-γ(pg/ml)的圖。

圖4是顯示在單獨(dú)培養(yǎng)(培養(yǎng)基)未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(ut)細(xì)胞或者轉(zhuǎn)導(dǎo)有δcd27-4-1bb–cd3ζ(seqidno:9)的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝克隆a2、a10、b3、c1、e3或g2(豎紋柱)時(shí)；或者在與對(duì)照靶細(xì)胞snu1079(點(diǎn)狀柱)、snu1196(白柱)、938mel(方格柱)或938/cd70(黑柱)、或rcc靶細(xì)胞rcc2245r(正斜杠柱)、rcc2246r(反斜杠柱)、rcc2361r(有橫紋的柱)或者rcc1764(人字紋柱)共培養(yǎng)時(shí)，分泌的ifn-γ(pg/ml)的圖。

圖5是顯示在單獨(dú)培養(yǎng)(培養(yǎng)基)未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(ut)細(xì)胞或者轉(zhuǎn)導(dǎo)有δcd27-4-1bb–cd3ζ(seqidno:9)的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝克隆a2、b11、c5或d2(豎紋柱)時(shí)；或者與對(duì)照靶細(xì)胞snu1079(點(diǎn)狀柱)、snu1196(白柱)、938mel(方格柱)或938/cd70(黑柱)、或rcc靶細(xì)胞rcc2245r(正斜杠柱)、rcc2246r(反斜杠柱)、rcc2361r(有橫紋的柱)或者rcc1764(人字紋柱)共培養(yǎng)時(shí)，分泌的ifn-γ(pg/ml)的圖。

發(fā)明詳述

car是人工構(gòu)建的雜合蛋白或多肽，其含有與t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域相連的受體(例如，腫瘤壞死因子(tnf)受體)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。car的特征包括它們利用受體的抗原結(jié)合特性，使t細(xì)胞的特異性和反應(yīng)性以不限于主要組織相容性復(fù)合體(mhc)的方式重定向至選定靶標(biāo)的能力。不限于mhc的抗原識(shí)別賦予表達(dá)car的t細(xì)胞不依賴于抗原加工而識(shí)別抗原的能力，從而繞過腫瘤逃逸的主要機(jī)制。此外，當(dāng)在t細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，car有利地不與內(nèi)源t細(xì)胞受體(tcr)α和β鏈二聚化。

本文使用的短語“具有抗原特異性”和“引發(fā)抗原特異性應(yīng)答”意為，car能夠特異性結(jié)合并免疫識(shí)別抗原，以使car與抗原的結(jié)合引發(fā)免疫應(yīng)答。

本發(fā)明的car具有針對(duì)cd70的抗原特異性。cd70屬于tnf超家族，并具有seqidno:1的氨基酸序列。當(dāng)cd70與其受體cd27相互作用時(shí)，其是參與淋巴來源的細(xì)胞的增殖和存活的共刺激分子。cd70的正常、非癌表達(dá)限于淋巴組織，如激活的t細(xì)胞、b細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(nk)、單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞。cd70在多種人類癌癥中表達(dá)，如例如rcc(diegmann等人，eur.j.cancer,41:1794-801(2005))(例如透明細(xì)胞rcc(ccrcc))、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(held-feindt等人，int.j.cancer,98:352-56(2002)；wischhusen等人，cancerres.,62:2592-99(2002))、nhl和cll(lens等人，br.j.haematol.,106:491-503(1999))、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤以及濾泡性淋巴瘤。

不受特定理論或機(jī)制的束縛，據(jù)信通過引發(fā)針對(duì)cd70的抗原特異性應(yīng)答，本發(fā)明的car提供任何下述的一種或多種：靶向并破壞表達(dá)cd70的癌細(xì)胞，減少或清除癌細(xì)胞，促進(jìn)免疫細(xì)胞至腫瘤部位的浸潤，以及增強(qiáng)/擴(kuò)展抗癌應(yīng)答。由于正常的cd70表達(dá)限于諸如激活的t細(xì)胞、b細(xì)胞、nk細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞的淋巴組織，考慮本發(fā)明的car有利地大幅避免了靶向/破壞多種正常組織。

本發(fā)明的實(shí)施方案提供了car，其包含含有cd27氨基酸序列的抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域。就這點(diǎn)而言，car可以既包含cd27抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域又包含cd27跨膜結(jié)構(gòu)域。cd27可以包含任何合適的人抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域cd27氨基酸序列或者由其組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的全長cd27具有seqidno:2的氨基酸序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，cd27的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域由seqidno:2的氨基酸殘基1-188組成，并具有seqidno:21的氨基酸序列，cd27的跨膜結(jié)構(gòu)域由seqidno:2的氨基酸殘基189-211組成，并具有seqidno:22的氨基酸序列，以及cd27的胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域由seqidno:2的氨基酸殘基212-260組成，并具有seqidno:23的氨基酸序列。因此，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含含有seqidno:21和22的氨基酸序列的抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域。cd27的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合cd70。

本發(fā)明的實(shí)施方案提供包含抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域的car，所述抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域包含缺乏cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的全部或部分的cd27氨基酸序列，其中car缺乏的所述部分為seqidno:2所限定的至少連續(xù)氨基酸殘基237至260，至少連續(xù)氨基酸殘基236至260，至少連續(xù)氨基酸殘基235至260，至少連續(xù)氨基酸殘基234至260，至少連續(xù)氨基酸殘基233至260，至少連續(xù)氨基酸殘基232至260，至少連續(xù)氨基酸殘基231至260，至少連續(xù)氨基酸殘基230至260，至少連續(xù)氨基酸殘基229至260，至少連續(xù)氨基酸殘基228至260，至少連續(xù)氨基酸殘基227至260，至少連續(xù)氨基酸殘基226至260，至少連續(xù)氨基酸殘基225至260，至少連續(xù)氨基酸殘基224至260，至少連續(xù)氨基酸殘基223至260，至少連續(xù)氨基酸殘基222至260，至少連續(xù)氨基酸殘基221至260，至少連續(xù)氨基酸殘基220至260，至少連續(xù)氨基酸殘基219至260，至少連續(xù)氨基酸殘基218至260，至少連續(xù)氨基酸殘基217至260，至少連續(xù)氨基酸殘基216至260，至少連續(xù)氨基酸殘基215至260，至少連續(xù)氨基酸殘基214至260或者至少連續(xù)氨基酸殘基213至260。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域包含缺乏seqidno:2的連續(xù)氨基酸殘基237至260，連續(xù)氨基酸殘基236至260，連續(xù)氨基酸殘基235至260，連續(xù)氨基酸殘基234至260，連續(xù)氨基酸殘基233至260，連續(xù)氨基酸殘基232至260，連續(xù)氨基酸殘基231至260，連續(xù)氨基酸殘基230至260，連續(xù)氨基酸殘基229至260，連續(xù)氨基酸殘基228至260，連續(xù)氨基酸殘基227至260，連續(xù)氨基酸殘基226至260，連續(xù)氨基酸殘基225至260，連續(xù)氨基酸殘基224至260，連續(xù)氨基酸殘基223至260，連續(xù)氨基酸殘基222至260，連續(xù)氨基酸殘基221至260，連續(xù)氨基酸殘基220至260，連續(xù)氨基酸殘基219至260，連續(xù)氨基酸殘基218至260，連續(xù)氨基酸殘基217至260，連續(xù)氨基酸殘基216至260，連續(xù)氨基酸殘基215至260，連續(xù)氨基酸殘基214至260或者連續(xù)氨基酸殘基213至260的cd27氨基酸序列。缺乏cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的全部或部分的cd27氨基酸序列在本文也被稱為“截短的cd27氨基酸序列”或“截短的cd27”。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域包含缺乏cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的全部的cd27氨基酸序列。就這點(diǎn)而言，抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域包含缺乏seqidno:2所限定的連續(xù)氨基酸殘基212至260的cd27氨基酸序列或者缺乏seqidno:2的連續(xù)氨基酸殘基212至260的cd27氨基酸序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域包含缺乏seqidno:23的氨基酸序列的cd27氨基酸序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，包含缺乏cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的全部的cd27氨基酸序列的抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域，包含與seqidno:3至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列或者由與seqidno:3至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成，或者包含seqidno:3的氨基酸序列或由seqidno:3的氨基酸序列組成。

car還可以包含4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；以及任選地，cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，car包含4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選實(shí)施方案中，4-1bb、cd3ζ和cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是人的。cd28是t細(xì)胞共刺激中重要的t細(xì)胞標(biāo)志物。4-1bb也被稱為cd137，其向t細(xì)胞傳輸強(qiáng)有力的共刺激信號(hào)，促進(jìn)了t淋巴細(xì)胞的分化并增強(qiáng)了t淋巴細(xì)胞的長期存活。cd3ζ與tcr聯(lián)合以產(chǎn)生信號(hào)，并且其包含免疫受體酪氨酸激活基序(itam)。

cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含任何合適的人cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列或者由其組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含與seqidno:4至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列或者由與seqidno:4至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含seqidno:4的氨基酸序列或者由其組成。

4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含任何合適的人4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列或者由其組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含與seqidno:5至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列或者由與seqidno:5至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含seqidno:5的氨基酸序列或者由其組成。

cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含任何合適的人cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列或者由其組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含與seqidno:6至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列或者由與seqidno:6至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含seqidno:6的氨基酸序列或者由其組成。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含與cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組合的全長cd27氨基酸序列(全長(f)cd27-cd3ζcar)，所述全長cd27氨基酸序列含有cd27抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、cd27跨膜結(jié)構(gòu)域和cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。就這點(diǎn)而言，car可以包含與seqidno:2至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的全長cd27氨基酸序列和本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何cd3ζ氨基酸序列，或者由與seqidno:2至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的全長cd27氨基酸序列和本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何cd3ζ氨基酸序列組成。例如，fcd27-cd3ζcar可以包含seqidno:2的全長cd27氨基酸序列和seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列，或者由seqidno:2的全長cd27氨基酸序列組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，fcd27-cd3ζcar可以包含與seqidno:7至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列或者由與seqidno:7至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，fcd27-cd3ζcar包含seqidno:7的氨基酸序列或者由其組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，fcd27-cd3ζcar缺乏截短的cd19和dsred之一或兩者。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含與cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組合的全長cd27氨基酸序列(fcd27-cd28-cd3ζ)，所述全長cd27氨基酸序列含有cd27抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、cd27跨膜結(jié)構(gòu)域和cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。就這點(diǎn)而言，car可以包含本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何全長cd27氨基酸序列、任何cd3ζ氨基酸序列和任何cd28氨基酸序列，或者由本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何全長cd27氨基酸序列、任何cd3ζ氨基酸序列和任何cd28氨基酸序列組成。例如，fcd27-cd28-cd3ζcar可以包含seqidno:2的全長cd27氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列和seqidno:6的cd28氨基酸序列，或者由seqidno:2的全長cd27氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列和seqidno:6的cd28氨基酸序列組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，fcd27-cd28-cd3ζcar可以包含與seqidno:11至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列，或者由與seqidno:11至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，fcd27-cd28-cd3ζcar包含seqidno:11的氨基酸序列或者由其組成。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含與cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組合的全長cd27氨基酸序列(fcd27-4-1bb-cd3ζ)，所述全長cd27氨基酸序列含有cd27抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、cd27跨膜結(jié)構(gòu)域和cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。就這點(diǎn)而言，car可以包含本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何全長cd27氨基酸序列、任何cd3ζ氨基酸序列和任何4-1bb氨基酸序列，或者由本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何全長cd27氨基酸序列、任何cd3ζ氨基酸序列和任何4-1bb氨基酸序列組成。例如，fcd27-4-1bb-cd3ζcar可以包含seqidno:2的全長cd27氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列和seqidno:5的4-1bb氨基酸序列，或者由seqidno:2的全長cd27氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列和seqidno:5的4-1bb氨基酸序列組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，fcd27-4-1bb-cd3ζcar可以包含與seqidno:12至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列，或者由與seqidno:12至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，fcd27-4-1bb-cd3ζcar包含seqidno:12的氨基酸序列或者由其組成。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含與cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和cd28胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組合的全長cd27氨基酸序列(fcd27-cd28-4-1bb-cd3ζ)，所述全長cd27氨基酸序列含有cd27抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、cd27跨膜結(jié)構(gòu)域和cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。就這點(diǎn)而言，car可以包含本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何全長cd27氨基酸序列、任何cd3ζ氨基酸序列、任何4-1bb氨基酸序列以及任何cd28氨基酸序列，或者由本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何全長cd27氨基酸序列、任何cd3ζ氨基酸序列、任何4-1bb氨基酸序列以及任何cd28氨基酸序列組成。例如，fcd27-cd28-4-1bb-cd3ζcar可以包含seqidno:2的全長cd27氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列、seqidno:5的4-1bb氨基酸序列和seqidno:6的cd28氨基酸序列，或者由seqidno:2的全長cd27氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列、seqidno:5的4-1bb氨基酸序列和seqidno:6的cd28氨基酸序列組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，fcd27-cd28-4-1bb-cd3ζcar可以包含與seqidno:13至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列，或者由與seqidno:13至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，fcd27-cd28-4-1bb-cd3ζcar包含seqidno:13的氨基酸序列或者由其組成。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含與小鼠cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組合的全長小鼠cd27氨基酸序列(mcd27-cd3ζ)，所述全長小鼠cd27氨基酸序列含有cd27抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、cd27跨膜結(jié)構(gòu)域和cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。就這點(diǎn)而言，car可以包含與小鼠cd3ζ氨基酸序列組合的全長小鼠cd27氨基酸序列，或者由與小鼠cd3ζ氨基酸序列組合的全長小鼠cd27氨基酸序列組成，所述全長小鼠cd27氨基酸序列與seqidno:26至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同，所述小鼠cd3ζ氨基酸序列與seqidno:27至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同。例如，mcd27-cd3ζcar可以包含seqidno:26的全長小鼠cd27氨基酸序列和seqidno:27的小鼠cd3ζ氨基酸序列，或者由seqidno:26的全長小鼠cd27氨基酸序列和seqidno:27的小鼠cd3ζ氨基酸序列組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，mcd27-cd3ζcar可以包含與seqidno:25至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列，或者由與seqidno:25至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，mcd27-cd3ζcar包含seqidno:25的氨基酸序列或者由其組成。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含與cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組合的，包含截短的cd27氨基酸序列的抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域(截短的(δ)cd27-cd28–cd3ζ)，所述截短的cd27氨基酸序列缺乏cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的全部。就這點(diǎn)而言，car可以包含與本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列和任何cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列組合的截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，或者由與本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列和任何cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列組合的截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列組成，所述截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與seqidno:3至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同。例如，δcd27-cd28–cd3ζcar可以包含，seqidno:3的截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列和seqidno:6的cd28氨基酸序列，或者由seqidno:3的截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列和seqidno:6的cd28氨基酸序列組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，δcd27-cd28–cd3ζcar可以包含與seqidno:8至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列，或者由與seqidno:8至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，δcd27-cd28–cd3ζcar包含seqidno:8的氨基酸序列或者由其組成。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含與cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組合的，包含截短的cd27氨基酸序列的抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域(δcd27-4-1bb–cd3ζ)，所述截短的cd27氨基酸序列缺乏cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的全部。就這點(diǎn)而言，car可以包含本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、任何cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列和任何4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，或者由本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、任何cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列和任何4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列組成。例如，δcd27-4-1bb–cd3ζcar可以包含seqidno:3的截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列和seqidno:5的4-1bb氨基酸序列，或者由seqidno:3的截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列和seqidno:5的4-1bb氨基酸序列組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，δcd27-4-1bb–cd3ζcar可以包含與seqidno:9至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列，或者由與seqidno:9至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，δcd27-4-1bb–cd3ζcar包含seqidno:9的氨基酸序列或者由其組成。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含與cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組合的，包含截短的cd27氨基酸序列的抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域(δcd27-cd28–4-1bb–cd3ζ)，所述截短的cd27氨基酸序列缺乏cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的全部。就這點(diǎn)而言，car可以包含本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、任何cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、任何cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列以及任何4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，或者由本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、任何cd3ζ胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、任何cd28胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列以及任何4-1bb胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列組成。例如，δcd27-cd28–4-1bb–cd3ζcar可以包含seqidno:3的截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列、seqidno:6的cd28氨基酸序列以及seqidno:5的4-1bb氨基酸序列，或者由seqidno:3的截短的cd27抗原結(jié)合-跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸序列、seqidno:4的cd3ζ氨基酸序列、seqidno:6的cd28氨基酸序列以及seqidno:5的4-1bb氨基酸序列組成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，δcd27-cd28–4-1bb–cd3ζcar可以包含與seqidno:10至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列，或者由與seqidno:10至少約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，δcd27-cd28–4-1bb–cd3ζcar包含seqidno:10的氨基酸序列或者由其組成。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含與seqidno:8-10中任一項(xiàng)至少約90％相同的氨基酸序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car包含與seqidno:9或10至少約90％相同的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，car包含與seqidno:11-13中任一項(xiàng)至少約90％相同的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，car包含與seqidno:12或13至少約90％相同的氨基酸序列。優(yōu)選地，car包含表1a所示的任一氨基酸序列，由表1a所示的任一氨基酸序列組成，或者基本由表1a所示的任一氨基酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，car包含seqidno:7-13中任一項(xiàng)的氨基酸序列。優(yōu)選地，car包含seqidno:9、10、12和13中任一項(xiàng)的氨基酸序列。

表1a

本發(fā)明的范圍包括本文所述的本發(fā)明的car的功能部分。當(dāng)提及car使用時(shí)，術(shù)語“功能部分”指本發(fā)明的car的任何部分或片段，所述部分或片段保留所述部分或片段所來源的car(親本car)的生物活性。功能部分涵蓋，例如保留與親本car相似程度、相同程度或者比親本car更高程度地識(shí)別靶細(xì)胞或者檢測(cè)、治療或預(yù)防癌癥的能力的car的那些部分。提及親本car，功能部分可以包含例如親本car的約10％、約25％、約30％、約50％、約68％、約80％、約90％、約95％或更多。

功能部分在所述部分的氨基端或羧基端或這兩端可以包含其它氨基酸，所述其它氨基酸在親本car的氨基酸序列中不存在。可取地，所述其它氨基酸不干擾功能部分諸如識(shí)別靶細(xì)胞、檢測(cè)癌癥、治療或預(yù)防癌癥等的生物功能。更可取地，與親本car的生物活性相比，所述其它氨基酸增強(qiáng)了生物活性。

本發(fā)明的范圍包括本文所述的本發(fā)明的car的功能變體。本文使用的術(shù)語“功能變體”指與親本car具有大量的或顯著的序列同一性或相似性的car、多肽或蛋白，所述功能變體保留了該變體所來源的car的生物活性。功能變體涵蓋，例如保留與親本car相似程度、相同程度或比親本car更高程度地識(shí)別靶細(xì)胞的能力的本文所述car(親本car)的那些變體。提及親本car，功能變體可以，例如與親本car在氨基酸序列方面至少約30％、約50％、約75％、約80％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％相同或者更加相同。

功能變體可以，例如包含具有至少一個(gè)保守氨基酸置換的親本car的氨基酸序列?？蛇x地或另外，功能變體可以包含具有至少一個(gè)非保守氨基酸置換的親本car的氨基酸序列。在這種情況下，非保守氨基酸置換優(yōu)選不干擾或抑制功能變體的生物活性。非保守氨基酸置換可以增強(qiáng)功能變體的生物活性，以使與親本car相比，功能變體的生物活性增加。

本發(fā)明的car的氨基酸置換優(yōu)選保守氨基酸置換。保守氨基酸置換在本領(lǐng)域是已知的，并且包含這樣的氨基酸置換，其中具有某些物理和/或化學(xué)特性的一個(gè)氨基酸被換成具有相同或相似化學(xué)或物理特性的另一氨基酸。例如，保守氨基酸置換可以是酸性/帶負(fù)電荷的極性氨基酸被另一酸性/帶負(fù)電荷的極性氨基酸(例如asp或glu)置換，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸被另一具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如ala、gly、val、ile、leu、met、phe、pro、trp、cys、val等)置換，堿性/帶正電荷的極性氨基酸被另一堿性/帶正電荷的極性氨基酸(例如lys、his、arg等)置換，具有極性側(cè)鏈的不帶電荷的氨基酸被另一具有極性側(cè)鏈的不帶電荷的氨基酸(例如asn、gln、ser、thr、tyr等)置換，具有β分支側(cè)鏈的氨基酸被另一具有β分支側(cè)鏈的氨基酸(例如ile、thr和val)置換，具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸被另一具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如his、phe、trp和tyr)置換等。

car可以基本由指定的氨基酸序列或者本文所述的序列組成，以使其它成分(例如其它氨基酸)不實(shí)質(zhì)性改變功能變體的生物活性。

本發(fā)明的實(shí)施方案的car可以是任何長度，即可以包含任何數(shù)目的氨基酸，條件是所述car保留它們的生物活性，例如特異性結(jié)合抗原、檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的癌細(xì)胞或者治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的癌癥等的能力。例如，car的長度可以是約50至約5000個(gè)氨基酸，如50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多個(gè)氨基酸。

本發(fā)明的實(shí)施方案的car可以包含合成的氨基酸代替一個(gè)或多個(gè)天然存在的氨基酸。此類合成的氨基酸在本領(lǐng)域是已知的，并且包括例如，氨基環(huán)己羧酸、正亮氨酸、α-氨基n-癸酸、高絲氨酸、s-乙酰氨甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羥脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基絲氨酸β-羥基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、環(huán)己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸單酰胺、n’-苯甲基-n’-甲基-賴氨酸、n’,n’-二芐基-賴氨酸、6-羥賴氨酸、鳥氨酸、α-氨基環(huán)戊烷羧酸、α-氨基環(huán)己羧酸、α-氨基環(huán)庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸以及α-叔-丁基甘氨酸。

本發(fā)明的實(shí)施方案的car可被糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、n-?；?、經(jīng)例如二硫鍵環(huán)化，或者轉(zhuǎn)變?yōu)樗峒映甥}和/或任選地二聚化或多聚化或綴合。

本發(fā)明的實(shí)施方案的car可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得，如例如從頭合成。另外，可以利用標(biāo)準(zhǔn)重組方法，利用本文所述的核酸重組產(chǎn)生多肽和蛋白。參見，例如green和sambrook,molecularcloning:alaboratorymanual,第4版,coldspringharborpress,coldspringharbor,ny(2012)。可選地，本文所述的car可以通過公司商業(yè)合成，如synpep(dublin,ca)、peptidetechnologiescorp.(gaithersburg,md)以及multiplepeptidesystems(sandiego,ca)。在這方面，本發(fā)明的car可以是合成的、重組的、分離的和/或純化的。

本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了包含編碼本文所述的任何car的核苷酸序列的核酸。本發(fā)明的核酸可以包含編碼本文所述的任何抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和/或胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，核酸包含表1b所示的任一核苷酸序列，或者由表1b所示的任一核苷酸序列組成，或者基本由表1b所示的任一核苷酸序列組成。優(yōu)選地，核酸包含seqidno:14-20中任一項(xiàng)的核苷酸序列。優(yōu)選地，核酸包含seqidno:16、17、19和20中任一項(xiàng)的核苷酸序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，編碼fcd27-cd3ζcar的核苷酸序列不編碼截短的cd19和dsred之一或兩者。

表1b

本文使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意為dna或rna的聚合物，其可以是單鏈或雙鏈，合成的或從天然來源獲得的(例如分離的和/或純化的)，其可以包含天然的、非天然的或改變的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改變的核苷酸間連鍵，如氨基磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵，替代存在于未修飾的寡核苷酸的核苷酸之間的磷酸二酯。在一些實(shí)施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或置換。然而，如本文所討論的，在一些情況下核酸包含一個(gè)或多個(gè)插入、缺失、倒位和/或置換可能是合適的。在一些實(shí)施方案中，核酸可以編碼這樣的其它氨基酸序列：其不影響car的功能，并且其在宿主細(xì)胞表達(dá)核酸時(shí)可能被翻譯或者可能不被翻譯。

本發(fā)明的實(shí)施方案的核酸可以是重組體。本文使用的術(shù)語“重組體”指(i)通過將天然的或合成的核酸區(qū)段與可在活細(xì)胞中復(fù)制的核酸分子連接而在活細(xì)胞外構(gòu)建的分子，或者(ii)由以上(i)中所述的那些分子的復(fù)制而產(chǎn)生的分子。出于本文的目的，復(fù)制可以是體外復(fù)制或體內(nèi)復(fù)制。

重組核酸可以是具有非天然存在的序列或者具有通過序列的兩個(gè)原本分離的區(qū)段的人工組合而制備的序列的一種核酸。該人工組合通常通過化學(xué)合成來完成，或者更通常通過人工操縱分離的核酸區(qū)段來完成，例如通過諸如以上的green和sambrook中所述的那些技術(shù)的基因工程技術(shù)來完成?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的程序，基于化學(xué)合成和/或酶連接反應(yīng)構(gòu)建核酸。參見，例如以上的green和sambrook。例如，可以利用天然存在的核苷酸或者設(shè)計(jì)以增加分子的生物穩(wěn)定性或者增加雜交時(shí)所形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性的不同修飾的核苷酸(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)來化學(xué)合成核酸?？捎糜诋a(chǎn)生核酸的修飾的核苷酸的實(shí)例包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫脲苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-d半乳糖基q核苷(beta-d-galactosylqueosine)、肌酐、n⁶-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n⁶-取代的腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、β-d-甘露糖基q核苷(beta-d-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n⁶-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸(v)、懷丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、q核苷(queosine)、2-巰基胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-n-2-羧丙基)尿嘧啶以及2,6-二氨基嘌呤?？蛇x地，本發(fā)明的核酸中的一種或多種可購自諸如macromolecularresources(fortcollins,co)和synthegen(houston,tx)的公司。

核酸可以包含編碼本文就本發(fā)明其它方面所描述的任何car的任何分離或純化的核苷酸序列。可選地，核苷酸序列可以包含任何序列簡并的核苷酸序列或者簡并序列的組合。

本發(fā)明的實(shí)施方案還提供分離或純化的核酸，其含有與本文所述的任何核酸的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列或者含有在嚴(yán)緊條件下與本文所述的任何核酸的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。

在嚴(yán)緊條件下雜交的核苷酸序列可以在高度嚴(yán)緊條件下雜交?！案叨葒?yán)緊條件”意為核苷酸序列以可檢測(cè)地比非特異性雜交更強(qiáng)的量與靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特異性雜交。高度嚴(yán)緊條件包括將含有準(zhǔn)確互補(bǔ)序列的多核苷酸或者僅含有數(shù)個(gè)分散的錯(cuò)配的多核苷酸與恰巧具有匹配核苷酸序列的數(shù)個(gè)小的區(qū)域(例如3-10個(gè)堿基)的隨機(jī)序列區(qū)分開的條件。此類小的互補(bǔ)區(qū)域比14-17個(gè)或者更多個(gè)堿基的全長互補(bǔ)體更易熔化，并且高度嚴(yán)緊雜交使其易于區(qū)分。相對(duì)高度嚴(yán)緊的條件將包括，例如低鹽和/或高溫條件，如由約0.02-0.1mnacl或等同物，在約50-70℃的溫度下所提供的條件。此類高度嚴(yán)緊條件容忍極少(如果存在)核苷酸序列與模板或靶標(biāo)鏈之間的錯(cuò)配，并且特別適合于檢測(cè)任何本發(fā)明的car的表達(dá)。普遍認(rèn)為通過添加增加量的甲酰胺可以導(dǎo)致更嚴(yán)緊的條件。

本發(fā)明還提供這樣的核酸，其包含與本文所述的任何核酸至少約70％或者更多，例如約80％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％相同的核苷酸序列。

在實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的核酸并入重組表達(dá)載體。就這點(diǎn)而言，本發(fā)明的實(shí)施方案提供包含本發(fā)明的任何核酸的重組表達(dá)載體。出于本文的目的，術(shù)語“重組表達(dá)載體”意為遺傳修飾的寡核苷酸或多核苷酸構(gòu)建體，當(dāng)構(gòu)建體包含編碼mrna、蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，并且在足以使mrna、蛋白、多肽或肽在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的條件下將載體與細(xì)胞接觸時(shí)，其允許由宿主細(xì)胞表達(dá)mrna、蛋白、多肽或肽。本發(fā)明的載體作為整體不是天然存在的。然而，載體的部分可以是天然存在的。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以包含任何類型的核苷酸，包括但不限于dna和rna，其可以是單鏈的或雙鏈的，合成的或者部分由天然來源獲得的，并且其可以含有天然的、非天然的或改變的核苷酸。重組表達(dá)載體可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸間連鍵或者兩種類型的連鍵。優(yōu)選地，非天然存在的或改變的核苷酸或核苷酸間連鍵不妨礙載體的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，包含編碼fcd27-cd3ζcar的核苷酸序列的重組表達(dá)載體不編碼截短的cd19和dsred之一或兩者。

在實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以是任何合適的重組表達(dá)載體，并且可被用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染任何合適的宿主細(xì)胞。合適的載體包括設(shè)計(jì)以用于增殖和擴(kuò)增或者用于表達(dá)或者用于這兩種的那些載體，如質(zhì)粒和病毒。載體可以選自：puc系列(fermentaslifesciences,glenburnie,md)、pbluescript系列(stratagene,lajolla,ca)、pet系列(novagen,madison,wi)、pgex系列(pharmaciabiotech,uppsala,sweden)以及pex系列(clontech,paloalto,ca)。也可使用諸如λgt10、λgt11、λzapii(stratagene)、λembl4和λnm1149的噬菌體載體。植物表達(dá)載體的實(shí)例包括pbi01、pbi101.2、pbi101.3、pbi121和pbin19(clontech)。動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例包括peuk-cl、pmam和pmamneo(clontech)。重組表達(dá)載體可以是病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體。在一些實(shí)施方案中，載體可以是轉(zhuǎn)座子。

在實(shí)施方案中，可以利用例如以上green和sambrook中所述的標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)來制備本發(fā)明的重組表達(dá)載體?？蓪h(huán)狀或線性表達(dá)載體的構(gòu)建體制備為含有在原核或真核宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的復(fù)制系統(tǒng)。復(fù)制系統(tǒng)可以來源于，例如colel、2μ質(zhì)粒、λ、sv40、牛乳頭瘤病毒等。

重組表達(dá)載體可以包含調(diào)控序列，如轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止密碼子，視情況而定并且考慮載體是基于dna的還是基于rna的，其對(duì)于待引入載體的宿主細(xì)胞的類型(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物)具有特異性。重組表達(dá)載體可以包含限制位點(diǎn)以促進(jìn)克隆。

重組表達(dá)載體可以包含允許對(duì)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇的一種或多種標(biāo)志物基因。標(biāo)志物基因包括抗微生物劑抗性(例如對(duì)抗生素、重金屬等的抗性)，在營養(yǎng)缺陷型宿主中互補(bǔ)以提供原營養(yǎng)等。用于本發(fā)明的表達(dá)載體的合適的標(biāo)志物基因包括，例如新霉素/g418抗性基因、潮霉素抗性基因、組氨醇抗性基因、四環(huán)素抗性基因以及氨芐西林抗性基因。

重組表達(dá)載體可以包含與以下序列可操作地連接的天然或非天然的啟動(dòng)子：編碼car的核苷酸序列或者與編碼car的核苷酸序列互補(bǔ)或雜交的核苷酸序列。啟動(dòng)子的選擇，例如強(qiáng)、弱、可誘導(dǎo)的、組織特異性的和發(fā)育特異性的，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通技術(shù)內(nèi)。類似地，核苷酸序列與啟動(dòng)子的組合也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)內(nèi)。啟動(dòng)子可以是非病毒啟動(dòng)子或病毒啟動(dòng)子，例如巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子、sv40啟動(dòng)子、rsv啟動(dòng)子或鼠干細(xì)胞病毒的長末端重復(fù)中存在的啟動(dòng)子。

可將本發(fā)明的重組表達(dá)載體設(shè)計(jì)為瞬時(shí)表達(dá)、穩(wěn)定表達(dá)或者設(shè)計(jì)為這兩種。另外，可將重組表達(dá)載體制備為組成型表達(dá)或誘導(dǎo)型表達(dá)。

此外，可將重組表達(dá)載體制備為包含自殺基因。本文使用的術(shù)語“自殺基因”指引起表達(dá)自殺基因的細(xì)胞死亡的基因。自殺基因可以是賦予基因在其中表達(dá)的細(xì)胞針對(duì)試劑(例如藥物)的敏感性的基因，并且當(dāng)細(xì)胞與所述試劑接觸或者暴露于所述試劑時(shí)引起細(xì)胞死亡。自殺基因在本領(lǐng)域是已知的，并且包括例如單純皰疹病毒(hsv)胸苷激酶(tk)基因、胞嘧啶脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基還原酶。

本發(fā)明的實(shí)施方案還提供包含本文所述的任何重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”指可以含有本發(fā)明的重組表達(dá)載體的任何類型的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如植物、動(dòng)物、真菌或藻類；或者可以是原核細(xì)胞，例如細(xì)菌或原生動(dòng)物。宿主細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞或原代細(xì)胞，即直接由生物體如人分離到的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞，即懸浮生長的細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域是已知的，并且包括，例如dh5α大腸桿菌細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、猴vero細(xì)胞、cos細(xì)胞、hek293細(xì)胞等。出于擴(kuò)增或復(fù)制重組表達(dá)載體的目的，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如dh5α細(xì)胞。出于產(chǎn)生重組car的目的，宿主細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是人細(xì)胞。盡管宿主細(xì)胞可以是任何類型的細(xì)胞、可以來源于任何類型的組織，并且可以處于任何發(fā)育階段，但是宿主細(xì)胞可以是外周血淋巴細(xì)胞(pbl)或外周血單核細(xì)胞(pbmc)。宿主細(xì)胞可以是t細(xì)胞。

出于本文的目的，t細(xì)胞可以是任何t細(xì)胞，如培養(yǎng)的t細(xì)胞，例如原代t細(xì)胞；或者是來自培養(yǎng)的t細(xì)胞系的t細(xì)胞，例如jurkat、supt1等；或者是獲自哺乳動(dòng)物的t細(xì)胞。如果獲自哺乳動(dòng)物，t細(xì)胞可以獲自多種來源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴結(jié)、胸腺或者其它組織或液體。t細(xì)胞也可以是富集的或純化的。t細(xì)胞可以是人t細(xì)胞。t細(xì)胞可以是分離自人的t細(xì)胞。t細(xì)胞可以是任何類型的t細(xì)胞，并且可以處于任何發(fā)育階段，包括但不限于cd4⁺/cd8⁺雙陽性t細(xì)胞、cd4⁺輔助t細(xì)胞(例如th1和th2細(xì)胞)、cd8⁺t細(xì)胞(例如細(xì)胞毒性t細(xì)胞)、腫瘤浸潤細(xì)胞、記憶t細(xì)胞、初始t細(xì)胞等。t細(xì)胞可以是cd8⁺t細(xì)胞或cd4⁺t細(xì)胞。

本發(fā)明的實(shí)施方案還提供包含至少一種本文所述的宿主細(xì)胞的細(xì)胞群。細(xì)胞群可以是除了至少一種其它細(xì)胞外還包含含有所述任何重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的異質(zhì)群，所述其它細(xì)胞例如不包含任何重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(例如t細(xì)胞)或者除了t細(xì)胞之外的細(xì)胞，例如b細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、腦細(xì)胞等?？蛇x地，細(xì)胞群可以是基本同質(zhì)的群體，其中所述群體主要包含含有重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(例如基本由含有重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞組成)。群體也可以是克隆細(xì)胞群，其中群體的所有細(xì)胞均為含有重組表達(dá)載體的單個(gè)宿主細(xì)胞的克隆，以使群體的所有細(xì)胞均包含重組表達(dá)載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞群是包含含有本文所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的克隆群體。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，群體中細(xì)胞的數(shù)目可以快速擴(kuò)增。表達(dá)car的細(xì)胞的數(shù)目的擴(kuò)增可以通過如以下中所述的本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何方法來完成，例如美國專利8,034,334；美國專利8,383,099；美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0244133；dudley等人,j.immunother.,26:332-42(2003)；以及riddell等人，j.immunol.methods,128:189-201(1990)。在實(shí)施方案中，通過將t細(xì)胞與okt3抗體、il-2和飼養(yǎng)pbmc(例如受輻射的同種異體pbmc)一起培養(yǎng)來進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目的擴(kuò)增。

在下文中car、核酸、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞(包括其群體)共同被稱作“本發(fā)明的car材料”，其可以是分離的和/或純化的。本文使用的術(shù)語“分離的”意為已從其天然環(huán)境中移出。術(shù)語“純化的”或“分離的”不要求絕對(duì)的純度和分離；而是其意圖作為相對(duì)術(shù)語。因此，例如純化的(或分離的)宿主細(xì)胞制備物是一種這樣的制備物，其中宿主細(xì)胞比其體內(nèi)天然環(huán)境中的細(xì)胞更純。此類宿主細(xì)胞可以，例如通過標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，將宿主細(xì)胞制備物進(jìn)行純化，以使宿主細(xì)胞代表制備物總細(xì)胞含量的至少約50％,，例如至少約70％。例如，純度可以是至少約50％，可以高于約60％、約70％或約80％，或者可以是約100％。

可將本發(fā)明的car材料配制為組合物，如藥物組合物。就這點(diǎn)而言，本發(fā)明的實(shí)施方案提供包含任何car、核酸、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞(包括其群體)以及藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。含有任何本發(fā)明的car材料的本發(fā)明的藥物組合物可以包含多種本發(fā)明的car材料，例如car和核酸，或者兩種或更多種不同的car?？蛇x地，藥物組合物可以包含與其它藥學(xué)活性劑或藥物組合的本發(fā)明的car材料，所述其它藥學(xué)活性劑或藥物如化療劑，例如天冬酰胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、道諾霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、紫杉酚、利妥昔單抗、長春花堿、長春新堿等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞或其群體。

優(yōu)選地，載體是藥學(xué)可接受的載體。關(guān)于藥物組合物，載體可以是常規(guī)用于所考慮的具體的本發(fā)明的car材料的那些載體中的任何載體。此類藥學(xué)可接受的載體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言眾所周知，并且公眾容易獲得。優(yōu)選地，藥學(xué)可接受的載體是在使用條件下，無有害副作用或毒性的載體。

載體的選擇部分將由具體的本發(fā)明的car材料以及由用于施用本發(fā)明的car材料的具體方法決定。因此，存在多種合適的本發(fā)明的藥物組合物的制劑。合適的制劑可以包括用于口服、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜間施用的那些制劑中的任何制劑。可以利用多種途徑來施用本發(fā)明的car材料，并且在某些情況下，特定途徑可以比另一途徑提供更直接以及更有效的應(yīng)答。

優(yōu)選地，通過注射，例如靜脈內(nèi)注射施用本發(fā)明的car材料。當(dāng)本發(fā)明的car材料是表達(dá)本發(fā)明的car的宿主細(xì)胞時(shí)，用于注射的細(xì)胞的藥學(xué)可接受的載體可以包括任何等張載體，如例如生理鹽水(含約0.90％w/vnacl的水，含約300mosm/lnacl的水，或者每升水約9.0gnacl)、normosolr電解質(zhì)溶液(abbott,chicago,il)、plasma-lytea(baxter,deerfield,il)、含約5％葡萄糖的水或者乳酸林格氏液。在實(shí)施方案中，用人血清白蛋白補(bǔ)充藥學(xué)可接受的載體。

本發(fā)明的car材料的劑量也將由可能伴隨具體的本發(fā)明的car材料的施用的任何不良副反應(yīng)的存在、性質(zhì)和程度決定。通常，考慮多種因素，如年齡、體重、整體健康、飲食、性別、待施用的本發(fā)明的car材料、施用途徑以及被治療的癌癥的嚴(yán)重性，主治醫(yī)師將決定用于治療各個(gè)體患者的本發(fā)明的car材料的劑量。在本發(fā)明的car材料是細(xì)胞群的實(shí)施方案中，每次輸注施用的細(xì)胞的數(shù)目可以不同，例如從約1×10⁶至約1×10¹²個(gè)細(xì)胞或更多。在某些實(shí)施方案中，可以施用少于1×10⁶個(gè)細(xì)胞。

出于本發(fā)明的目的，施用的本發(fā)明的car材料的量或劑量應(yīng)當(dāng)足以在合理的時(shí)間框內(nèi)在對(duì)象或動(dòng)物中產(chǎn)生治療應(yīng)答或預(yù)防應(yīng)答。例如，本發(fā)明的car材料的劑量應(yīng)當(dāng)足以在離施用時(shí)間約2小時(shí)或更長，例如約12至約24或者更多個(gè)小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)結(jié)合抗原，或者檢測(cè)、治療或預(yù)防癌癥。在某些實(shí)施方案中，時(shí)間段甚至可能更長。劑量將由具體的本發(fā)明的car材料的效力和動(dòng)物(例如人)的情況以及待治療的動(dòng)物(例如人)的體重決定。

出于本發(fā)明的目的，可以使用下述分析來確定向哺乳動(dòng)物施用的起始劑量：其包括例如比較各給予不同劑量的表達(dá)本發(fā)明的car的t細(xì)胞的一組哺乳動(dòng)物中，在向哺乳動(dòng)物施用給定劑量的此類t細(xì)胞時(shí)，靶細(xì)胞裂解的程度和/或此類t細(xì)胞分泌ifn-γ的程度?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法來分析施用某一劑量時(shí)，靶細(xì)胞裂解和/或ifn-γ分泌的程度。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地理解，可以以多種方式對(duì)本發(fā)明的car材料進(jìn)行修飾，以通過修飾增加本發(fā)明的car材料的治療或預(yù)防效力。例如，可將本發(fā)明的car材料直接或經(jīng)接頭間接與靶向部分綴合。將化合物，例如本發(fā)明的car材料與靶向部分綴合的實(shí)踐在本領(lǐng)域是已知的。

當(dāng)將本發(fā)明的car材料與一種或多種其它治療劑一起施用時(shí)，一種或多種其它治療劑可以共施用至哺乳動(dòng)物?！肮彩┯谩币鉃樵跁r(shí)間上足夠接近地施用一種或多種其它治療劑和本發(fā)明的car材料，以使本發(fā)明的car材料可以增強(qiáng)一種或多種其它治療劑的作用，反之亦然。就這點(diǎn)而言，可以首先施用本發(fā)明的car材料，之后施用一種或多種其它治療劑，反之亦然?？蛇x地，可以同時(shí)施用本發(fā)明的car材料和一種或多種其它治療劑。可與car材料共施用的示例性治療劑是il-2。據(jù)信，il-2增強(qiáng)本發(fā)明的car材料的治療效果。

考慮可將本發(fā)明的藥物組合物、car、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞或細(xì)胞群用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法中。不受特定理論或機(jī)制的束縛，本發(fā)明的car具有生物活性，例如識(shí)別抗原(例如cd70)的能力，以使當(dāng)由細(xì)胞表達(dá)時(shí)，car能夠介導(dǎo)針對(duì)表達(dá)car特異性抗原(例如cd70)的細(xì)胞的免疫應(yīng)答。就這點(diǎn)而言，本發(fā)明的實(shí)施方案提供治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，其包括向哺乳動(dòng)物施用有效治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的癌癥的量的本發(fā)明的car、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、細(xì)胞群和/或藥物組合物。

本發(fā)明的實(shí)施方案還包括在施用本發(fā)明的car材料前，對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行淋巴細(xì)胞清除。淋巴細(xì)胞清除的實(shí)例包括但可能不限于：非骨髓根除性淋巴細(xì)胞清除化療、骨髓根除性淋巴細(xì)胞清除化療、全身輻射等。

出于施用宿主細(xì)胞或細(xì)胞群的本發(fā)明的方法的目的，細(xì)胞可以是與哺乳動(dòng)物同種異體的細(xì)胞或是其自體的細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物自體的。

本文提及的哺乳動(dòng)物可以是任何哺乳動(dòng)物。本文使用的術(shù)語“哺乳動(dòng)物”指任何哺乳動(dòng)物，包括但不限于嚙齒目的哺乳動(dòng)物，如小鼠和倉鼠；以及兔形目的哺乳動(dòng)物，如兔。哺乳動(dòng)物可以來自食肉目，包括貓科(貓)和犬科(狗)。哺乳動(dòng)物可以來自偶蹄目，包括牛科(牛)和豬科(豬)；或者來自奇蹄目，包括馬科(馬)。哺乳動(dòng)物可以來自靈長目、猿(ceboids)目或猴(simoids)目(猴)，或者來自類人猿目(人和類人猿)。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人。

關(guān)于本發(fā)明的方法，癌癥可以是任何癌癥，包括任何急性淋巴細(xì)胞癌、急性髓性白血病、小泡型橫紋肌肉瘤、膀胱癌(bladdercancer)(例如膀胱癌(bladdercarcinoma))、骨癌、腦癌(例如髓母細(xì)胞瘤)、乳腺癌、肛門癌、肛管癌或肛腸癌、眼癌、肝內(nèi)膽管癌、關(guān)節(jié)癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外陰癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)、慢性骨髓癌、結(jié)腸癌、食管癌、宮頸癌、纖維肉瘤、胃腸道類癌瘤、頭頸癌(例如頭頸鱗狀細(xì)胞癌)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、腎癌(kidneycancer)、喉癌、白血病、液體腫瘤、肝癌、肺癌(例如非小細(xì)胞肺癌)、淋巴瘤、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、惡性間皮瘤、肥大細(xì)胞瘤、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、b-慢性淋巴細(xì)胞白血病、毛細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病(all)和伯基特淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、網(wǎng)膜癌和腸系膜癌、舌咽癌、前列腺癌、rcc、ccrcc、直腸癌、腎癌(renalcancer)、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、實(shí)體瘤、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌以及輸尿管癌。優(yōu)選地，癌癥的特征為cd70的表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，癌癥是rcc(例如ccrcc)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、nhl、cll、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤中的任何癌癥。

本文使用的術(shù)語“治療”和“預(yù)防”以及尤其衍生的詞語不一定意指100％或完全的治療或預(yù)防。而是，存在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)為具有潛在益處或治療效果的不同程度的治療或預(yù)防。在這方面，本發(fā)明的方法可以提供任何量任何水平的哺乳動(dòng)物中癌癥的治療或預(yù)防。此外，本發(fā)明的方法提供的治療或預(yù)防可以包括被治療或預(yù)防的疾病(例如癌癥)的一種或多種病況或癥狀的治療或預(yù)防。另外，出于本文的目的，“預(yù)防”可以涵蓋延遲疾病或其癥狀或病況的發(fā)作。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供本發(fā)明的car、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、細(xì)胞群或藥物組合物在哺乳動(dòng)物中的癌癥的治療或預(yù)防中的用途。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供檢測(cè)哺乳動(dòng)物中癌癥的存在的方法，其包括：(a)使包含來自所述哺乳動(dòng)物的一種或多種細(xì)胞的樣本與本發(fā)明的car、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞或細(xì)胞群接觸，從而形成復(fù)合物，(b)以及檢測(cè)復(fù)合物，其中檢測(cè)到復(fù)合物指示哺乳動(dòng)物中癌癥的存在。

樣本可以通過任何合適的方法獲得，例如活檢或尸檢?；顧z是從個(gè)體中移出組織和/或細(xì)胞。此類移出可以是從個(gè)體中收集組織和/或細(xì)胞，以便對(duì)移出的組織和/或細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)可以包括確定個(gè)體是否患有和/或正在遭受某種病況或病勢(shì)的實(shí)驗(yàn)。病況或疾病可以是，例如癌癥。

關(guān)于檢測(cè)哺乳動(dòng)物中癌癥的存在的本發(fā)明的方法的實(shí)施方案，包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的樣本可以是包含全細(xì)胞、其裂解物或全細(xì)胞裂解物的一部分(例如細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)部分、全蛋白部分或核酸部分)的樣本。如果樣本包含全細(xì)胞，則細(xì)胞可以是任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如任何器官或組織的細(xì)胞，包括血細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。

出于本發(fā)明的檢測(cè)方法的目的，關(guān)于哺乳動(dòng)物，接觸可以發(fā)生在體外或體內(nèi)。優(yōu)選地，接觸是在體外。

另外，復(fù)合物的檢測(cè)可以通過本領(lǐng)域已知的多種方式進(jìn)行。例如，可用可檢測(cè)的標(biāo)記來標(biāo)記本文所述的本發(fā)明的car、多肽、蛋白、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞或細(xì)胞群，所述可檢測(cè)的標(biāo)記如例如，放射性同位素、熒光團(tuán)(例如異硫氰酸熒光素(fitc)、藻紅蛋白(pe))、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶)以及元素顆粒(例如金顆粒)。

測(cè)試car識(shí)別靶細(xì)胞的能力以及其抗原特異性的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如clay等人，j.immunol.,163:507-513(1999)教導(dǎo)了測(cè)量細(xì)胞因子(例如，干擾素-γ、粒細(xì)胞/單核細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、腫瘤壞死因子a(tnf-α)或者白介素2(il-2))的釋放的方法。此外，如zhao等人，j.immunol.,174:4415-4423(2005)中所述，可以通過測(cè)量細(xì)胞的細(xì)胞毒性來評(píng)估car的功能。

下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但是當(dāng)然不應(yīng)當(dāng)被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例顯示了編碼car(mcd27-cd3ζcar)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及mcd27-cd3ζcar在體外針對(duì)表達(dá)mcd70的腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性，所述car含有全長小鼠cd27和小鼠cd3ζt細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域并具有seqidno:25的氨基酸序列。

構(gòu)建編碼car(mcd27-cd3ζcar)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述car含有全長小鼠cd27和小鼠cd3ζt細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域并具有seqidno:25的氨基酸序列。用mcd27-cd3ζcar逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以逆轉(zhuǎn)錄病毒的方式轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠t細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率確定為62.6％。

由脾細(xì)胞產(chǎn)生的小鼠t細(xì)胞是未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(ut)或者轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼gfp或mcd27-cd3ζcar的載體(效應(yīng)細(xì)胞)，并且單獨(dú)培養(yǎng)(培養(yǎng)基)或者與不表達(dá)小鼠cd70的b16黑素瘤細(xì)胞(b16細(xì)胞)或轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)小鼠cd70的b16細(xì)胞(b16/mcd70)靶細(xì)胞共培養(yǎng)。將識(shí)別b16腫瘤的小鼠t細(xì)胞pmel細(xì)胞用作陽性對(duì)照效應(yīng)細(xì)胞。測(cè)量ifn-γ分泌。結(jié)果顯示于表2中。如表2所示，mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞顯示出在體外針對(duì)表達(dá)cd70的腫瘤的高反應(yīng)性。

表2

實(shí)施例2

本實(shí)施例顯示，由轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼car(mcd27-cd3ζcar)的核苷酸序列的脾細(xì)胞產(chǎn)生的小鼠t細(xì)胞降低了腫瘤負(fù)荷并增加了表達(dá)cd70的荷瘤小鼠的存活，所car含有全長小鼠cd27和小鼠cd3ζt細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域并具有seqidno:25的氨基酸序列。

在將表達(dá)car的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至小鼠前11天，通過用b16細(xì)胞或b16/mcd70細(xì)胞注射小鼠在小鼠中建立腫瘤。4天之后，從小鼠中移出脾細(xì)胞，并用伴刀豆球蛋白a(cona)和il-7或者抗小鼠cd3(mcd3)以及可溶的cd28(scd28)對(duì)其進(jìn)行刺激。兩天之后，用編碼具有seqidno:25的氨基酸序列的mcd27-cd3ζcar的msgv1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)由刺激的脾細(xì)胞產(chǎn)生的小鼠t細(xì)胞。5天之后，向荷瘤小鼠施用轉(zhuǎn)導(dǎo)mcd27-cd3ζcar的細(xì)胞(1×10⁷)，并且對(duì)小鼠進(jìn)行輻射(500rad)。向?qū)φ蘸闪鲂∈笫┯梦崔D(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞、磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)或者pmel細(xì)胞(pmel)、gp100疫苗(v)和il-2(i)的組合(“pmel+vi”)，并進(jìn)行輻射。在治療后長至約35天的時(shí)間段內(nèi)，測(cè)量腫瘤大小。結(jié)果顯示于圖1a-1b中。如圖1a-1b所示，mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞降低了b16/mcd70荷瘤小鼠中的腫瘤負(fù)荷，但是未降低b16荷瘤小鼠中的腫瘤負(fù)荷。因此，負(fù)荷有cd70+腫瘤的小鼠可成功地用mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行治療，并且治療是cd70特異性的。

用b16/mcd70荷瘤小鼠重復(fù)實(shí)驗(yàn)，除了用抗mcd3和scd28刺激脾細(xì)胞，以及還在輻射以及施用轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞之后向小鼠施用il-2。向?qū)φ蘸闪鲂∈笫┯梦崔D(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞、空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或者pmel+vi，之后進(jìn)行輻射并施用il-2。在治療后長至約24天的時(shí)間段內(nèi)，測(cè)量腫瘤大小。結(jié)果顯示于圖1f中。如圖1f所示，當(dāng)與il-2共施用時(shí)，mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞降低了b16/mcd70荷瘤小鼠中的腫瘤負(fù)荷。

細(xì)胞轉(zhuǎn)移后21天，從被治療的小鼠中移出腫瘤，并使其體外生長7天。通過facs測(cè)量小鼠cd70在腫瘤中的表達(dá)。觀察到cd70的表達(dá)在用mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行治療的小鼠中喪失，但在用pmel+v或未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行治療的小鼠中未喪失。不受特定理論或機(jī)制的束縛，據(jù)信腫瘤生長的復(fù)發(fā)最可能是由于b16/mcd70腫瘤中cd70表達(dá)的喪失。

用b16/mcd70荷瘤小鼠再次重復(fù)與圖1b對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，包括下述例外。以每只小鼠1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶或1×10⁷個(gè)細(xì)胞的劑量向b16/mcd70荷瘤小鼠施用mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，進(jìn)行或不進(jìn)行輻射(500rad)。向?qū)φ蘸闪鲂∈笫┯胮bs、pmel+vi或者轉(zhuǎn)導(dǎo)有空載體的小鼠t細(xì)胞，進(jìn)行或不進(jìn)行輻射(500rad)。結(jié)果顯示于圖1c-1d中。如圖1c所示，當(dāng)對(duì)小鼠進(jìn)行輻射時(shí)，治療腫瘤的最低有效劑量是每只小鼠1×10⁵個(gè)mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。如圖1c-1d所示，在每只小鼠1×10⁷個(gè)細(xì)胞的劑量下，輻射似乎未影響治療效力。

也在治療后長至約42天的時(shí)間段內(nèi)對(duì)荷瘤小鼠的存活進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示于圖1e中。如圖1e所示，用mcd27-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞治療的受輻射的荷瘤小鼠存活更久，特別是在每只小鼠1×10⁶或1×10⁷個(gè)細(xì)胞的劑量下。

實(shí)施例3

本實(shí)施例顯示，向荷瘤小鼠施用轉(zhuǎn)導(dǎo)有mcd27-cd3ζcar的細(xì)胞導(dǎo)致一些毒性。該實(shí)施例還顯示，小鼠可以從毒性中恢復(fù)。

向b16或b16/mcd70荷瘤小鼠施用未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或者轉(zhuǎn)導(dǎo)有具有seqidno:25的氨基酸序列的mcd27-cd3ζcar的細(xì)胞、pbs或pmel+v，進(jìn)行或不進(jìn)行輻射(500rad)。在從細(xì)胞轉(zhuǎn)移后約6天開始長至治療后約17天的時(shí)間段內(nèi)，測(cè)量小鼠的平均體重。結(jié)果顯示于圖2a-2d中。如圖2a-2d所示，用mcd27-cd3ζcar治療的b16/mcd70和b16-荷瘤小鼠均觀察到瞬時(shí)較低的體重。在mcd27-cd3ζcar治療的小鼠中觀察到的較低體重與移植的腫瘤無關(guān)。不受特定理論或機(jī)制的束縛，據(jù)信較低的體重指示內(nèi)源細(xì)胞被mcd27-cd3ζcar靶向。當(dāng)向小鼠施用含水的水凝膠、親水膠體(hydrocolloid)、食用酸以及苯甲酸鈉時(shí)，小鼠恢復(fù)失去的體重。

向b16或b16/mcd70-荷瘤小鼠施用未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或者轉(zhuǎn)導(dǎo)有具有seqidno:25的氨基酸序列的mcd27-cd3ζcar的細(xì)胞，或者轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼gfp的載體的細(xì)胞，進(jìn)行或不進(jìn)行輻射(500rad)。在從細(xì)胞轉(zhuǎn)移后約6天開始長至治療之后約14天的時(shí)間段內(nèi)，測(cè)量小鼠中的絕對(duì)白細(xì)胞(wbc)計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示于圖2e-2h中。如圖2e-2f所示，在用mcd27-cd3ζcar進(jìn)行治療的小鼠中觀察到瞬時(shí)較低的wbc計(jì)數(shù)。如圖2g-2h所示，在用mcd27-cd3ζcar進(jìn)行治療的小鼠中也觀察到瞬時(shí)較低的脾細(xì)胞計(jì)數(shù)。

向b16/mcd70-荷瘤小鼠施用轉(zhuǎn)導(dǎo)有具有seqidno:25的氨基酸序列的mcd27-cd3ζcar的細(xì)胞或者轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼gfp的載體的細(xì)胞，進(jìn)行或不進(jìn)行輻射(500rad)。測(cè)量血清ifn-γ水平，持續(xù)從細(xì)胞轉(zhuǎn)移之后約3天開始長至治療之后約7天的時(shí)間段。結(jié)果顯示于圖2i中，如圖2i所示，在用mcd27-cd3ζcar治療的受輻射的小鼠中觀察到瞬時(shí)ifn-γ分泌。

實(shí)施例4

本實(shí)施例顯示，mcd27-cd3ζcar的施用對(duì)于非荷瘤小鼠的長期免疫功能無可測(cè)量的影響。

向非荷瘤小鼠施用轉(zhuǎn)導(dǎo)有具有seqidno:25的氨基酸序列的mcd27-cd3ζcar的細(xì)胞或者轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼gfp的載體的細(xì)胞(gfp)，進(jìn)行或不進(jìn)行輻射(500rad)。在轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞之后32天或50天，用卵清蛋白(ova)或人(h)gp100免疫小鼠。在免疫之后7天，從小鼠的脾臟和淋巴結(jié)(ln)移出t細(xì)胞。用ot-1、ot-ii或hgp100肽體外刺激細(xì)胞。結(jié)果顯示于表3(第32天-脾臟)、表4(第32天-ln)以及表5(第50天-脾臟)中。在表5中，將免疫的c57bl/6(免疫活性)小鼠(b6/im)用作陽性對(duì)照。將初始c57bl/6小鼠(b6/初始)用作陰性對(duì)照。如表3-5中所示，mcd27-cd3ζcar的施用對(duì)于非荷瘤小鼠的長期免疫功能無可測(cè)量的影響。

在細(xì)胞轉(zhuǎn)移之后3至7天，對(duì)各器官的組織學(xué)進(jìn)行檢驗(yàn)，所述器官包括腦、肺、肝臟、腎臟、腸、心臟、脾臟和骨。在細(xì)胞轉(zhuǎn)移之后3天至7天，對(duì)血液的化學(xué)成分，特別是下述的血液水平進(jìn)行檢驗(yàn)：鈉、鉀、氯化物、鈣、鎂、磷、葡萄糖、血尿素氮(bun)、肌酸酐、尿酸、白蛋白、蛋白、膽固醇、甘油三酯、堿性磷酸酶(alkp)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt/gpt)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast/got)、淀粉酶、肌酸激酶(ck)、以及乳酸脫氫酶(ld)。未觀察到組織學(xué)或血液化學(xué)成分的改變。

表3

表4

表5

實(shí)施例5

本實(shí)施例顯示，轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼含有全長人cd27和人cd3ζt細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的car(fcd27-cd3ζcar)的核苷酸序列的t細(xì)胞，在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的數(shù)目擴(kuò)增之后表達(dá)所述car。

用okt3非特異性刺激pbl，并且產(chǎn)生自pbl的t細(xì)胞是(a)未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(ut)，(b)用編碼全長人cd27(fcd27)的核苷酸序列轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者(c)用編碼具有seqidno:7的氨基酸序列的fcd27-cd3ζcar的核苷酸序列轉(zhuǎn)導(dǎo)。使細(xì)胞生長，通過熒光激活細(xì)胞分選(facs)對(duì)car的表達(dá)進(jìn)行分析,并基于ifn-γ的產(chǎn)生對(duì)腫瘤反應(yīng)性進(jìn)行測(cè)試。通常如riddell等人,j.immunol.methods,128:189-201(1990)中所述，對(duì)cd70反應(yīng)性細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行快速擴(kuò)增(rep)。使擴(kuò)增數(shù)目的細(xì)胞生長，并通過facs對(duì)cd27、cd70、cd45ro和cd62l的表達(dá)進(jìn)行分析。表6顯示了通過facs所測(cè)量的具有指示的表型的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。表7顯示了刺激之后(但是rep之前)以及rep之后細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增以及活力(％)。如表6和7所示，擴(kuò)增數(shù)目的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)car，有活力且具有效應(yīng)記憶表型。

表6

表7

實(shí)施例6

本實(shí)施例顯示，轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼含有全長人cd27和人cd3ζt細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的car(fcd27-cd3ζcar)的核苷酸序列的t細(xì)胞，在與表達(dá)cd70的細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)增殖，并且在體外特異性識(shí)別表達(dá)cd70的腫瘤細(xì)胞系。

t細(xì)胞產(chǎn)生自人pbl。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(ut)t細(xì)胞或轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼fcd27或fcd27-cd3ζcar的核苷酸序列的t細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)單獨(dú)培養(yǎng)，或者與表達(dá)cd70的腫瘤細(xì)胞系624mel或轉(zhuǎn)導(dǎo)有cd70的624mel細(xì)胞(624/cd70)(靶細(xì)胞)共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)第4天，利用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(cfse)測(cè)量效應(yīng)細(xì)胞的增殖。轉(zhuǎn)導(dǎo)有fcd27-cd3ζcar的t細(xì)胞僅在與表達(dá)cd70的腫瘤細(xì)胞系624/cd70共培養(yǎng)時(shí)才增殖。utt細(xì)胞和轉(zhuǎn)導(dǎo)有fcd27的t細(xì)胞在任何培養(yǎng)中均不增殖。

將utt細(xì)胞或者轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼fcd27或fcd27-cd3ζcar(seqidno:7)的核苷酸序列的t細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)單獨(dú)培養(yǎng)(培養(yǎng)基)，或者與以下表8中顯示的人rcc細(xì)胞系或?qū)φ占?xì)胞系624、624/cd70、snu245、snu1079或snu1196(靶細(xì)胞)中的一種共培養(yǎng)。所有snu細(xì)胞系均為cd70陰性。測(cè)量ifn-γ的分泌。結(jié)果顯示于表8中。如表8所示，轉(zhuǎn)導(dǎo)有核苷酸序列fcd27-cd3ζcar(seqidno:7)的t細(xì)胞對(duì)表達(dá)cd70的人rcc細(xì)胞系具有反應(yīng)性。

表8

實(shí)施例7

本實(shí)施例顯示了抗cd70人car構(gòu)建體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

用空的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(模擬)或編碼表9a-9c中所示的構(gòu)建體中的一種的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人t細(xì)胞。含有截短的(δ)cd27的car缺乏cd27胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的全部，即截短的cd27缺乏seqidno:2的連續(xù)氨基酸殘基212-260。通過facs分析轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的cd3、cd27、cd62l和cd45ro的表達(dá)。表9a-9c顯示了通過facs所測(cè)量的具有指示的表型的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。如圖表9b所示，轉(zhuǎn)導(dǎo)有car的細(xì)胞具有效應(yīng)記憶表型。

表9a

表9b

表9c

實(shí)施例8

本實(shí)施例顯示，轉(zhuǎn)導(dǎo)有fcd27-cd3ζ(seqidno:7)、δcd27-4-1bb–cd3ζ(seqidno:9)、δcd27-cd28–4-1bb–cd3ζ(seqidno:10)、fcd27-4-1bb–cd3ζ(seqidno:12)或fcd27-cd28–4-1bb–cd3ζ(seqidno:13)的人t細(xì)胞在體外識(shí)別表達(dá)cd70的rcc腫瘤細(xì)胞。

用空的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(msgv1)或編碼表9a中所示的構(gòu)建體中的一種的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人t細(xì)胞。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)(培養(yǎng)基)或與對(duì)照靶細(xì)胞624mel、624/cd70、938mel或者轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)cd70的938mel細(xì)胞(938/cd70)或者rcc靶細(xì)胞rcc2245r、rcc2246r、rcc2361r或rcc1764細(xì)胞共培養(yǎng)。測(cè)量ifn-γ的分泌。結(jié)果顯示于圖3中。如圖3所示，轉(zhuǎn)導(dǎo)有fcd27-cd3ζ(seqidno:7)、δcd27-4-1bb–cd3ζ(seqidno:9)、δcd27-cd28–4-1bb–cd3ζ(seqidno:10)、fcd27-4-1bb–cd3ζ(seqidno:12)或fcd27-cd28–4-1bb–cd3ζ(seqidno:13)的人t細(xì)胞在體外識(shí)別表達(dá)cd70的rcc腫瘤細(xì)胞。

實(shí)施例9

本實(shí)施例顯示了產(chǎn)生δcd27-4-1bb–cd3ζ(seqidno:9)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝克隆的選擇。

逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系pg13克隆a2、a10、b3、c1、e3、g2未轉(zhuǎn)導(dǎo)或者用編碼δcd27-4-1bb–cd3ζ(seqidno:9)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。表10顯示了通過facs所測(cè)量的具有指示的表型的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

表10

將轉(zhuǎn)導(dǎo)的克隆單獨(dú)培養(yǎng)(培養(yǎng)基)或者與靶對(duì)照細(xì)胞938mel、938/cd70、snu1079、snu1196或者靶rcc細(xì)胞系rcc2245r、rcc2246r、rcc2361r或rcc1764共培養(yǎng)。測(cè)量ifn-γ的分泌。結(jié)果顯示于圖4中。如圖4所示，逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝克隆e3顯示出針對(duì)表達(dá)cd70的靶腫瘤細(xì)胞系的反應(yīng)性。

用如表11中所示的car轉(zhuǎn)導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞克隆。表11顯示了通過facs所測(cè)量的具有指示的表型的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

表11

將轉(zhuǎn)導(dǎo)的克隆單獨(dú)培養(yǎng)(培養(yǎng)基)或者與靶對(duì)照細(xì)胞938mel、938/cd70、snu1079、snu1196或者靶rcc細(xì)胞系rcc2245r、rcc2246r、rcc2361r或rcc1764共培養(yǎng)。測(cè)量ifn-γ的分泌。結(jié)果顯示于圖5中。如圖5所示，逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝克隆e3顯示出針對(duì)表達(dá)cd70的靶腫瘤細(xì)胞系的反應(yīng)性。

基于逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝克隆e3/δcd27-4-1bb–cd3ζ(seqidno:9)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和腫瘤活性，選擇其用于臨床用途。

在此將本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請(qǐng)和專利通過引用并入，其程度如同將各參考文獻(xiàn)單獨(dú)且明確指明通過引用并入，并且在本文整體示出一樣。

術(shù)語“一個(gè)/一種(a)”和“一個(gè)/一種(an)”和“所述(the)”以及類似的指代物在描述本發(fā)明的上下文中(特別是在下述權(quán)利要求的上下文中)的使用被解釋為既涵蓋單數(shù)又涵蓋復(fù)數(shù)，除非本文另外指明或者上下文明顯矛盾。術(shù)語“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”以及“含有(containing)”被解釋為開放式術(shù)語(即，意為“包括但不限于”)除非另外標(biāo)注。本文數(shù)值范圍的敘述僅意圖作為單獨(dú)指落入范圍內(nèi)的各獨(dú)立數(shù)值的速記法，除非本文另外指明，并且各獨(dú)立的數(shù)值并入說明書如同本文單獨(dú)對(duì)其進(jìn)行敘述一樣?？梢砸匀魏魏线m的順序?qū)嵤┍疚乃龅乃蟹椒ǎ潜疚牧硗庵该骰蛘咴谄渌矫媾c上下文明顯矛盾。本文提供的任何或所有實(shí)施例或者示例性語言(例如“如”)的使用僅意圖更好地闡明本發(fā)明，并且不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制，除非另外聲明。說明書中的語言均不應(yīng)被解釋為指示任何未要求保護(hù)的元素對(duì)于本發(fā)明的實(shí)踐是必要的。

本文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，包括發(fā)明人已知的實(shí)施本發(fā)明的最佳方式。經(jīng)閱讀前述描述，那些優(yōu)選實(shí)施方案的改變對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言可以變得顯而易見。發(fā)明人期望本領(lǐng)域技術(shù)人員視情況應(yīng)用此類改變，并且發(fā)明人意圖以與本文具體所述的不同的方式實(shí)踐本發(fā)明。因此，如適用的法律所允許的，本發(fā)明包括在此所附的權(quán)利要求中所述的主題的所有修飾和等同物。此外，本發(fā)明涵蓋以上所述元素的所有可能的改變的任何組合，除非本文另外指明或者在其它方面與上下文明顯矛盾。

序列表

<110>美國衛(wèi)生和人力服務(wù)部

<120>抗cd70嵌合抗原受體

<130>720305

<150>us62/088,882

<151>2014-12-08

<160>27

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>193

<212>prt

<213>智人

<400>1

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100105110

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<212>prt

<213>智人

<400>5

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151015

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202530

cyssercysargpheproglugluglugluglyglycysgluleu

354045

<210>6

<211>41

<212>prt

<213>智人

<400>6

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151015

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202530

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>7

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151015

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