本申請(qǐng)要求2014年11月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第62/075,642號(hào)、2014年11月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第62/075,561號(hào)、2014年11月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第62/075,667號(hào)以及2015年6月2日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第62/169,979號(hào)的權(quán)益，所述每一篇美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。

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背景

1.發(fā)明領(lǐng)域

本文描述的是嵌合抗原受體(car)、表達(dá)car的免疫效應(yīng)細(xì)胞以及制備和使用car和cart細(xì)胞的方法。還提供了具有增強(qiáng)的治療性質(zhì)的免疫效應(yīng)細(xì)胞組合物和抗原呈遞細(xì)胞。

2.相關(guān)領(lǐng)域的描述

臨床級(jí)t細(xì)胞的效力可通過將基因療法與免疫療法組合以工程化生物制品來提高，所述生物制品具有(i)腫瘤相關(guān)抗原(taa)的識(shí)別，(ii)輸注后的持久性，(iii)遷移到腫瘤部位的潛力以及(iv)在腫瘤微環(huán)境內(nèi)循環(huán)效應(yīng)子功能的能力的優(yōu)良潛能。t細(xì)胞的此類基因工程可用于重定向細(xì)胞的特異性并提供具有抗原靶向的細(xì)胞毒性活性的治療組合物。已經(jīng)顯示這些工程化的t細(xì)胞組合物對(duì)例如癌癥患者的治療干預(yù)是有效的(jena等，2010；till等，2008；porter等，2011；brentjens等，2011；cooper和bollard，2012；kalos等，2011；kochenderfer等，2010；kochenderfer等，2012；brentjens等，2013)。然而，仍然需要允許控制體內(nèi)持久性的改進(jìn)的t細(xì)胞和car構(gòu)建體。

發(fā)明概述

在第一實(shí)施方案中，提供了包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(car)多肽。在一些方面，鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含結(jié)與fc受體諸如fcγr2a或fcγr1a結(jié)合的序列。例如，鉸鏈序列可以包含與fc受體結(jié)合的來自人免疫球蛋白(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm、igd或ige)的fc結(jié)構(gòu)域。在某些方面，鉸鏈結(jié)構(gòu)域(和/或car)不包含野生型人igg4ch2和ch3序列。

在另外的方面，實(shí)施方案的car的鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含表現(xiàn)出減少的與fc受體(諸如fcγr2a和/或fcγr1afc受體)結(jié)合或基本上無與所述受體結(jié)合的序列。在一些方面，鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含(i)具有與seqidno：1(突變型igg4-fc序列)相同的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸的人igg4-fc序列，所述序列相對(duì)全長(zhǎng)野生型igg4-fc具有減少的fc受體結(jié)合；或(ii)人cd8a細(xì)胞外序列。

在一些方面，鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含具有與seqidno：1(突變型igg4-fc序列)相同的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸的人igg4-fc序列，所述序列具有相對(duì)于全長(zhǎng)野生型igg4-fc減少的fc受體結(jié)合。在一些方面，鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含與seqidno：3(12個(gè)氨基酸的間隔子)具有至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一個(gè)方面，鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含與seqidno：3(12個(gè)氨基酸的間隔子)相同的序列。在另外的方面，鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含相對(duì)于seqidno：3具有不超過1、2或3個(gè)氨基酸缺失或取代的序列。

在某些方面，鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含igg4-fc序列，所述序列相對(duì)于野生型igg4-fc包含至少一個(gè)突變，其降低fc-受體結(jié)合。在一些方面，igg4-fc序列可與seqidno：1具有至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些方面，igg4-fc序列相對(duì)于野生型序列可包含l235e或n297q突變。在某些方面，igg4-fc序列相對(duì)于野生型序列可包含l235e和n297q突變。在一個(gè)方面，igg4-fc序列可與seqidno：1相同，或相對(duì)于seqidno：1可包含不超過1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸缺失或取代。在另一方面，igg4-fc序列i與seqidno：1相同。

在一些方面，鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含cd8a細(xì)胞外序列。例如，鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含與seqidno：2的細(xì)胞外部分具有至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在另外的方面，car多肽可包含與seqidno：2的細(xì)胞外部分相同的序列，或相對(duì)于seqidno：2的細(xì)胞外部分可包含不超過1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸缺失或取代。在另外的方面，car多肽的鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含與seqidno：20具有至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在另外的方面，car多肽可以包含與seqidno：20相同的序列，或者相對(duì)于seqidno：20可包含不超過1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸缺失或取代。

在一些方面，跨膜結(jié)構(gòu)域可包含cd8a跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些方面，car多肽可包含與seqidno：2的跨膜部分具有至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一個(gè)方面，car多肽可包含與seqidno：2的跨膜部分相同的序列，或相對(duì)于seqidno：2的跨膜部分可包含不超過1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸缺失或取代。在某些方面，跨膜結(jié)構(gòu)域可包含cd28、cd8a或cd137的跨膜結(jié)構(gòu)域。在另外的方面，跨膜結(jié)構(gòu)域可包含與seqidno：19具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的cd8a跨膜結(jié)構(gòu)域。在另外的方面，car多肽可包含與seqidno：19相同的跨膜序列，或相對(duì)于seqidno：19可包含不超過1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸缺失或取代。

在一些方面，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可包含來自cd3ζ的結(jié)構(gòu)域。例如，實(shí)施方案的car多肽可包含與seqidno：13具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的cd3ζ序列。在另外的方面，car多肽可包含與seqidno：13相同的cd3ζ序列，或相對(duì)于seqidno：13可包含不超過1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸缺失或取代。另外的方面，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可包括來自cd28或cd137(4-1bb)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。例如，car可包含細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其包含與seqidno：15或seqidno：17具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在另外的方面，car多肽可包含細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其包含與seqidno：15或seqidno：17相同的序列，或相對(duì)于seqidno：15或17可包含不超過1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)氨基酸缺失或取代。

在各個(gè)方面，實(shí)施方案的car的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含scfv或抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)。在另外的方面，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含第一scfv結(jié)構(gòu)域和第二scfv結(jié)構(gòu)域，其中所述第一或第二scfv結(jié)構(gòu)域之一與第一抗原結(jié)合，并且另一結(jié)構(gòu)域結(jié)合第二抗原。在一些方面，vl結(jié)構(gòu)域可以相對(duì)于vh結(jié)構(gòu)域位于n末端。在某些方面，vh結(jié)構(gòu)域可以相對(duì)于vl結(jié)構(gòu)域位于n末端。在某些方面，car多肽還可在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間和/或第一與第二scfv結(jié)構(gòu)域之間包含接頭序列。在一些方面，接頭序列可以是whitlow接頭(seqidno：7)。

在各個(gè)方面，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可結(jié)合感染性疾病抗原或癌細(xì)胞抗原。癌細(xì)胞抗原的實(shí)例包括cd19、cd20、ror1、cd22癌胚抗原、甲胎蛋白、ca-125、5t4、muc-1、上皮腫瘤抗原、前列腺特異性抗原、黑素瘤相關(guān)抗原、突變p53、突變r(jià)as、her2/neu、葉酸結(jié)合蛋白、hiv-1包膜糖蛋白gp120、hiv-1包膜糖蛋白gp41、gd2、cd123、cd33、cd138、cd23、cd30、cd56、c-met、間皮素、gd3、herv-k、il-11rα、κ鏈、λ鏈、cspg4、erbb2、egfrviii、vegfr2、組合的her2-her3、組合的her1-her2或組合的her1-her3。在一些方面，癌細(xì)胞抗原可以是cd19，car可以是cd19靶向的car。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼根據(jù)實(shí)施方案的car多肽的核酸分子。在一些方面，編碼car的序列側(cè)接轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列或病毒ltr。

在另外的實(shí)施方案中，提供了包含根據(jù)實(shí)施方案的car多肽或核酸的分離的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞、nk細(xì)胞或nkt細(xì)胞)。在一些方面，細(xì)胞是t細(xì)胞或t細(xì)胞祖細(xì)胞。在另外的方面，細(xì)胞是人細(xì)胞。在某些方面，細(xì)胞組合物可包含低至100個(gè)或1,000個(gè)細(xì)胞。然而，在一些方面，細(xì)胞組合物包含至少約10⁴個(gè)、10⁵、10⁶個(gè)、10⁷個(gè)、10⁸個(gè)｀10⁹個(gè)、10¹⁰個(gè)、10¹¹個(gè)或更多個(gè)表達(dá)car的免疫效應(yīng)細(xì)胞。在一些方面，細(xì)胞可具有基本相同的遺傳物質(zhì)。在另外的方面，細(xì)胞可以是來源于可以是供體或患者的單個(gè)受試者的人類細(xì)胞。另一個(gè)實(shí)施方案提供了藥物組合物，其在藥學(xué)上可接受的載體中包含根據(jù)實(shí)施方案的表達(dá)car的細(xì)胞群。

在另外的實(shí)施方案中，提供了治療受試者(例如，患有癌癥或感染性疾病的受試者)的方法，所述方法包括施用有效量的表達(dá)根據(jù)實(shí)施方案的car多肽的免疫效應(yīng)細(xì)胞。在某些方面，受試者可能患有癌癥。在某些方面，癌癥可以是血液癌癥或?qū)嶓w癌，諸如t細(xì)胞all、b-all、cml、結(jié)腸癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腦腫瘤或胰腺癌。在一些方面，患者可能已經(jīng)經(jīng)歷了先前的抗癌療法。在一些方面，患者可能處于緩解狀態(tài)。在另一方面，患者可能沒有癌癥的癥狀，但包含可檢測(cè)的癌細(xì)胞。另一方面，受試者可能具有病毒感染(例如，巨細(xì)胞病毒(cmv)、愛潑斯坦-巴爾病毒(ebv)或人免疫缺陷病毒(hiv))。在另一個(gè)方面，受試者可具有細(xì)菌感染。在一個(gè)方面，所述疾病可以是敗血癥。

在某些方面，治療受試者的方法包括施用表達(dá)car的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如t細(xì)胞)，所述car包含具有結(jié)合人fc受體的多肽序列的鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在一些方面，向例如患病組織的部位局部施用此類免疫效應(yīng)細(xì)胞。在某些方面，局部遞送部位具有減少數(shù)目(或基本上沒有)的表達(dá)fc受體的細(xì)胞。例如，施用部位可存在于受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(例如，腦)、眼或睪丸中。

在一些方面，car多肽可包含結(jié)合癌細(xì)胞抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些方面，癌癥可以是乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌或胰腺癌。在另外的方面，癌癥表達(dá)被car的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的癌細(xì)胞抗原。在另外的方面，受試者已被鑒定為具有表達(dá)car多肽所結(jié)合的癌細(xì)胞抗原的癌癥。在另外的方面，先前從受試者分離了免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)。

在一些另外的方面，免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)可與患者同種異體。在各方面，同種異體細(xì)胞可以與或可以不與患者共享hla。另一個(gè)方面，免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)于患者可以是自體的。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種方法，其包括獲得包含免疫效應(yīng)細(xì)胞或其祖細(xì)胞(例如，t細(xì)胞或t細(xì)胞祖細(xì)胞)的細(xì)胞樣品，用編碼根據(jù)實(shí)施方案的car多肽的dna轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供轉(zhuǎn)基因表達(dá)car的細(xì)胞，以及在選擇性增強(qiáng)表達(dá)car的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，表達(dá)car的t細(xì)胞)的增殖的培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因car細(xì)胞群。在一些方面，所述方法還包括用轉(zhuǎn)座子側(cè)連的car和轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)座酶有效地將編碼car的dna整合入細(xì)胞的基因組中。在另外的方面，方法包括在轉(zhuǎn)染前純化或富集樣品中的t細(xì)胞。在一些情況下，免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞或t細(xì)胞祖細(xì)胞)來源于誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞。在另外的方面，富集樣品中的細(xì)胞包括收集單核細(xì)胞級(jí)分。在一些情況下，細(xì)胞樣品可以來自受試者的臍帶血、淋巴器官或外周血樣品。在一些情況下，可以通過單采或靜脈穿刺獲得細(xì)胞樣品。在另外的方面，細(xì)胞樣品是免疫細(xì)胞的亞群，諸如t細(xì)胞的亞群。在一些方面，將轉(zhuǎn)基因car細(xì)胞滅活以用于表達(dá)內(nèi)源t細(xì)胞受體和/或內(nèi)源hla。在另外的方面，獲得細(xì)胞樣品包括從第三方獲得細(xì)胞。

在一些方面，轉(zhuǎn)染方法(例如，car構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染方法)包括將編碼car的dna電穿孔至細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)中。在另外的方面，可使用病毒載體將car構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞。在一些方面，轉(zhuǎn)染可以不涉及用病毒感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在另外的方面，用編碼膜結(jié)合的cγ細(xì)胞因子的核酸另外轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一些情況下，膜結(jié)合的cγ細(xì)胞因子可以是膜結(jié)合的il-7、il-15或il-21。在具體方面，膜結(jié)合的cγ細(xì)胞因子是il-15-il-15rα融合蛋白(例如，諸如seqidno：4的mil-15多肽)。

在另外的方面，編碼car的dna是質(zhì)粒。在另外的方面，car可由引入細(xì)胞的rna編碼。在某些方面，轉(zhuǎn)座酶可以作為dna表達(dá)載體、mrna、多肽或可表達(dá)的rna來提供。在具體方面，轉(zhuǎn)座酶是鮭魚型tc1樣轉(zhuǎn)座酶(sb)。在另外的具體方面，轉(zhuǎn)座酶是sb11或sb100x轉(zhuǎn)座酶。

在實(shí)施方案的另外的方面，按照本文詳述的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因car細(xì)胞，包括在樹突狀細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因car細(xì)胞，或者激活和繁殖刺激表達(dá)car的免疫效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)增的細(xì)胞(aapc)。在另外的方面，aapc包含在aapc表面上表達(dá)的car結(jié)合抗體或其片段。在一些情況下，aapc可包含激活或共刺激t細(xì)胞的另外分子。在一些情況下，所述另外分子可包含膜結(jié)合的cγ細(xì)胞因子。在另外的方面，滅活或輻照aapc，或已測(cè)試其感染性物質(zhì)并確認(rèn)其不含感染性物質(zhì)。在另外的方面，在aapc存在的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因car細(xì)胞包括在包含可溶性細(xì)胞因子諸如il-21和/或il-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因car細(xì)胞。可以以約10∶1至約1∶10、約3∶1至約1∶5、約1∶1至約1∶3(免疫效應(yīng)細(xì)胞cfaapc)或可來源于其中的任何范圍的比例培養(yǎng)所述細(xì)胞。例如，t細(xì)胞和aapc的共培養(yǎng)物可以是約1∶1、約1∶2或約1∶3的比例。

在另外的方面，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因car細(xì)胞群不超過7天、14天、21天、28天、35天或42天。在一些情況下，不在aapc存在的情況下離體培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。在一些具體情況下，實(shí)施方案的方法還包括在轉(zhuǎn)染和/或培養(yǎng)步驟后富集表達(dá)car的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)的細(xì)胞群。富集可包括熒光激活細(xì)胞分選(facs)和對(duì)表達(dá)car的細(xì)胞的分選。在另外的方面，car表達(dá)細(xì)胞的分選包括使用car結(jié)合抗體。富集還可包括cd56+細(xì)胞的耗盡。在實(shí)施方案的另外的方面，所述方法還包括冷凍保存轉(zhuǎn)基因car細(xì)胞群的樣品。

在另外的實(shí)施方案中，提供了通過任何實(shí)施方案的方法制備的表達(dá)car的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)群。

在另外的實(shí)施方案中，提供了治療患者疾病的方法，所述方法包括按照本實(shí)施方案的方法產(chǎn)生細(xì)胞組合物，并向有此需要的患者施用有效量的所述細(xì)胞組合物。在一些方面，提供了用于治療患有醫(yī)學(xué)病況的個(gè)體的方法，所述方法包括從本文描述的細(xì)胞群體提供有效量的細(xì)胞的步驟，包括在一些方面不止一次提供，例如間隔至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天。

在另外的實(shí)施方案中，提供了包含編碼靶抗原的第一轉(zhuǎn)基因和編碼人白細(xì)胞抗原(hla)的第二轉(zhuǎn)基因的工程化抗原呈遞細(xì)胞(apc)，所述hla在與靶抗原的表位復(fù)合的apc的表面上表達(dá)。工程化的apc可以是或可以不是永生化的。在一些方面，工程化的apc是原代細(xì)胞或t細(xì)胞或t細(xì)胞祖細(xì)胞。在一些其它方面，工程化的apc是表達(dá)αβtcr或γδtcr的t細(xì)胞。在某些具體方面，在工程化的apc中表達(dá)的hla是hla-a2。在另外的方面，工程化的apc已被測(cè)試并被確認(rèn)為沒有傳染性材料。

在一些方面，實(shí)施方案的工程化的apc還可包含編碼共刺激分子的至少第三轉(zhuǎn)基因。共刺激分子可以是可為膜結(jié)合的cγ細(xì)胞因子的共刺激細(xì)胞因子。在某些方面，共刺激細(xì)胞因子是il-15，其可以是或可以不是膜結(jié)合的。

在另外的方面，滅活或輻照實(shí)施方案的工程化的apc。在一些方面，工程化的apc可包含經(jīng)編輯的基因以減少或消除抑制基因的表達(dá)。在具體方面，抑制性基因是pd-1、lim-3、ctla-4或tcr。

在另外的方面，在實(shí)施方案的工程化的apc中表達(dá)的靶抗原可以是感染性疾病抗原或腫瘤相關(guān)抗原(taa)。靶抗原可以是細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面抗原。例如，在一些方面，靶抗原是taa，諸如源自腫瘤細(xì)胞的亞細(xì)胞區(qū)室的taa。taa可以是膜結(jié)合的、細(xì)胞質(zhì)的、核定位的或甚至由腫瘤細(xì)胞分泌的。優(yōu)選地，與相應(yīng)的正常組織相比，taa差異表達(dá)，從而允許免疫效應(yīng)細(xì)胞優(yōu)先識(shí)別腫瘤細(xì)胞。腫瘤抗原可以被松散地分類為癌胚胎的(通常只在胎兒組織和癌性體細(xì)胞中表達(dá)的)、致癌病毒的(oncoviral)(由致瘤轉(zhuǎn)化病毒編碼的)、過表達(dá)/積累的(由正常和腫瘤組織表達(dá)的，表達(dá)水平在瘤形成中高度升高)、癌-睪丸的(僅由癌細(xì)胞和成體生殖組織諸如睪丸和胎盤表達(dá)的)、譜系限制的(主要由單個(gè)癌組織型表達(dá)的)、突變的(僅由作為遺傳突變或轉(zhuǎn)錄的改變的結(jié)果而產(chǎn)生的癌癥表達(dá)的)、翻譯后改變的(糖基化中的腫瘤相關(guān)的改變，等等)或獨(dú)特型的(高度多態(tài)性的基因，其中腫瘤細(xì)胞表達(dá)特定的“克隆型”，例如，如在因克隆異常而導(dǎo)致的b細(xì)胞、t細(xì)胞淋巴瘤/白血病中)，任何此類taa可用作根據(jù)實(shí)施方案的靶抗原。靶抗原的具體實(shí)例包括但不限于wt1、muc1、lmp2、hpve6e7、egfrviii、her-2/neu、獨(dú)特型、magea3、p53非突變體、ny-eso-1、psma、gd2、cea、melana/mart1、ras突變體、gp100、p53突變體、蛋白酶3(pr1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、psa、htert、肉瘤易位斷裂點(diǎn)、epha2、pap、ml-iap、afp、epcam、erg(tmprss2ets融合基因)、na17、pax3、alk、雄激素受體、細(xì)胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mcn、rhoc、trp-2、gd3、巖藻糖基gm1、間皮素、psca、magea1、sle(a)、cyp1b1、plac1、gm3、boris、tn、globoh、etv6-aml、ny-br-1、rgs5、sart3、stn、碳酸酐酶ix、pax5、ot-tes1、精子蛋白17、lck、hmwmaa、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、legumain、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-1、fap、pdgfr-β、mad-ct-2和fos相關(guān)抗原1。其它方面，靶抗原是感染性疾病抗原。

在另外的方面，實(shí)施方案的工程化的apc是人細(xì)胞。在一些方面，可將工程化的apc的第一和/或第二轉(zhuǎn)基因整合至細(xì)胞的基因組中。另外，在某些方面，所述第一和/或第二轉(zhuǎn)基因可以側(cè)接轉(zhuǎn)座子重復(fù)或病毒ltr。在另外的方面，第一和/或第二轉(zhuǎn)基因由重組mrna編碼。

在另外的實(shí)施方案中，提供了包含根據(jù)實(shí)施方案的工程化的apc群和具有針對(duì)與apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原的表位的特異性的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)群的細(xì)胞培養(yǎng)物。在某些方面，培養(yǎng)物的免疫效應(yīng)細(xì)胞具有與工程化的apc相同的遺傳背景。在具體方面，免疫效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)與在工程化的apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原表位結(jié)合的t細(xì)胞受體(tcr)。在特定方面，tcr是αβtcr。在某些方面，靶抗原是ny-eso-1。在一些具體方面，tcr包含與抗-ny-eso-1-αβtcr(seqidno：28)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與其相同的序列。

在另外的方面，細(xì)胞培養(yǎng)物的免疫效應(yīng)細(xì)胞(包括實(shí)施方案的工程化的apc)表達(dá)嵌合的t細(xì)胞受體(car)，其結(jié)合與在工程化的apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原的表位。car可包含結(jié)合與在apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原的表位的抗體可變結(jié)構(gòu)域。在一些具體方面，靶抗原是ny-eso-1。在某些方面，car包含與ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與所述序列相同的序列。

在一些方面，實(shí)施方案的工程化的apc的細(xì)胞培養(yǎng)物可包含刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)擴(kuò)增的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可包含il-21和/或il-2。在具體方面，培養(yǎng)物包含為約10∶1至約1∶10(免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)工程化的apc)的比例。

在另外的實(shí)施方案中，提供了藥物組合物，其案在藥學(xué)上可接受的載體中包含根據(jù)本文所述的實(shí)施方的工程化的apc群。

在另外的實(shí)施方案中，提供了治療患有疾病的受試者的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的根據(jù)實(shí)施方案的工程化的apc，其中所述apc表達(dá)與該疾病相關(guān)的靶抗原。在一些方面，受試者患有表達(dá)由工程化的apc編碼的靶抗原的癌癥。癌癥可以是骨髓瘤或滑膜肉瘤。在某些方面，癌癥是ny-eso-1陽性癌癥，并且靶抗原是ny-eso-1。

在實(shí)施方案的一些方面，先前已從受試者中分離出工程化的apc。在另外的方面，所述方法另外包括向受試者施用抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞群，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)與在工程化的apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原表位具有特異性?？赡芟惹耙褟氖茉囌咧蟹蛛x出來免疫效應(yīng)細(xì)胞。在另外的方面，免疫效應(yīng)細(xì)胞已被工程化來表達(dá)結(jié)合與在工程化的apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原表位的t細(xì)胞受體(tcr)。在具體方面，tcr是αβtcr。在一些特定方面，目標(biāo)抗原是ny-eso-1。在某些方面，tcr包含與抗-ny-eso-1-αβtcr(seqidno：28)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與其相同的序列。

在該實(shí)施方案的另外方面，免疫效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)結(jié)合與在工程化的apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原結(jié)合的嵌合t細(xì)胞受體(car)。car可包含結(jié)合與在工程化的apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原表位的抗體可變結(jié)構(gòu)域。在一些具體方面，靶抗原是ny-eso-1。在另外的方面，car包含與ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與所述序列相同的序列。

在另外的實(shí)施方案中，提供了重組car多肽，其包含與ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與所述序列相同的序列。在另外的實(shí)施方案中，提供了包含與ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與所述序列相同的car多肽的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)。

在另外的方面，實(shí)施方案的方法另外包括富集表達(dá)抗原的工程化的apc的細(xì)胞群。在一些方面，富集包括熒光激活細(xì)胞分選(facs)。在具體方面，富集包括針對(duì)抗原表達(dá)的分選。

另外的實(shí)施方案提供了制備實(shí)施方案的工程化的apc的方法，所述方法包括獲得包含apc的細(xì)胞樣品并用包含編碼靶抗原的轉(zhuǎn)基因和編碼人白細(xì)胞抗原(hla)的轉(zhuǎn)基因的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使得所述hla在apc的表面上表達(dá)，與靶抗原的表位復(fù)合以產(chǎn)生工程化的apc的群體。在某些方面，apc是t細(xì)胞或t細(xì)胞祖細(xì)胞。在另外的方面，所述方法另外包括在轉(zhuǎn)染前純化或富集樣品中的apc。在特定方面，t細(xì)胞或t細(xì)胞祖細(xì)胞來源于誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或造血干細(xì)胞。在另外的方面，富集樣品中的t細(xì)胞包括收集單核細(xì)胞級(jí)分。在一些方面，細(xì)胞樣品可以來自受試者的臍帶血、淋巴器官或外周血樣品。在某些方面，細(xì)胞樣品可通過單采或靜脈穿刺獲得。在另外的方面，細(xì)胞樣品是t細(xì)胞的亞群。在一些具體方面，滅活轉(zhuǎn)基因car細(xì)胞以用于表達(dá)內(nèi)源t細(xì)胞受體和/或內(nèi)源hla。在特定方面，獲得細(xì)胞樣品包括從第三方獲得細(xì)胞。

在一些方面，apc的轉(zhuǎn)染包括將編碼轉(zhuǎn)基因的dna電穿孔至apc中以產(chǎn)生工程化的apc。在另外的方面，apc可使用病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一些方面，轉(zhuǎn)染可以涉及或可以不涉及用病毒感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在另外的方面，用編碼膜結(jié)合的cγ細(xì)胞因子的核酸另外轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在某些方面，膜結(jié)合的cγ細(xì)胞因子可以是膜結(jié)合的il-7、il-15或il-21。在具體方面，膜結(jié)合的cγ細(xì)胞因子是il-15-il-15rα融合蛋白。

在另一方面，apc的轉(zhuǎn)染另外包括將轉(zhuǎn)座酶引入細(xì)胞，并且其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因側(cè)接轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列。在一些方面，轉(zhuǎn)座酶可以作為dna表達(dá)載體、mrna、多肽或可表達(dá)的rna來提供。在具體方面，轉(zhuǎn)座酶是鮭魚型tc1樣轉(zhuǎn)座酶(sb)。在另外的具體方面，轉(zhuǎn)座酶是sb11或sb100x轉(zhuǎn)座酶。

在實(shí)施方案的另外方面，生產(chǎn)工程化的apc的方法包括在促進(jìn)apc增殖的培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)工程化的apc細(xì)胞群的另外步驟。在一些方面，培養(yǎng)工程化的apc可包括在抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞諸如t細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞對(duì)與在apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原的表位具有特異性。在某些方面，可從與apc相同的受試者獲得免疫效應(yīng)細(xì)胞。在另外的方面，免疫效應(yīng)細(xì)胞已被工程化來表達(dá)結(jié)合與在apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原表位的t細(xì)胞受體(tcr)。在特定方面，tcr是αβtcr。在另外的方面，免疫效應(yīng)細(xì)胞已被工程化來表達(dá)結(jié)合與在apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原表位的嵌合抗原受體(car)。在一些方面，car可包含結(jié)合與在apc中表達(dá)的hla復(fù)合的靶抗原表位的抗體可變結(jié)構(gòu)域。

在另外的方面，已測(cè)試了實(shí)施方案的工程化的apc的感染性材料，并且已確認(rèn)其不含傳染性材料。在一些方面，在免疫效應(yīng)細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)工程化的apc可包括在包含il-21和/或il-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在另外的方面，在免疫效應(yīng)細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)工程化的apc可能包括以約10∶1至約1∶10(免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)apc)的比例培養(yǎng)細(xì)胞。在某些方面，工程化的apc的培養(yǎng)不超過7天、14天、21天、28天、35天或42天。

在另外的實(shí)施方案中，提供了通過本文所述的任何實(shí)施方案的方法制備的工程化的apc群體。

在另外的實(shí)施方案中，提供了包含工程化的apc和/或抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞組合物。細(xì)胞組合物可包含低達(dá)100或1,000個(gè)細(xì)胞。然而，在一些方面，細(xì)胞組合物包含至少約10⁴個(gè)、10⁵個(gè)、10⁶個(gè)、10⁷個(gè)、10⁸個(gè)、10⁹個(gè)、10¹⁰個(gè)、10¹¹個(gè)或更多工程化的apc和/或抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞。在一個(gè)方面，細(xì)胞可具有基本上相同的遺傳物質(zhì)。在一些方面，細(xì)胞可以是來源于單個(gè)受試者的人細(xì)胞，所述受試者可以是供體或患者。

在另外的實(shí)施方案中，提供了包含含有本實(shí)施方案的工程化的apc的細(xì)胞組合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。

在另外的實(shí)施方案中，提供了治療患者疾病的方法，所述方法包括施用有效量的包含工程化的apc的細(xì)胞群或包含工程化apc的藥物組合物。在一個(gè)方面，患者可以是人類患者。在某些方面，所述疾病可以是癌癥。在另外的方面，癌癥可以是血液癌癥或?qū)嶓w癌，諸如t細(xì)胞all、b-all、cml、結(jié)腸癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腦腫瘤或胰腺癌。在一些方面，患者可以已經(jīng)經(jīng)歷了先前的抗癌療法。在一個(gè)方面，患者可處于緩解狀態(tài)。在另一個(gè)方面，患者可以沒有癌癥的癥狀，但包含可檢測(cè)的癌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，所述疾病可以是病毒感染(例如，巨細(xì)胞病毒(cmv)、愛潑斯坦-巴爾病毒(ebv)或人免疫缺陷病毒(hiv))。在另一個(gè)方面，所述疾病可以是細(xì)菌感染。在一個(gè)方面，所述疾病可以是敗血癥。

在一些另外的方面，包含工程化的apc的細(xì)胞組合物對(duì)于患者可以是同種異體的。在各個(gè)方面，同種異體細(xì)胞組合物可以與或可以不與患者共享hla。在另一個(gè)方面，包含工程化的apc的細(xì)胞組合物對(duì)于患者可以是自體的。

在另外的實(shí)施方案中，提供了治療患者疾病的方法，所述方法包括產(chǎn)生包含本實(shí)施方案的工程化的apc的細(xì)胞組合物，并向有此需要的患者施用有效量的所述細(xì)胞組合物。

在一些方面，提供了用于治療具有醫(yī)學(xué)病況的個(gè)體的方法，所述方法包括提供有效量的實(shí)施方案的工程化的apc的步驟，包括在一些方面中不止一次地提供，諸如間隔至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天。

在另外的實(shí)施方案中，本文提供了在用于治療目的的基因修飾之后鑒定和選擇高能免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，car+t細(xì)胞)的方法。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于選擇具有線粒體備用呼吸容量的經(jīng)car修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法。在一些方面，該方法包括檢測(cè)線粒體報(bào)告基因的表達(dá)水平，并選擇線粒體報(bào)告基因表達(dá)水平升高的免疫效應(yīng)細(xì)胞，從而選擇具有線粒體備用呼吸容量的免疫效應(yīng)物。在一些方面，免疫效應(yīng)細(xì)胞可以是人細(xì)胞，例如car-修飾的人t細(xì)胞。

在一些方面，根據(jù)實(shí)施方案使用的線粒體報(bào)告基因可以是內(nèi)源基因。在一些方面，線粒體報(bào)告基因可以是外源基因，例如編碼熒光報(bào)告蛋白的基因。在一些方面，熒光報(bào)告蛋白可包含線粒體定位序列。在某些方面，用于選擇具有src的免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法可以包括流式細(xì)胞術(shù)或facs。

在某些方面，用src鑒定免疫效應(yīng)細(xì)胞的報(bào)告基因的表達(dá)可處于核啟動(dòng)子(例如hef1a)的控制下。在某些方面，報(bào)告基因的表達(dá)可處于線粒體啟動(dòng)子的控制之下。在某些方面，表達(dá)的報(bào)告蛋白可包含線粒體定位序列。在某些方面，表達(dá)的報(bào)告蛋白可被引導(dǎo)至細(xì)胞表面。在某些方面，報(bào)告基因的表達(dá)可處于線粒體啟動(dòng)子的控制之下，并且所表達(dá)的報(bào)告蛋白被引導(dǎo)至細(xì)胞表面。在一些方面，外源報(bào)告基因可側(cè)接轉(zhuǎn)座子重復(fù)或病毒ltr。在一些方面，外源報(bào)告基因可包含在染色體外核酸如mrna或附加型載體中。

在一些方面，可將選擇用于src(例如，經(jīng)car-修飾的t細(xì)胞)的免疫效應(yīng)細(xì)胞離體擴(kuò)增一段時(shí)間，其在一些方面可包括用飼養(yǎng)細(xì)胞(諸如含有car配體或結(jié)合car的抗體(例如2d3scfv)的活化和繁殖細(xì)胞(aapc))培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)方面，aapc可以是轉(zhuǎn)基因k562細(xì)胞。在一個(gè)方面，aapc可表達(dá)cd137l。在其它方面，aapc還可表達(dá)cd19、cd64、cd86或mil15。在某些方面，aapc可表達(dá)至少一種抗cd3抗體克隆，諸如，例如okt3和/或ucht1。在一個(gè)方面，可滅活(例如輻照)aapc。在一個(gè)方面，可能已測(cè)試了aapc的感染性物質(zhì)，并且已確認(rèn)其不含感染性物質(zhì)。制備此類aapc的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)方面，用aapc培養(yǎng)經(jīng)car-修飾的t細(xì)胞群可包括以約10∶1至約1∶10的、約3∶1至約1∶5、約1∶1至約1∶3(t細(xì)胞對(duì)aapc)或可從其中導(dǎo)出的任何范圍的比例培養(yǎng)細(xì)胞。例如，t細(xì)胞和aapc的共培養(yǎng)物可以是約1∶1、約1∶2或約1∶3的比例。在一個(gè)方面，培養(yǎng)步驟還可包括利用氨基二膦酸(例如，唑來膦酸)的培養(yǎng)。

在另外的實(shí)施方案中，為免疫效應(yīng)細(xì)胞群(例如，經(jīng)car-修飾的t細(xì)胞)提供線粒體備用呼吸容量和藥學(xué)上可接受的載體。可以根據(jù)本實(shí)施例的方法來選擇細(xì)胞群。在一些方面，細(xì)胞可以是治療上可行的。在一些方面，細(xì)胞群可包含至少10個(gè)、1x10²個(gè)、1x10³個(gè)、1x10⁴個(gè)、1x10⁵個(gè)或1x10⁶個(gè)或可從其中導(dǎo)出的任何數(shù)目的細(xì)胞。在各個(gè)方面，細(xì)胞可以是nk細(xì)胞、天然殺傷t細(xì)胞、αβt細(xì)胞或γδt細(xì)胞。在一個(gè)方面，免疫效應(yīng)細(xì)胞可具有基本相同的遺傳物質(zhì)。在一些方面，免疫效應(yīng)細(xì)胞可以是經(jīng)car修飾的人t細(xì)胞。在一些方面，細(xì)胞可以來源于可以是供體或患者的單個(gè)受試者。

在另外的實(shí)施方案中，提供了治療有此需要的患者的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的具有線粒體備用呼吸容量或就線粒體備用呼吸容量選擇的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，經(jīng)car修飾的t細(xì)胞)群。在一些方面，所述方法可包括向患者施用約100個(gè)至約1×10⁶個(gè)細(xì)胞或可從其衍生的任何數(shù)目的細(xì)胞。在某些方面，患者可以是人患者。在某些方面，具有src的免疫效應(yīng)細(xì)胞群對(duì)于患者可以同種異體的。在各個(gè)方面，同種異體細(xì)胞組合物可以與或可以不與患者共享hla。在某些方面，具有src的免疫效應(yīng)細(xì)胞群對(duì)患者可以是自體的。在各個(gè)方面，所述方法還可包括向患者施用第二療法。

在一些方面，用具有src或就src選擇的免疫效應(yīng)細(xì)胞治療的疾病可以是癌癥。在某些方面，癌癥可以是血液癌癥或?qū)嶓w癌，諸如t細(xì)胞all、b-all、cml、結(jié)腸癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腦腫瘤或胰腺癌。在一些方面，患者可以已經(jīng)歷了先前的抗癌治療。在一個(gè)方面，患者可處于緩解狀態(tài)。在另一個(gè)方面，患者可以沒有癌癥的癥狀，但包含可檢測(cè)的癌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，利用具有src的免疫效應(yīng)細(xì)胞治療的疾病可以是病毒感染(例如，巨細(xì)胞病毒(cmv)、愛潑斯坦-巴爾病毒(ebv)或人免疫缺陷病毒(hiv))。在另一方面，所述疾病可以是細(xì)菌感染。在一個(gè)方面，所述疾病可以是敗血癥。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療患者疾病的方法，所述方法包括根據(jù)實(shí)施方案產(chǎn)生包含具有src的免疫效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞組合物，并向有此需要的患者施用有效量的所述細(xì)胞組合物。在一些方面，提供了用于治療患有醫(yī)學(xué)病況的個(gè)體的方法，所述方法包括提供有效量的具有src的免疫效應(yīng)細(xì)胞的步驟，在一些方面包括不止一次，諸如間隔至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含本實(shí)施方案的細(xì)胞群的組合物，用于治療患者的疾病。

可對(duì)本文所述的任何其它方法或組合物使用在實(shí)施方案的方法和/或組合物的上下文中討論的實(shí)施方案。因此，關(guān)于一種方法或組合物的實(shí)施方案也可應(yīng)用于實(shí)施方案的其它方法和組合物。

根據(jù)以下詳細(xì)描述，實(shí)施方案的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)描述和具體實(shí)例僅通過說明的方式給出，因?yàn)楦鶕?jù)該詳細(xì)描述，實(shí)施方案的精神和范圍內(nèi)的各種改變和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見。

附圖簡(jiǎn)述

圖1：靶向cd19受體的嵌合抗原受體的示例示意圖。car構(gòu)建體(cd19rcd28)包含cd19結(jié)合結(jié)構(gòu)域(vl/vh)、鉸鏈結(jié)構(gòu)域(igg4-fc)、跨膜結(jié)構(gòu)域(cd28tm)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(cd28-cd3ζ)。

圖2a-b：a，圖顯示通過流式細(xì)胞術(shù)獲得的散點(diǎn)圖，該散點(diǎn)圖顯示在電穿孔后1天和與k562aapc共培養(yǎng)28天后cd19rcd28car在t細(xì)胞上的表達(dá)。b，圖是通過流式細(xì)胞術(shù)獲得的散點(diǎn)圖，該散點(diǎn)圖顯示cd19rcd28cart細(xì)胞的fc受體(cd32(fcγr2a)、cd64(fcγr1a))的體外結(jié)合。

圖3a-b：因fcr結(jié)合引起的有限的體內(nèi)持久性可降低功效。用hrluc⁺nalm6腫瘤注射nsg小鼠，然后單次注射cd19rcd28t細(xì)胞(或?qū)φ兆⑸?。a，隨著時(shí)間的推移通過成像測(cè)量與腫瘤相關(guān)的生物發(fā)光。b，圖表顯示基于測(cè)量發(fā)光水平的處理或?qū)φ談?dòng)物隨時(shí)間推移的腫瘤負(fù)荷。

圖4a-h：所述圖顯示了構(gòu)建和測(cè)試的各種car的示意圖。還提供了所選car結(jié)構(gòu)域的序列。對(duì)于人igg4鉸鏈區(qū)，將鉸鏈從氨基酸cpsc(如seqidno：9所示的全長(zhǎng)序列)突變?yōu)閏ppc(如seqidno：10所示的全長(zhǎng)序列)，以增強(qiáng)二聚化igg4重鏈的穩(wěn)定性。人igg4fc(具有氨基酸變化l235e和n297q的eq突變體)是如seqidno：1所示的。人cd8a鏈鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域以seqidno：3提供。將來自人igg4fc的12個(gè)氨基酸的間隔子從氨基酸cpsc(如seqidno：18所示的)突變成cppc(如seqidno：2所示的)以增強(qiáng)二聚化igg4重鏈(如seqidno：2所示的)的穩(wěn)定性。對(duì)于人cd28跨膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，將人cd28跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域從rllh(如seqidno：11所示的全長(zhǎng)序列)修飾為rggh(如seqidno：12所示的全長(zhǎng)序列)，以改善car的表達(dá)。對(duì)于人cd28胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，將人cd28胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域從rllh(如seqidno：16所示的全長(zhǎng)序列)修飾為rggh(如seqidno：17所示的全長(zhǎng)序列)以改善car的表達(dá)。

圖5：該圖顯示通過流式細(xì)胞術(shù)獲得的散點(diǎn)圖，該散點(diǎn)圖顯示在電穿孔后1天和在與k562aapc共培養(yǎng)28天后，car的各種car在t細(xì)胞上的表達(dá)。

圖6：該圖顯示通過流式細(xì)胞術(shù)獲得的散點(diǎn)圖，該散點(diǎn)圖顯示cd19r*cd28cart細(xì)胞對(duì)fc受體(cd32(fcγr2a)、cd64(fcγr1a))的體外結(jié)合減少。

圖7：該圖顯示描繪了在與k562aapc共培養(yǎng)的28天中各種cart細(xì)胞的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)的圖。

圖8：該圖顯示描繪各種cart細(xì)胞相對(duì)于cd19el-4和nalm-6靶細(xì)胞顯示的cd19特異性細(xì)胞毒性的圖。

圖9：該圖顯示當(dāng)與不同靶細(xì)胞接觸時(shí)，各種cart細(xì)胞的cd19特異性ifn-γ產(chǎn)生的圖表。

圖10：該圖顯示用腫瘤(hrluc+nalm-6)注射(i.v.)，然后在第二天用ffluc+car+t細(xì)胞注射(i.c.)的nsg小鼠的發(fā)光成像。在使用xenogenivis100系列系統(tǒng)分別注射enduren或熒光素后，進(jìn)行腫瘤和t細(xì)胞成像。在確認(rèn)心內(nèi)注射(頂行)后立即進(jìn)行t細(xì)胞成像。顯示了表示來自腫瘤產(chǎn)生的hrluc活性隨時(shí)間的光子通量的陰影圖像。

圖11：改善car+t細(xì)胞控制疾病的體內(nèi)功效。該圖顯示表示基于圖10中的生物發(fā)光測(cè)量的腫瘤負(fù)荷的圖。如上所述，用hrluc+nalm-6腫瘤注射nsg小鼠，然后單次注射cart細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移測(cè)量腫瘤相關(guān)生物發(fā)光，并顯示所述生物發(fā)光。(*)表示相對(duì)于僅腫瘤組的至少p＜0.05的顯著性。

圖12：該圖顯示描繪用各種cart細(xì)胞處理的nsg小鼠的存活曲線的圖。當(dāng)與僅腫瘤(無處理)組相比時(shí)，計(jì)算出顯著性(p值)。

圖13a-d：car⁺t細(xì)胞的表征。用cd19r*cd28或cd19rcd8cd28轉(zhuǎn)座子和sb11轉(zhuǎn)座酶對(duì)pbmc進(jìn)行電穿孔，并在7天刺激周期中，將其在經(jīng)輻照的k562抗原呈遞細(xì)胞上與il-2和il-21一起共培養(yǎng)28天。在每個(gè)刺激周期結(jié)束時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和表型分型(cd3，car)。(a)在電穿孔后當(dāng)天(第1天)和共培養(yǎng)28天后，car在cd3⁺t細(xì)胞上的表達(dá)。(b)顯示擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)的cd3和car+t細(xì)胞的推定細(xì)胞計(jì)數(shù)。(c)使用針對(duì)cd19^pos靶標(biāo)(cd19⁺el-4、nalm-6、daudiβ2m)的標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)定法測(cè)量cd19特異性細(xì)胞毒性。背景裂解通過cd19^negel-4的裂解來描繪。(d)當(dāng)用表達(dá)cd19的各種效應(yīng)物靶刺激時(shí)，car⁺t細(xì)胞的ifn-γ的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。

圖14a-d：car⁺t細(xì)胞對(duì)nsg(nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wjl/szj，nodscidγ)小鼠中的cd19⁺nalm-6細(xì)胞系的體內(nèi)功效。(a-b)在最小殘留疾病模型中，在第0天向nsg小鼠(n＝5/組)注射10⁴個(gè)hrluc⁺mkate⁺nalm-6細(xì)胞，然后在第1天心內(nèi)注射t細(xì)胞(10⁷/小鼠)。隨時(shí)間推移使用enduren活細(xì)胞基質(zhì)，通過源自hrluc⁺nalm-6產(chǎn)的生物發(fā)光成像評(píng)估腫瘤負(fù)荷。(c-d)對(duì)于已建立的腫瘤模型，在第0天向nsg小鼠(n＝6/組)注射1.5x10⁴個(gè)ffluc⁺egfp⁺nalm-6，并將腫瘤移植5天，評(píng)價(jià)腫瘤負(fù)荷，并在第6天心內(nèi)注射t細(xì)胞(10⁷/小鼠)。隨著時(shí)間的推移，使用d-熒光素底物從ffluc⁺nalm-6進(jìn)行生物發(fā)光成像來計(jì)算腫瘤通量。顯示了表示光子通量和腫瘤通量隨時(shí)間變化的偽彩圖像。

圖15：該圖顯示cart細(xì)胞的另外的信號(hào)傳導(dǎo)分子。上圖顯示膜結(jié)合的il-15/il-15受體(mil15)構(gòu)建體(構(gòu)建體的多肽序列如seqidno：4所示)。下圖是由膜結(jié)合的il-15/il-15受體(左圖)和car構(gòu)建體(右圖)提供的信號(hào)傳導(dǎo)的示意圖。

圖16：mil15和car的穩(wěn)定共表達(dá)。左上圖顯示了電穿孔后24小時(shí)或刺激4(stim4)的mil15+car+t細(xì)胞的代表性流動(dòng)圖(flowplot)。左下圖是顯示表達(dá)car或car和mil15的電穿孔細(xì)胞的百分比的圖。右上圖，圖顯示抗原撤出后培養(yǎng)中的cart細(xì)胞數(shù)的變化。在無il-15，添加il-15復(fù)合物或利用共表達(dá)mil-15和car的細(xì)胞的情況下完成研究。右下圖顯示表達(dá)mil-15的cart細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的表達(dá)水平的圖。

圖17a-b：a，該圖顯示用只表達(dá)car或表達(dá)與mil-15組合的car的ffluc+t細(xì)胞注射的小鼠的發(fā)光成像。在使用xenogenivis100系列系統(tǒng)分別注射熒光素后進(jìn)行t細(xì)胞成像。陰影圖像表示隨著時(shí)間推移來自ffluc+t細(xì)胞活性的光子通量。b，左圖，圖顯示在抗原存在的情況下或抗原撤出(wd)后培養(yǎng)mil-15-cart細(xì)胞中的因子的表達(dá)水平。右圖板顯示在刺激和不刺激的情況下cart細(xì)胞和mil-15-cart細(xì)胞的直方圖。

圖18：cart細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)控制。該圖顯示用hrluc+腫瘤細(xì)胞注射的小鼠的發(fā)光成像(上圖)和定量(下圖，圖)。如所指示的，某些小鼠還注射了表達(dá)car或car和mil-15的t細(xì)胞。

圖19：舉例說明用作抗原呈遞細(xì)胞的t細(xì)胞(t-apc)的示意圖。t細(xì)胞自體移植后，以及通過直接和交叉引發(fā)改善內(nèi)源性長(zhǎng)期免疫。

圖20：用于遺傳修飾人t細(xì)胞以表達(dá)腫瘤抗原ny-eso-1的睡美人質(zhì)粒的圖示。組成型表達(dá)由hef1-α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，通過在0.2mg/ml潮霉素下繁殖t細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)選擇。

圖21：用作aapc的k562上的t細(xì)胞共刺激分子的表。

圖22：在電轉(zhuǎn)染共表達(dá)flag標(biāo)記的ny-eso-1和hytk的sb質(zhì)粒后，在okt3-aapc上共培養(yǎng)的第28天進(jìn)行的人t-apc的流式細(xì)胞術(shù)。

圖23：在ny-eso-1⁺t-apc(上)對(duì)比k562aapc(下)上擴(kuò)增的pbmc。

圖24：在ny-eso-1⁺t-apc對(duì)比k562aapc上擴(kuò)增的ny-eso-1⁺cart細(xì)胞。

圖25：3次刺激后ny-eso-1⁺t-apc上的抑制分子。

圖26：在aapc存在的情況下繁殖的ny-eso-1⁺mil-15⁺hla-a2⁺t-apc。

圖27：t-apc擴(kuò)增。t-apc能夠成功地?cái)U(kuò)增cart細(xì)胞以及源自陽性對(duì)照k562的aapc。

圖28：顯示ny-eso-1特異性tcr⁺和car⁺t細(xì)胞殺死ny-eso-1⁺u266人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的鉻釋放測(cè)定。在來源于k562的人工活化和繁殖細(xì)胞(aapc)上擴(kuò)增t細(xì)胞，所述t細(xì)胞表達(dá)hla-a02和ny-eso-1⁺。數(shù)據(jù)表示兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，其中繁殖9-2-15的ny-eso-1特異性cart細(xì)胞，用hla-a2/ny-eso-1t-apc刺激3次，并且用衍生的aapck562刺激2次。9-2-15car含有cd8α莖，而先前的9-2-15car含有igg4莖。

圖29a-29b：圖29a.在經(jīng)輻照的k562aapc存在的情況下，與對(duì)照t細(xì)胞一起離體生長(zhǎng)的基因修飾的t細(xì)胞的tem(透射電子顯微術(shù))圖像。與在相似條件下激活的未修飾的對(duì)照細(xì)胞(左圖)相比，在經(jīng)car修飾的細(xì)胞(右圖)中看到線粒體數(shù)量的增加。圖29b.顯示與在第35天培養(yǎng)中繁殖的經(jīng)car修飾的t細(xì)胞中的線粒體的縮合狀態(tài)相比的未修飾的對(duì)照t細(xì)胞中的線粒體規(guī)則正統(tǒng)結(jié)構(gòu)的透射電子顯微術(shù)(tem)圖像(比例尺500nm，50,000倍放大)。

圖30：在未共同刺激的情況下的her1-3雙特異性car-t細(xì)胞的離體擴(kuò)增。細(xì)胞是未修飾的或用cd28和/或cd137t細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域修飾的car。當(dāng)在培養(yǎng)中不提供共刺激時(shí)，相對(duì)于含有cd28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的cart細(xì)胞，具有cd137t細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞在培養(yǎng)中存活得更好。用于未經(jīng)修飾的對(duì)照細(xì)胞的okt3刺激作用更好可能是因?yàn)橥ㄟ^cd3z誘導(dǎo)的較高的信號(hào)傳導(dǎo)強(qiáng)度。顯示了在k562aapc存在的情況下離體繁殖的靶向腫瘤抗原h(huán)er1-3的car-t細(xì)胞的tem圖像。還測(cè)試了其它腫瘤抗原靶向的car諸如ror1、cd123和c19的該tem圖像。通過nexcelom，使用臺(tái)盼藍(lán)活/死亡排除法計(jì)算有活力的絕對(duì)t細(xì)胞數(shù)。

圖31：熒光蛋白報(bào)告基因的sb質(zhì)粒構(gòu)建體。grx2是源自glrx2(pubmedid#np_932066.1)的線粒體定位序列。nls是核定位序列(pubmedid#nm_017921)。

圖32：經(jīng)car修飾的細(xì)胞中的eyfp內(nèi)源性表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。在培養(yǎng)的第35天在無共刺激的情況下生長(zhǎng)的cd137-cart細(xì)胞中出現(xiàn)具有高eyfp的car+t細(xì)胞。cd28-t細(xì)胞顯示較少或更暗的eyfp陽性t細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)基于fc染色(針對(duì)car表達(dá))和內(nèi)源性eyfp(針對(duì)線粒體強(qiáng)度)。

圖33a-33b：在無t細(xì)胞共刺激的情況下利用經(jīng)輻照的飼養(yǎng)細(xì)胞(k562aapc)擴(kuò)增的her1-3雙特異性car-t細(xì)胞的線粒體生物量。圖33a.顯示線粒體在未修飾的t細(xì)胞和經(jīng)修飾以表達(dá)靶向her1-her3(由cd28-cd3z或cd137-cd3zt細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成)的原型car的t細(xì)胞中的分布的透射電子顯微術(shù)(tem)圖像(比例尺500nm，15,000倍放大)。圖33b.每個(gè)細(xì)胞的平均線粒體數(shù)量在條形圖中表示。與含有cd28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的car-t細(xì)胞相比，總體上具有cd137t細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的car-t細(xì)胞在第21天培養(yǎng)后顯示出生物量的增加。

圖34：高能t細(xì)胞(et)的體外細(xì)胞毒性。發(fā)現(xiàn)就高線粒體質(zhì)量分選的高能t細(xì)胞保留了細(xì)胞毒性能力，如通過對(duì)腫瘤抗原陽性乳腺癌細(xì)胞的特異性殺傷所證明的。數(shù)據(jù)來自對(duì)cr標(biāo)記的her1-3⁺t細(xì)胞(針對(duì)對(duì)于特定抗原呈陽性的乳腺腫瘤細(xì)胞系的)的進(jìn)行的鉻釋放測(cè)定，所述cr標(biāo)記的her1-3⁺t細(xì)胞被具有高eyfp/線粒體強(qiáng)度的cart細(xì)胞裂解。

圖35：在最小活化和完全不存在共刺激的情況下，在經(jīng)輻照的飼養(yǎng)細(xì)胞(k562aapc)存在的情況下離體擴(kuò)增的未修飾的和經(jīng)car修飾的t細(xì)胞的熒光顯微術(shù)圖像。含有cd137t細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的car-t細(xì)胞顯示較高的線粒體質(zhì)量分布，如從報(bào)告蛋白(eyfp-grx2)內(nèi)源性發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度觀察到的。與含有cd28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的car-t細(xì)胞相比，含有cd137t細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的car-t細(xì)胞中的代謝活性t細(xì)胞數(shù)量明顯更高。這是一致的，不論供體或car的類型。

圖36：在經(jīng)輻射的飼養(yǎng)細(xì)胞(k562aapc)存在的情況下生長(zhǎng)的離體擴(kuò)增的經(jīng)car-修飾的t細(xì)胞中的線粒體分布模式。

圖37a-37b：熒光顯微術(shù)圖像的綜合形態(tài)測(cè)量分析顯示基于代表特定信號(hào)傳導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的基因修飾的t細(xì)胞(her1-her3cd137-cd3zt細(xì)胞)組內(nèi)的線粒體強(qiáng)度的經(jīng)car-修飾的t細(xì)胞的異質(zhì)群體。圖37a.her1-3cd137car⁺t細(xì)胞中的eyfp-mito的群體變異。圖37b.her1-3cd137car⁺t細(xì)胞中的eyfp-mito的平均強(qiáng)度。

圖38：在通用k562-aapc上生長(zhǎng)的car+t細(xì)胞的透射電子顯微術(shù)(tem)圖像。圖像來自實(shí)施例8中所述的研究的第14天。

圖39：ror1-cart細(xì)胞在通用k562-aapc上的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。含有cd28信號(hào)傳導(dǎo)的car-t細(xì)胞迅速進(jìn)行凋亡(左圖)，而含有cd137z信號(hào)傳導(dǎo)的car-t細(xì)胞持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)(右圖)。

詳述

臨床試驗(yàn)已證明了在已經(jīng)接受遺傳修飾的t細(xì)胞的患者中的抗腫瘤作用。例如，已顯示car-t細(xì)胞療法在患有晚期b細(xì)胞惡性腫瘤的人類患者中表現(xiàn)出有意義的緩解(maude等，2014)。car-t細(xì)胞具有尋求和破壞體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所必需的特異性和細(xì)胞毒性能力，并且可持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間來阻止復(fù)發(fā)。最近在幾個(gè)于i期臨床試驗(yàn)中接受治療的患者中，已經(jīng)顯示了連續(xù)殺傷(一個(gè)t細(xì)胞殺死多個(gè)腫瘤細(xì)胞而不發(fā)生無反應(yīng)性)的該經(jīng)典情況(corrigan-curay等，2014)。然而，在car設(shè)計(jì)、cart細(xì)胞胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、間隔長(zhǎng)度用法、scfv的親和力等方面尚未出現(xiàn)統(tǒng)一而明確的臨床相關(guān)結(jié)果(jena等，2014)。這再次因通過car-t細(xì)胞輸注尋求治療的患者群體中的可變腫瘤負(fù)荷和腫瘤類型而復(fù)雜化。設(shè)計(jì)治療上有效的car構(gòu)建體和最終基因修飾的t細(xì)胞群的主要挑戰(zhàn)是，這將在腫瘤類型、腫瘤分期和患者群體的整個(gè)范圍上減輕臨床相關(guān)結(jié)果(無顯著毒性)。

本文詳述的研究鑒定了在cart細(xì)胞持久性中起作用的關(guān)鍵元件，其可影響t細(xì)胞的功效和潛在毒性(例如，來自脫靶細(xì)胞毒性活性)。具體地，顯示了car多肽被fc受體結(jié)合的能力調(diào)節(jié)t細(xì)胞的持久性和抗腫瘤功效。因此，可通過改變?cè)趖細(xì)胞上表達(dá)的car多肽的fc受體結(jié)合性質(zhì)來改變cart細(xì)胞功效(和體內(nèi)持久性)。例如，可將fc受體結(jié)合序列(諸如來自人免疫球蛋白恒定區(qū))包含在car中以減少t細(xì)胞的持續(xù)性并控制t細(xì)胞的潛在毒性。相反，可以修飾car多肽以除去fc受體結(jié)合元件以增加cart細(xì)胞的體內(nèi)持久性并增強(qiáng)其功效。因此，本文詳述的car多肽、cart細(xì)胞和方法允許cart細(xì)胞持久性的微調(diào)(通過調(diào)節(jié)fc受體結(jié)合)以控制cart細(xì)胞療法的功效和毒性。

在另外的實(shí)施方案中，提供了包含編碼靶抗原的轉(zhuǎn)基因和編碼人白細(xì)胞抗原(hla)的轉(zhuǎn)基因的工程化的抗原呈遞細(xì)胞(apc)。在一些方面，工程化的apc可另外包含編碼共刺激因子(諸如il-15)的一種或多種轉(zhuǎn)基因。此類工程化的apc可用于例如用于擴(kuò)增t細(xì)胞(諸如，cart細(xì)胞)的離體方法，或可被施用于受試者以在體內(nèi)刺激抗原特異性t細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，本文提供的細(xì)胞可用于刺激抗原特異性t細(xì)胞的生長(zhǎng)以用于治療疾病(例如，癌癥)。

本文公開的其它實(shí)施方案提供具有src或針對(duì)src選擇的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其可以提供增強(qiáng)的治療性質(zhì)。具有高線粒體生物量的細(xì)胞在本文中例如被稱為“能量t細(xì)胞”或“et細(xì)胞”。由于基因修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的增加的持久性與改善的治療潛力正相關(guān)，因此預(yù)計(jì)免疫細(xì)胞諸如能量t細(xì)胞表現(xiàn)優(yōu)于大量基因修飾的t細(xì)胞。另外，如果可基于線粒體強(qiáng)度(即備用呼吸容量或src)在輸注前鑒定長(zhǎng)期存活的car-t細(xì)胞，則可利用多種變量對(duì)car設(shè)計(jì)，從而對(duì)car功能的影響。因此，線粒體強(qiáng)度可有助于選擇/分選最佳的連續(xù)t細(xì)胞殺傷劑而不論car胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的使用、car構(gòu)建體的設(shè)計(jì)、間隔子的長(zhǎng)度和scfv的親和力，從而減少翻譯障礙，以優(yōu)化適合于特定的腫瘤抗原和腫瘤類型的car設(shè)計(jì)。在多種情況下，在輸注前挑取最好的t細(xì)胞(例如，在腫瘤微環(huán)境中具有最大存活潛力的那些細(xì)胞)可以是有利的。因此，提供了使用報(bào)告熒光蛋白(例如，eyfp-grx2)測(cè)量car+t細(xì)胞的“適合性”的方法，所述報(bào)告熒光蛋白是可定量的并與線粒體src相關(guān)，其轉(zhuǎn)而指示遺傳修飾的t細(xì)胞在缺氧、無特定營(yíng)養(yǎng)物用于糖酵解的不利條件下存活的代謝能力，和由高負(fù)荷腫瘤抗原引起的活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

此外，選擇更少，更具效力的car+t細(xì)胞用于輸注可有助于減少或甚至消除輸注后的t細(xì)胞相關(guān)毒性。限制輸注所需的細(xì)胞數(shù)量將減輕生長(zhǎng)大量難以生長(zhǎng)的患者來源的自體t細(xì)胞(以用于遺傳修飾)的負(fù)擔(dān)。例如，在過繼性細(xì)胞療法的方法中，使用少量的免疫效應(yīng)細(xì)胞(諸如t細(xì)胞)引發(fā)高抗腫瘤殺傷可以是非常希望的。使用少量的t細(xì)胞可使從經(jīng)car-修飾的t細(xì)胞輸注產(chǎn)生的輸注相關(guān)毒性降至最低。此外，如果輸注的細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間更長(zhǎng)，從而可防止腫瘤復(fù)發(fā)，則這可以是優(yōu)選的。在這兩種情況下，鑒定、選擇和輸注高能car修飾的t細(xì)胞的現(xiàn)有方法將是有益的。

在任何特定批次的經(jīng)car修飾的t細(xì)胞中線粒體分布以及src之間存在異質(zhì)性。因此，如果仔細(xì)選擇，與大量群體相比，較少的細(xì)胞可在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)相似的結(jié)果。這對(duì)于腫瘤是有幫助的，在所述腫瘤中(i)car不能區(qū)分正?？乖c腫瘤相關(guān)抗原，因此較少細(xì)胞的輸注是希望的，(ii)由于原始細(xì)胞群中固有的畸形，患者來源的自體t細(xì)胞的擴(kuò)增是困難的，(iii)輸注后經(jīng)car修飾的t細(xì)胞在體內(nèi)的有限持久性是希望的。測(cè)定src/線粒體強(qiáng)度的方法可基于使用mito-tracker染料(invitrogen)標(biāo)記細(xì)胞，或其中取回細(xì)胞以用于臨床應(yīng)用是不可能的類似的修飾后方法。測(cè)定線粒體強(qiáng)度的其他方法(諸如測(cè)量氧氣消耗或細(xì)胞外酸化)測(cè)量大量細(xì)胞的強(qiáng)度而非單個(gè)細(xì)胞的強(qiáng)度，其也缺乏臨床應(yīng)用。如本文所提供的，可使用非病毒dna電穿孔法來同時(shí)修飾效應(yīng)細(xì)胞(諸如t細(xì)胞)以用于car表達(dá)和src鑒定。具體地，為了選擇et細(xì)胞，可通過睡美人介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座(一種已經(jīng)適應(yīng)于臨床翻譯的基于非病毒dna的基因遞送系統(tǒng))來實(shí)現(xiàn)熒光線粒體指導(dǎo)的報(bào)告蛋白與car分子一起在細(xì)胞中表達(dá)。在基因修飾和基于配體刺激的k562的共培養(yǎng)后，et細(xì)胞的基于流式細(xì)胞術(shù)的分選可以在gmp條件下進(jìn)行，適于翻譯，并且可容易地適應(yīng)于在診所中使用?？傊赏ㄟ^將臨床相關(guān)方法組合以遺傳修飾t細(xì)胞來產(chǎn)生可遞送期望的抗腫瘤功效的代謝活性t細(xì)胞(et細(xì)胞)，使用具有最少的活化的基于輻照的k562的共培養(yǎng)將其擴(kuò)增至大量，并基于熒光報(bào)告蛋白的表達(dá)來鑒定其。

i.定義

如本文中所用，“一個(gè)/種(a)”或“一個(gè)/種(an)”可指一個(gè)/種或多個(gè)/種。如在權(quán)利要求中所用，當(dāng)與單詞“包含”一起使用時(shí)，單詞“一個(gè)/種(a)”或“一個(gè)/種(an)”可指一個(gè)/種或不止一個(gè)/種。

除非明確地指示僅指替代方案，或者替代方案是相互排斥的，否則在權(quán)利要求中使用術(shù)語“或”用于表示“和/或”，盡管本公開支持僅指替代方案和“和/或”的定義。如本文中所用，“另一”可表示至少第二或更多。

在整個(gè)本申請(qǐng)中，術(shù)語“約”用于表示值包括用于測(cè)定值的裝置、方法的固有誤差變化或存在于研究對(duì)象之間的變化。

如本文中所用，術(shù)語“抗原”是能夠被抗體或t細(xì)胞受體結(jié)合的分子。抗原另外地能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致b和/或t淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。

如本文中所用，術(shù)語“抗腫瘤有效量”是指在受試者中減少癌細(xì)胞或腫瘤生長(zhǎng)或減小腫瘤體積或腫瘤細(xì)胞數(shù)目的表達(dá)car的免疫效應(yīng)細(xì)胞的有效量?！翱鼓[瘤有效量”還可增加預(yù)期壽命或減輕與腫瘤或癌癥相關(guān)的生理作用的表達(dá)car的免疫效應(yīng)細(xì)胞的有效量。

ii.嵌合抗原受體和組分

嵌合抗原受體分子是重組融合蛋白，特征在于它們通過其細(xì)胞質(zhì)尾部中存在的免疫受體激活基序(itam)結(jié)合抗原(例如，her1/her3)和轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號(hào)的能力。利用抗原結(jié)合部分(例如，由單鏈抗體(scfv)產(chǎn)生的)的受體構(gòu)建體提供了為“通用的”的另外有利方面，因?yàn)樗鼈円圆灰蕾囉趆la的方式結(jié)合靶細(xì)胞表面上的天然抗原。

根據(jù)實(shí)施方案的嵌合抗原受體可通過本領(lǐng)域已知的任何方法產(chǎn)生，盡管優(yōu)選使用重組dna技術(shù)來產(chǎn)生。編碼嵌合抗原受體的幾個(gè)區(qū)域的核酸序列可通過分子克隆的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(基因組文庫(kù)篩選、pcr、引物輔助連接、來自酵母和細(xì)菌的scfv文庫(kù)、定向誘變等)來制備和組裝成完整編碼序列?？蓪⑺玫木幋a區(qū)插入表達(dá)載體中并用于轉(zhuǎn)化合適的表達(dá)宿主(同種異體或自體免疫效應(yīng)細(xì)胞)。

本文所述的car的實(shí)施方案包括編碼抗原特異性嵌合抗原受體(car)多肽的核酸，包括包含細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和包含一個(gè)或多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)基序的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的核酸。在某些實(shí)施方案中，car可識(shí)別由一個(gè)或多個(gè)抗原之間的共享空間組成的表位。在一些實(shí)施方案中，嵌合抗原受體包含：a)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，b)跨膜結(jié)構(gòu)域，和c)包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。任選地，car可包含位于跨膜結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在某些方面，實(shí)施方案的car還包含將car的表達(dá)引導(dǎo)至細(xì)胞表面的信號(hào)肽。例如，在一些方面，car可包含來自gm-csf的信號(hào)肽(參見例如，seqidno：5)。

在某些實(shí)施方案中，當(dāng)存在少量腫瘤相關(guān)抗原時(shí)，還可將car與膜結(jié)合的細(xì)胞因子共表達(dá)以改善持久性。例如，可將car與膜結(jié)合的il-15共表達(dá)。

取決于car的結(jié)構(gòu)域和所述結(jié)構(gòu)域中使用的特異性序列的排列，表達(dá)car的免疫效應(yīng)細(xì)胞可具有不同水平的針對(duì)靶細(xì)胞的活性。在一些方面，可將不同的car序列引入免疫效應(yīng)細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，針對(duì)升高的src選擇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，以及已測(cè)試所選擇的細(xì)胞的活性，以鑒定經(jīng)預(yù)測(cè)具有最大治療功效的car結(jié)構(gòu)的活性。

a.抗原結(jié)合域

在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)、單克隆抗體的可變區(qū)和/或其抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該特異性來源于與受體結(jié)合的肽(例如，細(xì)胞因子)?！盎パa(bǔ)決定區(qū)(cdr)”是在抗原受體(例如，免疫球蛋白和t細(xì)胞受體)蛋白的可變結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的短氨基酸序列，其與抗原互補(bǔ)，因此為受體提供其針對(duì)該特定抗原的特異性?？乖荏w的每條多肽鏈含有3個(gè)cdr(cdr1、cdr2和cdr3)。由于抗原受體通常由兩條多肽鏈組成，所以每個(gè)抗原受體有6個(gè)cdr可以與抗原接觸--每條重鏈和輕鏈含有3個(gè)cdr。由于在cdr中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)與免疫球蛋白和t細(xì)胞受體相關(guān)的序列變異，因此這些區(qū)域有時(shí)被稱為高變區(qū)。在這些可高變區(qū)中，cdr3顯示出最大的變異性，因?yàn)槠涫峭ㄟ^vj(在重鏈和tcrαβ鏈的情況下為vdj)的重組而編碼的。

預(yù)期car核酸，特別是scfv序列是增強(qiáng)人患者的細(xì)胞免疫療法的人基因。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了全長(zhǎng)carcdna或編碼區(qū)?？乖Y(jié)合區(qū)或結(jié)構(gòu)域可包含來源于特定小鼠或人或人源化單克隆抗體的單鏈可變片段(scfv)的vh和vl鏈的片段。該片段還可以是任何數(shù)目的抗原特異性抗體的不同抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在更具體的實(shí)施方案中，該片段是由針對(duì)用于人細(xì)胞中表達(dá)的人密碼子選擇而優(yōu)化的序列編碼的抗原特異性scfv。在某些方面，car的vh和vl結(jié)構(gòu)域通過接頭序列(諸如whitlow接頭)分離(參見例如，seqidno：20)。還在國(guó)際(pct)專利公布第wo/2015/123642號(hào)(通過引用并入本文)中提供了可根據(jù)實(shí)施方案修飾或使用的car構(gòu)建體。

在一些具體實(shí)例中，car的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合her2/neu(stancovski等，1993)、erbb2(moritz等，1994)、葉酸結(jié)合蛋白(hwu等，1995)、腎細(xì)胞癌(weitjens等，1996)和hiv-1包膜糖蛋白gp120和gp41(roberts等，1994)?？杀籧ar結(jié)合的其它細(xì)胞表面靶抗原包括但不限于cd20、癌胚抗原、間皮素、ror1、c-met、cd56、gd2、gd3、α甲胎蛋白、cd23、cd30、cd123、il-11rα、κ鏈、λ鏈、cd70、ca-125、muc-1、egfr和變體、上皮腫瘤抗原等。

在嵌合抗原受體的某些實(shí)施方案中，受體的抗原特異性部分(其可被稱為包含抗原結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)包含如上文詳述的her1/her3結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些方面，例如，her1/her3結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含美國(guó)專利公布第2012/0121596號(hào)(通過引用并入本文)中提供的序列之一。

b.鉸鏈結(jié)構(gòu)域

在某些方面，實(shí)施方案的car多肽可包括位于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在一些情況下，可將鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含在car多肽中以在抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞表面之間提供足夠的距離，或緩解可不利地影響car-基因修飾的t細(xì)胞的抗原結(jié)合或效應(yīng)子功能的可能的空間位阻。

在一些情況下，car鉸鏈結(jié)構(gòu)域可來源于人免疫球蛋白(ig)恒定區(qū)或其部分(包括ig鉸鏈)，或來源于人cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域和cd8a鉸鏈區(qū)。在一個(gè)方面，car鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含抗體同種型igg4的鉸鏈-ch2-ch3區(qū)。在一些方面，可在抗體重鏈ch2結(jié)構(gòu)域中引入點(diǎn)突變以減少car-t細(xì)胞或任何其它經(jīng)car修飾的細(xì)胞的糖基化和非特異性fcγ受體結(jié)合。

在某些方面，實(shí)施方案的car鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含igfc結(jié)構(gòu)域，其相對(duì)于野生型igfc結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)突變，所述突變減少fc-受體結(jié)合。例如，car鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含相對(duì)于野生型igg4-fc結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)突變的igg4-fc結(jié)構(gòu)域，所述突變減少fc-受體結(jié)合。在一些方面，car鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含相對(duì)于野生型igg4-fc序列在對(duì)應(yīng)于l235和/或n297的位置處具有突變(諸如氨基酸缺失或取代)的igg4-fc結(jié)構(gòu)域。例如，car鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含相對(duì)于野生型igg4-fc序列具有l(wèi)235e和/或n297q突變的igg4-fc結(jié)構(gòu)域。在另外的方面，car鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含的igg4-fc結(jié)構(gòu)域，所述的igg4-fc結(jié)構(gòu)域在位置l235處具有針對(duì)氨基酸的親水性的(諸如r、h、k、d、e、s、t、n或q)或與“e”具有相似性質(zhì)的(諸如d)的氨基酸取代。在某些方面，car鉸鏈結(jié)構(gòu)域可包含在n297位置處具有針對(duì)氨基酸的與“q”具有相似性質(zhì)的(諸如s或t)的氨基酸取代的igg4-fc結(jié)構(gòu)域。在另外的方面，car鉸鏈結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型igg4-fc序列在對(duì)應(yīng)于l235和/或n297的位置處包含突變，并與seqidno：1或seqidno：10具有約90％同一性。

在某些特定方面，鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含與seqidno：1或seqidno：10的igg4-fc結(jié)構(gòu)域、seqidno：20的cd8α細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或seqidno：3的合成鉸鏈序列具有約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

c.跨膜結(jié)構(gòu)域

抗原特異性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域可通過跨膜結(jié)構(gòu)域連接?？捎米骺缒そY(jié)構(gòu)域的一部分的多肽序列包括但不限于人cd4跨膜結(jié)構(gòu)域、人cd28跨膜結(jié)構(gòu)域、跨膜人cd3ζ結(jié)構(gòu)域或半胱氨酸突變的人cd3ζ結(jié)構(gòu)域或來自其它人跨膜信號(hào)傳導(dǎo)蛋白(諸如cd16和cd8以及促紅細(xì)胞生成素受體)的其它跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些方面，例如，跨膜結(jié)構(gòu)域包含美國(guó)專利公布第2014/0274909號(hào)或美國(guó)專利第8,906,682號(hào)(均通過引用并入本文)中提供的序列之一。在某些具體方面，跨膜結(jié)構(gòu)域可與seqidno：19的cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域或seqidno：12的cd28跨膜結(jié)構(gòu)域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

d.細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

實(shí)施方案的嵌合抗原受體的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)激活經(jīng)工程化以表達(dá)嵌合抗原受體的免疫細(xì)胞的至少一種正常效應(yīng)子功能。術(shù)語“效應(yīng)子功能”是指分化細(xì)胞的特化功能。例如，t細(xì)胞的效應(yīng)可以是溶細(xì)胞活性或輔助細(xì)胞活性，包括細(xì)胞因子的分泌。初始t細(xì)胞、記憶或記憶型t細(xì)胞中的效應(yīng)子功能包括抗原依賴性增殖。因此，術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”是指轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號(hào)并引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行特化功能的蛋白質(zhì)的部分。在一些方面，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來源于天然受體的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。此類天然受體的實(shí)例包括t細(xì)胞受體的ζ鏈或任何其同源物(例如，η、δ、γ或ε)、mb1鏈、b29、fcriii、fcri和信號(hào)傳導(dǎo)分子的組合，諸如cd3ζ和cd28、cd27、4-1bb、dap-10、ox40及其組合，以及其它類似的分子和片段?？墒褂没罨鞍准易宓钠渌蓡T的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)部分，諸如fcγriii和fcεri。關(guān)于使用這些替代跨膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的t細(xì)胞受體的公開內(nèi)容，參見gross等(1992)，stancovski等(1993)，moritz等(1994)，hwu等(1995)，weijtens等(1996)和hekele等(1996)。雖然通常將使用完整的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但在許多情況下，不必使用完整的細(xì)胞內(nèi)多肽。在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分可被使用的程度上，只要其仍然轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號(hào)，就可使用此類截短部分替代完整鏈。因此，術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”意欲包括在car與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，人cd3ζ細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域用作用于實(shí)施方案的car的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

在具體實(shí)施方案中，car中的細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域例如包括t細(xì)胞抗原受體復(fù)合物的那些結(jié)構(gòu)域(諸如cd3的ζ鏈)，還有單獨(dú)的或與cd3ζ串聯(lián)的fcγriii共刺激信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、cd28、cd27、dap10、cd137、ox40、cd2。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(其可被稱為細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)包含tcrζ鏈、cd28、cd27、ox40/cd134、4-1bb/cd137、fcεriγ、icos/cd278、il-2rβ/cd122、il-2rα/cd132、dap10、dap12和cd40的一種或多種的部分或全部。在一些實(shí)施方案中，可在細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中使用內(nèi)源t細(xì)胞受體復(fù)合物的任何部分。可使用一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，因?yàn)槔缢^的第三代car具有融合在一起以獲得累加或協(xié)同作用的至少兩個(gè)或三個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

在一些實(shí)施方案中，car包含另外的其它共刺激結(jié)構(gòu)域。其它共刺激結(jié)構(gòu)域可以包括但不限于cd28、cd27、ox-40(cd134)、dap10和4-1bb(cd137)中的一種或多種。除了由cd3ζ引發(fā)的主要信號(hào)以外，由插入人car中的人共刺激受體提供的附加信號(hào)對(duì)于t細(xì)胞的完全活化是重要的，并且可以幫助改善體內(nèi)持久性和過繼性免疫療法的治療成功。

在某些特定方面，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含與seqidno：13的cd3ζ細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、seqidno：17的cd28細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或seqidno：15的cd137細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

iii.載體和細(xì)胞工程

在具體實(shí)施方案中，提供了分離的核酸區(qū)段和整合了編碼轉(zhuǎn)基因的dna序列的表達(dá)盒。例如，轉(zhuǎn)基因可編碼car多肽。在另外的方面，轉(zhuǎn)基因編碼靶抗原(或其表位)和/或hla多肽。在另外的方面，轉(zhuǎn)基因編碼線粒體報(bào)告轉(zhuǎn)基因，諸如包含線粒體定位信號(hào)的報(bào)告多肽(例如，熒光報(bào)告蛋白)。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，在一些情況下，可刪除編碼的轉(zhuǎn)基因末端處的幾個(gè)氨基酸的編碼序列。例如，在編碼car的轉(zhuǎn)基因的情況下，可以刪除car中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的幾個(gè)氨基酸(通常不超過10個(gè)，更通常地不超過5個(gè)殘基)的編碼序列，而不影響該分子的特異性或效應(yīng)物結(jié)合親和力。此外，可能期望在轉(zhuǎn)基因編碼序列的邊界引入少量氨基酸(通常不超過10個(gè)，更通常地不超過5個(gè)殘基)。氨基酸的缺失或插入可以是由于構(gòu)建、提供方便的限制性位點(diǎn)、易于操作、改善表達(dá)水平等的需要而引起的。另外，由于類似的原因，可發(fā)生不同氨基酸對(duì)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，通常取代不超過5個(gè)轉(zhuǎn)基因編碼序列(例如，在car的任何結(jié)構(gòu)域中)中的氨基酸。

可以以常規(guī)方式制備根據(jù)實(shí)施方案的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，可使用天然序列，適當(dāng)時(shí)，可分離和操作天然基因，以便允許各種組分的適當(dāng)聯(lián)接。例如，在car的情況下，可以通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)，使用合適的引物來分離編碼嵌合抗原受體的n末端和c末端蛋白質(zhì)組分的核酸序列，所述引物導(dǎo)致基因的不需要部分的刪除?；蛘撸寺』虻南拗菩韵捎糜诋a(chǎn)生嵌合構(gòu)建體。在任一情況下，可以選擇序列來提供平端化的，或具有互補(bǔ)重疊的限制性位點(diǎn)。

用于制備轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的各種操作可以在體外進(jìn)行，并且在特定實(shí)施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法將嵌合構(gòu)建體引入用于在適當(dāng)宿主中克隆和表達(dá)的載體。因此，在每次操作之后，克隆來自dna序列連接的所得構(gòu)建體，分離載體，篩選序列以確保序列編碼所需轉(zhuǎn)基因(例如，嵌合抗原受體)和表達(dá)控制序列。可通過限制性分析、測(cè)序等來篩選該序列。

實(shí)施方案的載體主要被設(shè)計(jì)來將所需基因遞送至免疫細(xì)胞，優(yōu)選免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)或apc，使之處于受調(diào)節(jié)的真核啟動(dòng)子的控制之下?？筛鶕?jù)實(shí)施方案使用的啟動(dòng)子包括例如mndu3啟動(dòng)子、cmv啟動(dòng)子、ef1α啟動(dòng)子或遍在蛋白啟動(dòng)子。此外，如果沒有其他原因，載體可含有選擇標(biāo)記，以便于它們?cè)隗w外的操作。在其它實(shí)施方案中，可以從從dna模板體外轉(zhuǎn)錄的mrna表達(dá)轉(zhuǎn)基因(例如，car)。

在根據(jù)實(shí)施方案使用的示例性核酸構(gòu)建體(多核苷酸)中，將啟動(dòng)子可操作地連接至編碼實(shí)施方案的轉(zhuǎn)基因的核酸序列，即將它們定位以促進(jìn)信使rna從編碼該轉(zhuǎn)基因的dna轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可具有基因組來源或是合成產(chǎn)生的。用于t細(xì)胞的各種啟動(dòng)子是本領(lǐng)域公知的(例如，marodon等(2003)公開的cd4啟動(dòng)子))。例如，啟動(dòng)子可以是組成型或誘導(dǎo)型的，其中誘導(dǎo)與特定細(xì)胞類型或特定成熟水平相關(guān)。或者，許多公知的病毒啟動(dòng)子也是合適的。目標(biāo)啟動(dòng)子包括β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、sv40早期和晚期啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和friend脾病灶形成病毒啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以與增強(qiáng)子相關(guān)聯(lián)，也可以不與增強(qiáng)子相關(guān)聯(lián)，其中增強(qiáng)子可天然地與特定啟動(dòng)子或與不同啟動(dòng)子相關(guān)聯(lián)。

編碼轉(zhuǎn)基因的開放閱讀框的序列可獲自基因組dna來源、cdna來源，或可合成(例如，通過pcr)或其組合。取決于基因組dna的大小和內(nèi)含子的數(shù)量，可能希望使用cdna或其組合，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)內(nèi)含子穩(wěn)定mrna或提供t細(xì)胞特異性表達(dá)(barthel和geldfeld，2003)。此外，還可有利的是使用內(nèi)源或外源非編碼區(qū)穩(wěn)定mrna。

為了表達(dá)實(shí)施方案的轉(zhuǎn)基因，編碼轉(zhuǎn)基因的核酸序列的天然存在的或內(nèi)源轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域可用于在目標(biāo)宿主中產(chǎn)生嵌合抗原受體?；蛘?，可使用允許組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的外源轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(例如，tet-on或tet-off啟動(dòng)子系統(tǒng))，其中可根據(jù)目標(biāo)宿主、所需表達(dá)水平、目標(biāo)宿主的性質(zhì)等控制表達(dá)。

同樣地，在一些情況下，可使用將由轉(zhuǎn)基因編碼的多肽引導(dǎo)至細(xì)胞表面的信號(hào)序列。在一些情況下，信號(hào)序列是存在于轉(zhuǎn)基因的天然形式中的信號(hào)序列。任選地，在一些情況下，可能需要將該序列與不同的信號(hào)序列交換。然而，選定的信號(hào)序列應(yīng)與用于表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)的分泌途徑相容，以使得轉(zhuǎn)基因存在于細(xì)胞表面。

類似地，終止區(qū)可由轉(zhuǎn)基因的天然形式的天然存在或內(nèi)源轉(zhuǎn)錄終止區(qū)提供。或者，終止區(qū)可來源于不同的來源導(dǎo)。在大多數(shù)情況下，終止區(qū)的來源通常被認(rèn)為對(duì)于重組蛋白的表達(dá)不至關(guān)重要的，并且可以使用多種終止區(qū)，而不會(huì)不利地影響表達(dá)。

預(yù)期可將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，諸如car表達(dá)構(gòu)建體作為裸露dna或于合適的載體中引入受試者自己的細(xì)胞(或引入來自不同供體受試者的細(xì)胞)。使用裸dna通過電穿孔來穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞諸如t細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如，美國(guó)專利第6,410,319號(hào)(通過引用并入本文)。裸露dna通常是指以用于表達(dá)的正確取向包含在質(zhì)粒表達(dá)載體中的本實(shí)施方案的編碼轉(zhuǎn)基因(例如，嵌合抗原受體)的dna。有利地，裸露dna的使用可減少產(chǎn)生表達(dá)實(shí)施方案的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞所需的時(shí)間。

在另外的方面，可使用基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體引入細(xì)胞，以介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因(例如，car)構(gòu)建體整合至細(xì)胞的基因組dna中。通常，此類方法將涉及將(i)編碼轉(zhuǎn)座酶(或轉(zhuǎn)座酶多肽)的第一載體和(ii)編碼側(cè)連轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列的所需轉(zhuǎn)基因表達(dá)元件的第二載體引入細(xì)胞。轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座元件包括在其上游和下游具有末端重復(fù)序列的(短)核酸序列，并編碼有助于將核酸切除并插入靶dna序列的酶。幾種轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)已適用于異源dna序列的遺傳插入，包括睡眠美人(sb)，來自魚的tc1/mariner樣元件(其在多種脊椎動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞系和胚胎干細(xì)胞中以及在體內(nèi)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)座活性(ivics等，1997))。在美國(guó)專利第6,489,458號(hào)、第7,148,203號(hào)、第8,227,432號(hào)、美國(guó)專利公布第2011/0117072號(hào)；mates等，2009中和ivics等，1997中(所述專利、專利公布和文獻(xiàn)的每一篇通過引用整體并入本文)提供了另外的轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。

或者，可使用病毒載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體或慢病毒載體)將轉(zhuǎn)基因引入細(xì)胞。根據(jù)實(shí)施方案的方法使用的合適載體在受試者的細(xì)胞中是非復(fù)制的。已知大量基于病毒的載體，其中在細(xì)胞中維持的病毒拷貝數(shù)足夠低以維持細(xì)胞的存活力。舉例說明性載體包括本文公開的pfb-neo載體以及基于hiv、sv40、ebv、hsv或bpv的載體。

iv.免疫效應(yīng)細(xì)胞

在某些方面，本文所述的實(shí)施方案包括制備和/或擴(kuò)增抗原特異性重定向的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞、nk細(xì)胞或nkt細(xì)胞)的方法，其包括用含有編碼car的dna(或rna)構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后，任選地，用飼養(yǎng)細(xì)胞、重組抗原或受體的抗體刺激細(xì)胞以引起細(xì)胞增殖。在某些方面，經(jīng)工程化以表達(dá)car的細(xì)胞(或細(xì)胞群)是干細(xì)胞、ips細(xì)胞、免疫細(xì)胞或這些細(xì)胞的前體。下面描述的方法涉及用于car表達(dá)的t細(xì)胞(或其它免疫細(xì)胞)工程的具體實(shí)例。

免疫效應(yīng)細(xì)胞的來源包括同種異體和自體來源。在一些情況下，免疫效應(yīng)細(xì)胞可從干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)分化而來。因此，可從臍帶血、外周血、人胚胎干細(xì)胞或ipsc分離根據(jù)實(shí)施方案的用于工程的細(xì)胞。例如，同種異體t細(xì)胞可被修飾來包括嵌合抗原受體(并且任選地，缺乏功能性tcr)。在一些方面，免疫效應(yīng)細(xì)胞是原代人t細(xì)胞，諸如來源于人外周血單核細(xì)胞(pbmc)的t細(xì)胞、用g-csf刺激后收集的pbmc、骨髓或臍帶血。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，利用car表達(dá)構(gòu)建體)后，可立即輸注細(xì)胞或可以儲(chǔ)存細(xì)胞。在某些方面，在轉(zhuǎn)染后，可將細(xì)胞離體繁殖數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月，在基因轉(zhuǎn)移入細(xì)胞后約1天、2天、3天、4天、5天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)繁殖為大量群體。在另外的方面，轉(zhuǎn)染后，克隆轉(zhuǎn)染子，離體擴(kuò)增顯示存在單一整合的或以附加體維持的表達(dá)盒或質(zhì)粒以及表達(dá)嵌合抗原受體的克隆。選擇用于擴(kuò)增的克隆顯示出特異性識(shí)別和裂解表達(dá)抗原的靶細(xì)胞的能力。重組t細(xì)胞可通過用il-2或結(jié)合常用γ-鏈的其它細(xì)胞因子(例如，il-7、il-12、il-15、il-21等)刺激來擴(kuò)增?？赏ㄟ^在人工抗原呈遞細(xì)胞上刺激擴(kuò)增重組t細(xì)胞?？稍谌斯た乖蔬f細(xì)胞上，或用與t細(xì)胞表面上的cd3交聯(lián)的抗體(諸如okt3)擴(kuò)增重組t細(xì)胞?？稍谌斯た乖蔬f細(xì)胞上或用結(jié)合t細(xì)胞表面上的cd52的抗體(例如campath)刪除重組t細(xì)胞的亞群。在另一方面，可被冷凍保存遺傳修飾的細(xì)胞。

在另外的方面，已選擇了實(shí)施方案的免疫效應(yīng)細(xì)胞的高線粒體備用呼吸容量(src)。如本文中所用，“具有高線粒體src的免疫效應(yīng)細(xì)胞”是指具有比相應(yīng)的平均免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)更高的線粒體活性或線粒體數(shù)目的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)。因此，在一些方面，實(shí)施方案的細(xì)胞組合物包含具有高線粒體src的免疫效應(yīng)細(xì)胞群，例如具有高線粒體src的表達(dá)car的t細(xì)胞群。

具有高線粒體src的免疫效應(yīng)細(xì)胞(諸如cd8⁺t細(xì)胞)可在應(yīng)激條件(諸如高腫瘤負(fù)荷、缺氧、缺乏用于糖酵解的營(yíng)養(yǎng)物或抑制性細(xì)胞因子環(huán)境)下相對(duì)于具有較低src的細(xì)胞表現(xiàn)出增加的存活率。此外，選擇用于高線粒體src的免疫效應(yīng)細(xì)胞甚至可在應(yīng)激條件下保留細(xì)胞毒活性。因此，通過選擇具有高線粒體src的免疫效應(yīng)細(xì)胞，可產(chǎn)生用于治療和用于car構(gòu)建體測(cè)試的改善的細(xì)胞組合物。

在一個(gè)方面，提供了包含可用于測(cè)定轉(zhuǎn)基因效應(yīng)細(xì)胞的線粒體src的報(bào)告分子的轉(zhuǎn)基因免疫效應(yīng)細(xì)胞。例如，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可包含與線粒體定位信號(hào)連接的報(bào)告多肽。例如，報(bào)告子可以是熒光多肽，諸如增強(qiáng)的黃色熒光蛋白(yfp)或增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(egfp)，線粒體定位信號(hào)可來自谷氧還蛋白(grx2)。在本文中，熒光報(bào)告子鑒定了具有高線粒體src的car+t細(xì)胞。例如，可基于強(qiáng)度熒光分選表達(dá)報(bào)告子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，并輸注其以在體內(nèi)殺傷腫瘤。同樣地，可測(cè)試轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的靶細(xì)胞的離體殺傷，以測(cè)定例如候選car多肽的治療功效。

在一些方面，根據(jù)實(shí)施方案使用的線粒體報(bào)告基因可以是內(nèi)源基因。在另外的方面，線粒體報(bào)告基因可以是外源基因，諸如編碼熒光報(bào)告蛋白的基因。在一些方面，熒光報(bào)告蛋白可包含線粒體定位序列。在某些方面，用于選擇具有高src的免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法可包括流式細(xì)胞術(shù)或facs。

在某些方面，用于鑒定具有src的免疫效應(yīng)細(xì)胞的報(bào)告基因的表達(dá)可處于核啟動(dòng)子(例如，hef1a)的控制之下。在某些方面，報(bào)告基因的表達(dá)可處于線粒體啟動(dòng)子的控制之下。在某些方面，表達(dá)的報(bào)告蛋白可包含線粒體定位序列。在某些方面，表達(dá)的報(bào)告蛋白可被引導(dǎo)至細(xì)胞表面。在某些方面，報(bào)告基因的表達(dá)可處于線粒體啟動(dòng)子的控制之下，并且表達(dá)的報(bào)告蛋白可被引導(dǎo)至細(xì)胞表面。在一些方面，外源報(bào)告基因可側(cè)接轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列或病毒ltr。在一些方面，可將外源報(bào)告基因包含在染色體外核酸諸如mrna或附加型載體中。

v.用于繁殖免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法

在一些情況下，將實(shí)施方案的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)與活化和繁殖細(xì)胞(aapc)共培養(yǎng)以幫助細(xì)胞擴(kuò)增。例如，抗原呈遞細(xì)胞(apc)可用于制備實(shí)施方案的治療性組合物和細(xì)胞治療產(chǎn)品。關(guān)于抗原呈遞系統(tǒng)的制備和使用的一般指導(dǎo)，參見例如，美國(guó)專利第6,225,042號(hào)、第6,355,479號(hào)、第6,362,001號(hào)和第6,790,662號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng)公布第2009/0017000號(hào)和第2009/0004142號(hào)，以及國(guó)際公布第wo2007/103009號(hào)，所述專利或申請(qǐng)公布的每一篇通過引用并入。

在一些情況下，將aapc與最佳長(zhǎng)度的肽一起溫育，這允許所述肽直接結(jié)合于mhc分子而無需額外的加工?；蛘撸?xì)胞可以表達(dá)目標(biāo)抗原(即，在不依賴于mhc的抗原識(shí)別的情況下)。此外，在一些情況下，apc可表達(dá)通常與特定car多肽或多種car多肽結(jié)合的抗體(例如，通用活化和繁殖細(xì)胞(uapc))。此類方法公開于國(guó)際((pct)專利公布第wo/2014/190273號(hào)(其通過引用并入本文)中。除了肽-mhc分子或抗原以外，aapc系統(tǒng)還可包含至少一種外源性輔助分子?？墒褂幂o助分子的任何合適數(shù)量和組合。輔助分子可選自多種輔助分子諸如共刺激分子和粘附分子，示例性共刺激分子包括cd70和b7.1(b7.1以前稱為b7，也稱為cd80)，除其它以外，其與t細(xì)胞表面的cd28和/或ctla-4分子結(jié)合，從而影響例如t細(xì)胞擴(kuò)增、th1分化、短期t細(xì)胞存活和細(xì)胞因子分泌，諸如白細(xì)胞介素(il)-2(參見kim等，2004)。粘附分子可包括碳水化合物結(jié)合糖蛋白，諸如選擇蛋白、跨膜結(jié)合糖蛋白諸如整聯(lián)蛋白、鈣依賴性蛋白諸如鈣粘蛋白，和單次跨膜免疫球蛋白(ig)超家族蛋白，諸如細(xì)胞間粘附分子(icam)，其促進(jìn)，例如，細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)的接觸。示例性粘附分子包括lfa-3和icam，諸如icam-1。在例如美國(guó)專利第6,225,042號(hào)、第6,355,479號(hào)和第6,362,001號(hào)(通過引用并入本文)中例舉了用于選擇、克隆、制備和表達(dá)示范性輔助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技術(shù)、方法和試劑。

被選擇成為aapc的細(xì)胞優(yōu)選在細(xì)胞內(nèi)抗原加工、細(xì)胞內(nèi)肽運(yùn)輸和/或細(xì)胞內(nèi)mhci類或ii類分子-肽負(fù)載中具有缺陷，或者是變溫的(即，對(duì)溫度攻擊不如哺乳動(dòng)物胞系敏感)，或具有缺陷和變溫特性。優(yōu)選地，被選擇成為aapc的細(xì)胞也缺乏表達(dá)至少一種針對(duì)外源mhci類或ii類分子和被引入細(xì)胞的輔助分子組分的內(nèi)源對(duì)應(yīng)物(例如，如上所述的內(nèi)源mhci類或ii類分子和/或內(nèi)源輔助分子)的能力。此外，aapc優(yōu)選在它們的修飾(以產(chǎn)生aapc)之前保留由細(xì)胞具有的缺陷和變溫特性。示例性aapc構(gòu)建與抗原加工(tap)缺陷型細(xì)胞系諸如昆蟲細(xì)胞系相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或來源于其。示例性變溫昆蟲細(xì)胞系是果蠅細(xì)胞系，諸如schneider2細(xì)胞系(參見例如schneider1972)。在美國(guó)專利第6,225,042號(hào)、第6,355,479號(hào)和第6,362,001號(hào)中提供了用于schneider2細(xì)胞的制備、生長(zhǎng)和培養(yǎng)的舉例說明性方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，還將aapc經(jīng)受凍融循環(huán)。在示例性的凍融循環(huán)中，可通過使含有aapc的合適容器與適量的液氮、固體二氧化碳(即，干冰)或類似的低溫材料接觸來冷凍aapc，以使得冷凍迅速發(fā)生。然后，通過從低溫材料中取出aapc并暴露于環(huán)境室溫條件下，或通過其中使用溫水浴或溫暖的手以促進(jìn)較短的解凍時(shí)間的促進(jìn)解凍法來將冷凍的apc解凍。另外，可冷凍aapc，并在解凍之前將其儲(chǔ)存延長(zhǎng)的時(shí)期。還可將冷凍的aapc解凍，然后在進(jìn)一步使用之前凍干。優(yōu)選地，在含有經(jīng)歷凍融循環(huán)的aapc的介質(zhì)中不存在可不利地影響凍融過程的防腐劑，諸如二甲基亞砜(dmso)、聚乙二醇(peg)和其它防腐劑，或所述防腐劑基本上被去除，諸如通過將aapc轉(zhuǎn)移至基本上不含此類防腐劑的介質(zhì)中。

在另外的實(shí)施方案中，可通過交聯(lián)使異種核酸和對(duì)于aapc是內(nèi)源的核酸失活，以使得在滅活后基本上無細(xì)胞生長(zhǎng)、核酸復(fù)制或表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在外源mhc和輔助分子表達(dá)后，在此類分子在aapc表面上呈遞后，以及在用所選擇的肽或多種肽負(fù)載所呈遞的mhc分子后的點(diǎn)上滅活aapc。因此，此類滅活和選擇的肽負(fù)載的aapc，雖然基本上不能增殖或復(fù)制，但保留所選擇的肽呈遞功能。優(yōu)選地，交聯(lián)還產(chǎn)生基本上不含污染性微生物諸如細(xì)菌和病毒的aapc，而不顯著降低aapc的抗原呈遞細(xì)胞功能。因此，交聯(lián)維持重要的aapc功能，同時(shí)有助于減輕對(duì)使用aapc開發(fā)的細(xì)胞治療產(chǎn)品的安全性的擔(dān)憂。關(guān)于與交聯(lián)和aapc相關(guān)的方法，參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)公布第20090017000號(hào)，其通過引用并入本文。

在某些情況下，可通過在用作治療劑之前，使用熒光報(bào)告蛋白，使用facs基于它們的線粒體強(qiáng)度(或細(xì)胞的總線粒體含量)來分選經(jīng)car修飾的細(xì)胞。

vi.工程化的抗原呈遞細(xì)胞

在某些實(shí)施方案中，還提供了工程化的抗原呈遞細(xì)胞(apc)?？梢岳?，如上所述，使用此類細(xì)胞來離體繁殖免疫效應(yīng)細(xì)胞。在另外的方面，工程化的acp本身可被施用于患者，從而在體內(nèi)刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)增。實(shí)施方案的工程化的apc本身可用作治療劑。在一些實(shí)施方案中，工程化的apc可用作治療劑，其可刺激對(duì)于靶抗原是特異的內(nèi)源免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化和/或增加對(duì)于靶抗原是特異的過繼轉(zhuǎn)移的免疫效應(yīng)細(xì)胞的活性或持久性。

如本文中所用，術(shù)語“工程化的apc”是指包含至少編碼人白細(xì)胞抗原(hla)的第一轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。suvch工程化的apc還可包含用于表達(dá)抗原的第二轉(zhuǎn)基因，以使得抗原存在于與hla復(fù)合的apc表面上。在一些方面，工程化的apc可以是呈遞抗原的細(xì)胞類型(例如，樹突狀細(xì)胞)。在另外的方面，可以從通常不呈遞抗原的細(xì)胞類型(諸如t細(xì)胞或t細(xì)胞祖細(xì)胞(稱為“t-apc”))產(chǎn)生工程化的apc。因此，在一些方面，實(shí)施方案的工程化的apc包含編碼靶抗原的第一轉(zhuǎn)基因和編碼hla的第二轉(zhuǎn)基因，以使得hla在與靶抗原的表位復(fù)合的工程化的apc表面上表達(dá)。在某些特定方面，在工程化的apc中表達(dá)的hla是hla-a、hla-b、hla-c或hla-drb1。在另外的方面，在工程化的apc中表達(dá)的hla是hla-a2。

在一些方面，實(shí)施方案的工程化的apc還可包含至少編碼共刺激分子的第三轉(zhuǎn)基因。共刺激分子可以是可為膜結(jié)合的cγ細(xì)胞因子的共刺激細(xì)胞因子。在某些方面，共刺激細(xì)胞因子是il-15，諸如膜結(jié)合的il-15。在一些其它方面，工程化的apc可包含編輯的(或刪除的)基因。例如，可以編輯抑制性基因諸如pd-1、lim-3、ctla-4或tcr，以減少或消除該基因的表達(dá)。

實(shí)施方案的工程化的apc可包含編碼任何目標(biāo)靶抗原的轉(zhuǎn)基因。例如，靶抗原可為感染性疾病抗原或腫瘤相關(guān)抗原(taa)。靶抗原可以是細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面抗原。例如，在一些方面，靶抗原是taa，諸如源自腫瘤細(xì)胞的亞細(xì)胞區(qū)室的taa。taa可以是膜結(jié)合的、細(xì)胞質(zhì)的、核定位的或甚至由腫瘤細(xì)胞分泌的。在一些方面，與相應(yīng)的正常組織相比，taa差異表達(dá)，從而允許免疫效應(yīng)細(xì)胞優(yōu)先識(shí)別腫瘤細(xì)胞。靶抗原的具體實(shí)例包括但不限于wt1、muc1、lmp2、hpve6e7、egfrviii、her-2/neu、獨(dú)特型、magea3、p53非突變體、ny-eso-1、psma、gd2、cea、melana/mart1、ras突變體、gp100、p53突變體、蛋白酶3(pr1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、psa、htert、肉瘤易位斷裂點(diǎn)、epha2、pap、ml-iap、afp、epcam、erg(tmprss2ets融合基因)、na17、pax3、alk、雄激素受體、細(xì)胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mcn、rhoc、trp-2、gd3、巖藻糖基gm1、間皮素、psca、magea1、sle(a)、cyp1b1、plac1、gm3、boris、tn、globoh、etv6-aml、ny-br-1、rgs5、sart3、stn、碳酸酐酶ix、pax5、ot-tes1、精子蛋白17、lck、hmwmaa、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、legumain、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-1、fap、pdgfr-β、mad-ct-2和fos相關(guān)抗原1。

在一些具體方面，實(shí)施方案的工程化的apc是被經(jīng)工程化以用作抗原呈遞細(xì)胞的t細(xì)胞(稱為“t-apc”)。具體地，實(shí)施方案的t-apc包含編碼靶抗原的第一轉(zhuǎn)基因和編碼hla的第二轉(zhuǎn)基因。因此，t-apc可以呈現(xiàn)編碼的抗原，諸如taa。例如，本文例舉的t-apc包含編碼ny-es0-1抗原和hla-a2的轉(zhuǎn)基因。因此，這些細(xì)胞可用于離體或體內(nèi)(在被施用于患者之后)繁殖ny-eso-1特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞。此外，本文所例舉的t-apc可被進(jìn)一步工程化來表達(dá)另外的共刺激分子，特別是膜結(jié)合的il-15(mil-15)。所述額外的共刺激分子進(jìn)一步改善靶抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生并增加這些細(xì)胞的持久性。

vii.治療應(yīng)用

在一些方面，實(shí)施方案的嵌合抗原受體構(gòu)建體和細(xì)胞通過減小這些受試者中的腫瘤的尺寸或阻止腫瘤的生長(zhǎng)或再生長(zhǎng)，應(yīng)用于患有或懷疑患有癌癥的受試者。因此，本文提供的實(shí)施方案還涉及這樣的方法，所述方法通過將本實(shí)施方案的嵌合抗原受體構(gòu)建體引入受試者的分離的t細(xì)胞并將所述轉(zhuǎn)化的t細(xì)胞重新引入受試者中(從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤反應(yīng)以減少或消除受試者中的腫瘤)來減少受試者中的腫瘤生長(zhǎng)或阻止腫瘤形成?？墒褂玫暮线m的t細(xì)胞包括細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(ctl)或具有需要破壞的t細(xì)胞受體的任何細(xì)胞。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，各種方法可容易地獲得用于從受試者中分離這些細(xì)胞。例如，使用細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)或使用市售的試劑盒(例如，來自pierce，rockford，ill的isocell^tm)。

一旦確定轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)導(dǎo)的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)能夠以所需的調(diào)節(jié)和期望的水平將嵌合抗原受體表達(dá)為表面膜蛋白，則可確定嵌合抗原受體在宿主細(xì)胞中是否具有提供所需的信號(hào)誘導(dǎo)的功能。隨后，將所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的免疫效應(yīng)細(xì)胞重新引入或施用于受試者以激活受試者中的抗腫瘤反應(yīng)。為了便于施用，可用還可以是藥學(xué)上可接受的適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋劑將根據(jù)實(shí)施方案的轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞制備成藥物組合物或制成適于在體內(nèi)施用的植入物。制備此類組合物或植入物的方法已在本領(lǐng)域中進(jìn)行了描述(參見例如，remington′spharmaceuticalsciences，第16版，mack，編輯(1980))。適當(dāng)時(shí)，可以以通常的方式將轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞配制成半固體或液體形式的制劑，諸如膠囊、溶液、注射劑、吸入劑或氣溶膠。本領(lǐng)域已知的方法可用于在其到達(dá)靶組織或器官之前防止或最小化組合物的釋放和吸收，或確保組合物的定時(shí)釋放。然而，理想地使用不會(huì)影響表達(dá)嵌合抗原受體的細(xì)胞的藥學(xué)上可接受的形式。因此，理想地，可將轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞制成含有平衡鹽溶液，優(yōu)選hanks平衡鹽溶液或生理鹽水的藥物組合物。

在某些實(shí)施方案中，將實(shí)施方案的表達(dá)car的細(xì)胞遞送至有此需要的個(gè)體，諸如患有癌癥或感染的個(gè)體。然后細(xì)胞增強(qiáng)個(gè)體的免疫系統(tǒng)以攻擊相應(yīng)的癌癥或病原體感染的細(xì)胞。在一些情況下，給個(gè)體提供一個(gè)或多個(gè)劑量的抗原特異性car細(xì)胞。在其中給個(gè)體提供兩個(gè)或更多個(gè)劑量的抗原特異性car細(xì)胞的情況下，施用之間的持續(xù)時(shí)間應(yīng)足以允許在個(gè)體中繁殖的時(shí)間，并且在具體實(shí)施方案中，劑量之間的持續(xù)時(shí)間為1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更多天。用于獲得治療作用的合適劑量為例如優(yōu)選在一系列給藥周期中每劑量至少10⁵個(gè)或約10⁵個(gè)至約10¹⁰個(gè)細(xì)胞。示例性給藥方案由4個(gè)一周的遞增劑量的給藥周期組成，始于第0天的至少約10⁵個(gè)細(xì)胞，例如在起始患者內(nèi)劑量遞增方案的數(shù)周內(nèi)逐漸增加至高達(dá)約10¹⁰個(gè)細(xì)胞的目標(biāo)劑量。合適的施用模式包括靜脈內(nèi)、皮下、腔內(nèi)(例如通過儲(chǔ)存器進(jìn)入裝置)、腹膜內(nèi)注射和至腫瘤塊內(nèi)的直接注射。

實(shí)施方案的藥物組合物(例如，包含表達(dá)car的t細(xì)胞)可以單獨(dú)使用或與用于治療癌癥的其它良好建立的試劑組合使用。無論單獨(dú)遞送還是與其它藥物組合遞送，實(shí)施方案的藥物組合物可通過各種途徑遞送至哺乳動(dòng)物，特別是人體內(nèi)的各個(gè)部位，以獲得特定作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，盡管可使用不止一種途徑來施用，但特定途徑可提供比另一種途徑更直接且更有效的反應(yīng)。例如，真皮內(nèi)遞送可用于治療黑素瘤。局部或全身性遞送可通過將制劑施用(包括敷用或滴注)入體腔、吸入或吹入氣霧劑，或通過腸胃外導(dǎo)入(包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、肝門靜脈內(nèi)、肝內(nèi)、腹膜、皮下或真皮內(nèi)施用)來實(shí)現(xiàn)。

實(shí)施方案的組合物可以以單位劑量形式提供，其中每個(gè)劑量單位，例如注射液，單獨(dú)地或與其它活性劑適當(dāng)組合地含有預(yù)定量的組合物。本文所用的術(shù)語單位劑型是指適合作為人和動(dòng)物受試者的單位劑量的物理上離散的單位，每個(gè)單位單獨(dú)地或與其它活性劑組合地含有預(yù)定量(以足以在適當(dāng)?shù)那闆r下與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或媒介物結(jié)合產(chǎn)生所需作用的量計(jì)算的)的實(shí)施方案的組合物。實(shí)施方案的新型單位劑型的規(guī)格取決于特定受試者中的與藥物組合物相關(guān)的特定藥效學(xué)。

理想地，有效量或足夠數(shù)量的分離的轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞存在于組合物中并被引入受試者中，以使得建立長(zhǎng)期特異性的抗腫瘤反應(yīng)來減少腫瘤的尺寸或消除腫瘤增長(zhǎng)或再生長(zhǎng)，否則將不產(chǎn)生此類治療。理想地，當(dāng)與其中不存在轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞的在其它方面相同的條件相比，重新引入到受試者中的轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞的量導(dǎo)致腫瘤尺寸的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％減小。如本文中所用，術(shù)語“抗腫瘤有效量”是指減少受試者的癌細(xì)胞或腫瘤生長(zhǎng)的表達(dá)car的免疫效應(yīng)細(xì)胞的有效量。

因此，所施用的轉(zhuǎn)導(dǎo)的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)的量應(yīng)考慮給藥途徑，并且應(yīng)當(dāng)使得足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)導(dǎo)的免疫效應(yīng)細(xì)胞被引入以達(dá)到所需的治療反應(yīng)。此外，包含在本文所述的組合物中的每種活性劑的量(例如，每待接觸的每種細(xì)胞的量或每一定體重的量)可在不同的應(yīng)用中變化。通常，轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞的濃度理想地應(yīng)該足以在被治療的受試者中提供至少約1×10⁶至1×10⁹個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞，甚至更理想地，約1×10⁷至約5×10⁸個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞，雖然可使用高于，例如大于5×10⁸個(gè)細(xì)胞，或低于，例如小于1×10⁷個(gè)細(xì)胞的任何合適的量。給藥方案可基于良好建立的基于細(xì)胞的療法(參見例如，topalian和rosenberg，1987；美國(guó)專利第4,690,915號(hào))，或者可采用替代的連續(xù)輸注策略。

這些值提供了在優(yōu)化實(shí)施方案的方法時(shí)由實(shí)踐者使用的轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞的范圍的一般指導(dǎo)。此類范圍在本文中的引述絕不排除較高或較低量的組分的使用，這在特定應(yīng)用中可能是有必要的。例如，實(shí)際劑量和時(shí)間安排可取決于組合物是否與其它藥物組合物組合施用，或取決于藥代動(dòng)力學(xué)、藥物處置和代謝的個(gè)體差異而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)特定情況的緊急情況進(jìn)行任何必要的調(diào)整。

vii.實(shí)施方案的試劑盒

可將本文所述的任何組合物包含在試劑盒中。在一些實(shí)施方案中，在試劑盒中提供同種異體cart細(xì)胞，所述試劑盒還可包括適合于擴(kuò)增細(xì)胞的試劑，諸如培養(yǎng)基、apc、工程化的apc、生長(zhǎng)因子、抗體(例如，用于分選或表征cart細(xì)胞)和/或編碼轉(zhuǎn)基因諸如靶抗原、hla、線粒體報(bào)告子、car或轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒。

在非限制性實(shí)例中，嵌合抗原受體表達(dá)構(gòu)建體、用于產(chǎn)生嵌合抗原受體表達(dá)構(gòu)建體的一種或多種試劑、用于表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和/或獲得用于表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染的同種異體細(xì)胞的一種或多種儀器(此類儀器可以是注射器、移液管、鑷子和/或任何此類醫(yī)學(xué)上認(rèn)可的裝置)。

在一些實(shí)施方案中，在試劑盒中提供了用于消除內(nèi)源性tcrα/β表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體，產(chǎn)生構(gòu)建體的一種或多種試劑，和/或在試劑盒中提供了car+t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，包括編碼鋅指核酸酶的表達(dá)構(gòu)建體。

在一些方面，試劑盒包含用于細(xì)胞的電穿孔的試劑或裝置。

試劑盒可包含一種或多種適當(dāng)?shù)确值膶?shí)施方案的組合物或產(chǎn)生實(shí)施方案的組合物的試劑。可將試劑盒的組分包裝在水性介質(zhì)中或以凍干形式包裝其。試劑盒的容器裝置可包括至少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其它容器裝置，其中可以放置組分(優(yōu)選適當(dāng)?shù)氐确值?。當(dāng)試劑盒中存在不止一種組分時(shí)，則試劑盒通常還將含有第二、第三或其它附加容器，可將附加組分分開放置在所述容器中。然而，可將組分的各種組合包含在小瓶中。實(shí)施方案的試劑盒通常還將包括用于容納嵌合抗原受體構(gòu)建體的裝置和用于商業(yè)銷售的嚴(yán)密封閉的任何其它試劑容器。此類容器可包括例如注射或吹塑塑料容器(將所需小瓶保留在其中)。

viii.實(shí)施例

通過參考以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案。提供這些實(shí)施例僅是為了說明的目的，并且除非另有說明，否則不旨在限制。因此，本發(fā)明絕不應(yīng)被解釋為限于以下實(shí)施例，而應(yīng)理解為包括由于本文提供的教導(dǎo)而變得顯而易見的任何和所有變化。

實(shí)施例1-fc受體對(duì)car的結(jié)合與快速cart細(xì)胞清除有關(guān)

研究了fc受體與car多肽結(jié)合在cart細(xì)胞持久性中的作用。對(duì)于初步研究，研究了被靶向cd19受體的car構(gòu)建體。cart細(xì)胞表達(dá)cd19rcd28構(gòu)建體，其包含cd19結(jié)合結(jié)構(gòu)域(vl/vh)、鉸鏈結(jié)構(gòu)域(igg4-fc)、跨膜結(jié)構(gòu)域(cd28tm)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(cd28-cd3ζ)(參見圖1)。使用介導(dǎo)構(gòu)建體的基因組整合(參見例如，國(guó)際(pct)申請(qǐng)第pct/us14/38005號(hào)，通過引用并入本文)的基于睡美人的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(sleepingbeauty-basedtransposonsystem)，經(jīng)由電穿孔將car構(gòu)建體引入細(xì)胞。然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析產(chǎn)生的cart細(xì)胞以評(píng)估car多肽表達(dá)。發(fā)現(xiàn)car多肽在轉(zhuǎn)染后高效表達(dá)，并且在與k562aapc共培養(yǎng)28天后，高比例的所得細(xì)胞群對(duì)于car表達(dá)呈陽性(圖2a)。流式細(xì)胞術(shù)研究還表明，一部分cart細(xì)胞在體外被fcγr2a結(jié)合，表明fc受體的結(jié)合可能在體內(nèi)影響casrt細(xì)胞，并且可在持久性cart細(xì)胞中起作用。

也在攜帶cd19陽性腫瘤的小鼠中完成了研究。簡(jiǎn)言之，用海腎熒光素酶(hrluc)⁺nalm6腫瘤細(xì)胞注射nsg小鼠，然后單次注射cd19rcd28t細(xì)胞(或?qū)φ兆⑸?。經(jīng)由隨時(shí)間推移的成像測(cè)量與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的生物發(fā)光。如圖3a-b所示，雖然cart細(xì)胞最初能夠控制腫瘤生長(zhǎng)(第21天時(shí)間點(diǎn))，但在注射后第28天，即使在處理的動(dòng)物中，腫瘤的外生長(zhǎng)也是非常明顯的。該作用可能與例如因fcr結(jié)合引起的t細(xì)胞的體內(nèi)持久性相關(guān)。因此，通過包含fc受體結(jié)合元件，可以限制car多肽的體內(nèi)持久性(和潛在毒性)。

實(shí)施例2-具有減少的fc受體結(jié)合的car多肽

已產(chǎn)生不同cart細(xì)胞構(gòu)建體的陣列來調(diào)節(jié)fc受體與cart細(xì)胞的結(jié)合。測(cè)試的構(gòu)建體示于圖4中。具體地，在許多不同的跨膜和細(xì)胞內(nèi)/信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的背景中測(cè)試了不同的鉸鏈序列。圖5中所示的流式細(xì)胞術(shù)研究表明，所有測(cè)試的構(gòu)建體在轉(zhuǎn)染的t細(xì)胞(如上所述，通過電穿孔，使用用于整合car受體構(gòu)建體的基于睡美人的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)完成轉(zhuǎn)染、)中高效表達(dá)。同樣地，在與k562aapc共培養(yǎng)28天后，高比例的所得t細(xì)胞呈car受體陽性(圖5)。與k562aapc共培養(yǎng)的cart細(xì)胞擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)示于圖7中，并證明所有cart細(xì)胞以相似的效率擴(kuò)增。

接下來，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試cart細(xì)胞的體外fc受體結(jié)合。如圖6所示，當(dāng)包含人igg4鉸鏈序列的cart細(xì)胞被fc受體(具體地被fcγr2a)結(jié)合時(shí)，表達(dá)具有l(wèi)235e和n297q取代的突變型igg4鉸鏈的細(xì)胞顯示出顯著更少的對(duì)fc受體的結(jié)合。

然后評(píng)估表達(dá)每種測(cè)試的car構(gòu)建體的cart細(xì)胞的靶向cd19陽性腫瘤細(xì)胞的能力。在圖8-9所示的研究中，在離體實(shí)驗(yàn)中測(cè)試cart細(xì)胞裂解靶細(xì)胞(圖8)或響應(yīng)于靶細(xì)胞產(chǎn)生ifnγ(圖9)的能力。在這些研究之后進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以測(cè)定各種cart細(xì)胞控制小鼠中的外植腫瘤的外生長(zhǎng)的功效。簡(jiǎn)言之，如上所述，用腫瘤(hrluc+nalm-6)注射(i.v.)nsg小鼠，然后在第二天用螟娥螢火蟲(p.pyralis)熒光素酶(ffluc)+car+t細(xì)胞注射(i.c.)所述小鼠。在使用ivis100系列系統(tǒng)分別注射enduren或熒光素后進(jìn)行腫瘤和t細(xì)胞成像。小鼠的成像示于圖10中。在每種情況下，在施用后立即對(duì)t細(xì)胞成像以確認(rèn)心內(nèi)注射(頂行)。陰影圖像表示來自腫瘤來源的hrluc活性隨時(shí)間推移的光子通量。也將來自這些研究的發(fā)光數(shù)據(jù)繪圖，并將其示于圖11中。最后，圖12顯示了描繪用各種cart細(xì)胞處理的nsg小鼠的存活曲線的圖。這些研究的結(jié)果表明，與攜帶野生型igg4鉸鏈序列的cart-細(xì)胞相比，表達(dá)減少fc受體結(jié)合的構(gòu)建體(即，eq突變型igg4鉸鏈、cd8a鉸鏈或12個(gè)氨基酸的間隔子鉸鏈)的cart細(xì)胞中的每一種具有更大的功效。具體地，這些構(gòu)建體在小鼠中顯示改善的對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的控制，并延長(zhǎng)了治療的動(dòng)物的存活時(shí)間。因此，這些研究表明，通過減少fc受體結(jié)合，可以顯著增強(qiáng)cart細(xì)胞的體內(nèi)持久性和抗腫瘤功效。

實(shí)施例3-附加的car結(jié)構(gòu)研究

使用被靶向cd19受體的car構(gòu)建體進(jìn)行附加研究。與初始研究相似，用cd19r*cd28或cd19rcd8cd28轉(zhuǎn)座子及sb11轉(zhuǎn)座酶對(duì)pbmc進(jìn)行電穿孔，并在7天的刺激周期中與il-2和il-21一起在經(jīng)輻照的克隆1上共培養(yǎng)28天。在每個(gè)刺激周期結(jié)束時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和表型分型(cd3，car)(圖13a-d)。

在這些研究之后進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以在nsg(nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wjl/szj，nodscidγ)小鼠中針測(cè)定各種cart細(xì)胞針對(duì)cd19⁺nalm-6細(xì)胞系的功效。研究了最小殘留疾病(mrd)模型和建立的腫瘤模型兩者。在mrd模型中，在第0天注射10⁴個(gè)細(xì)胞的hrluc⁺mkate⁺nalm-6注射nsg小鼠，然后在第1天心肌內(nèi)注射t細(xì)胞(10⁷/小鼠)。隨時(shí)間的推移，使用enduren活細(xì)胞基質(zhì)，通過來源于hrluc⁺nalm-6的生物發(fā)光成像評(píng)價(jià)腫瘤負(fù)荷(圖14a)。在建立的腫瘤模型中，在第0天向nsg小鼠注射1.5x10⁴個(gè)ffluc⁺egfp⁺nalm-6，并將腫瘤移植5天，評(píng)價(jià)腫瘤負(fù)荷，并在第6天心內(nèi)注射t細(xì)胞(10⁷/小鼠)。隨時(shí)間的推移，使用d-熒光素底物，使用來自ffluc⁺nalm-6的生物發(fā)光成像計(jì)算腫瘤通量。顯示了表示隨時(shí)間推移的光子通量和腫瘤通量的偽彩圖像(圖14c)。也將這些研究的發(fā)光數(shù)據(jù)繪圖，并對(duì)于每一個(gè)模型分別將其示于圖14b和14d中。

實(shí)施例4-mil-15共表達(dá)cart細(xì)胞功效和持久性的作用

在自體或同種異體小鼠模型中進(jìn)行cart細(xì)胞輸注后，監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子il-2、il-4、il-7、il-9和il-15的水平。探究另外的信號(hào)傳導(dǎo)構(gòu)建體以改善持久性。圖15顯示膜結(jié)合的il-15/il-15受體(mil15)構(gòu)建體。將mil-15構(gòu)建體與car在t細(xì)胞中共表達(dá)。圖16中的數(shù)據(jù)(參見例如，左圖)顯示car和mil15在絕大多數(shù)電穿孔的細(xì)胞上共表達(dá)。圖16中呈現(xiàn)的另外的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)與car共表達(dá)時(shí)，mil-15能夠在抗原撤出后使cart細(xì)胞在培養(yǎng)中免于下降(參見圖16，右上圖)。

隨后在體內(nèi)確認(rèn)表明car-mil-15t細(xì)胞的持久性增強(qiáng)的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果。對(duì)于這些研究，向小鼠注射表達(dá)單獨(dú)的car或與mil-15組合的car的ffluc+t細(xì)胞。注射熒光素后進(jìn)行t細(xì)胞成像。如圖17b所示，mil-15-cart細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)出延長(zhǎng)的持久性。進(jìn)一步的體內(nèi)研究檢查了表達(dá)mil-15的cart細(xì)胞在控制腫瘤生長(zhǎng)方面的有效性。這些研究使用已建立的腫瘤模型來完成，并且在腫瘤植入(i.v.注射的)6天后，如所指示的，注射(i.c.)遺傳修飾的t細(xì)胞。

實(shí)施例5-t細(xì)胞的遺傳修飾

離體繁殖t細(xì)胞以用作抗原呈遞細(xì)胞(t-apc)來呈遞腫瘤相關(guān)抗原(taa)ny-eso-1。睡美人(sb)系統(tǒng)(hackett等，2010)適應(yīng)于遺傳修飾t細(xì)胞(圖20)(cooper等，2005)。這涉及兩個(gè)步驟：(i)表達(dá)sb轉(zhuǎn)座子[即，重定向t細(xì)胞特異性的嵌合抗原受體(car)(jin等，2011；kebriaei等，2012)]和sb轉(zhuǎn)座酶的dna質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)移和(ii)在共表達(dá)cd64(fc受體)、cd86、cd137l和膜結(jié)合的白細(xì)胞介素(il)-15的突變蛋白(mil-15，圖21)的來源于k562細(xì)胞系的設(shè)計(jì)者人工抗原呈遞細(xì)胞(aapc)上穩(wěn)定表達(dá)整合體的t細(xì)胞的繁殖和擴(kuò)增。為了強(qiáng)化ny-eso-1免疫原的表達(dá)，用潮霉素選擇培養(yǎng)物中的t-apc，因?yàn)橘|(zhì)粒sb表達(dá)盒共表達(dá)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hy)與胸苷激酶(hytk)的融合物(圖20)。在殺細(xì)菌濃度的潮霉素b存在的情況下，通過用經(jīng)γ輻照的負(fù)載有okt3的aapc連續(xù)刺激來繁殖遺傳修飾的t細(xì)胞(圖20)。通過使用病毒抗原甲型流感mp1，t細(xì)胞可在體外和體內(nèi)用作t-apc(cooper等，2005)。在該實(shí)施例中，將t細(xì)胞工程化以表達(dá)ny-eso-1(融合至flag標(biāo)記的hytk)(圖22)，并在人工抗原呈遞細(xì)胞(aapc)(圖26)存在的情況下，使用sb系統(tǒng)繁殖ny-eso-1⁺mil-15⁺hla-a2⁺t-apc(hackett等，2010)。

實(shí)施例6-評(píng)價(jià)工程化的t細(xì)胞

本文所述實(shí)施方案的mil15⁺ny-eso-1⁺t-apc，當(dāng)與pbmc共培養(yǎng)時(shí)，能夠產(chǎn)生ny-eso-1五聚體陽性t細(xì)胞，并且能夠擴(kuò)增能夠在體外殺死骨髓瘤細(xì)胞的ny-eso-1⁺cart細(xì)胞(圖23和24)。然而，來自t-apc的cd137l活化的不存在以及來自lag3表達(dá)的增加的抑制可能已導(dǎo)致共培養(yǎng)3周后觀察到的減弱的反應(yīng)(圖25)。lag3表達(dá)隨著t-apc的每次刺激而增加，并且可以是耗盡的替代物。

圖28進(jìn)一步說明這些結(jié)果，所述結(jié)果顯示ny-eso-1特異性tcr⁺和car⁺t細(xì)胞對(duì)ny-eso-1⁺u266人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的殺傷。在來源于k562的人工活化和繁殖細(xì)胞(aapc)上擴(kuò)增t細(xì)胞，并且所述t細(xì)胞表達(dá)hla-a02和ny-eso-1⁺。所顯示的數(shù)據(jù)代表兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，其中繁殖9-2-15的ny-eso-1特異性cart細(xì)胞，用hla-a2/ny-eso-1t-apc刺激3次，并用衍生的aapck562刺激2次。9-2-15car含有cd8α莖，而先前的car含有igg4莖。增加的刺激導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞的裂解增加。

還評(píng)價(jià)ny-eso-1⁺mil-15⁺hla-a2⁺t-apc的呈現(xiàn)taa的能力。這通過pbmc與自體t細(xì)胞的共培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)，所述自體t細(xì)胞先前已被遺傳修飾來表達(dá)ny-eso-1特異性αβtcr。使用t-apc成功地在數(shù)值上擴(kuò)增ny-eso-1五聚體⁺t細(xì)胞。類似地，還修飾了k562來源的aapc以呈現(xiàn)ny-eso-1，并將其用于選擇性地活化和繁殖ny-eso-1特異性遺傳修飾的t細(xì)胞(作為陽性對(duì)照)。該陽性對(duì)照不能像t-apc那樣在pbmc中誘導(dǎo)免疫。還在hla的背景中研究了使用識(shí)別ny-eso-1來源的肽的嵌合抗原受體(car)來重定向t細(xì)胞的特異性。t-apc能夠成功地?cái)U(kuò)增cart細(xì)胞以及陽性對(duì)照k562來源的aapc(圖27)。

實(shí)施例7-src/線粒體強(qiáng)度的測(cè)定

所有細(xì)胞(癌細(xì)胞和原代細(xì)胞)均具有響應(yīng)于可用代謝物將它們的線粒體從正統(tǒng)構(gòu)型轉(zhuǎn)換至縮合狀態(tài)以及反之亦然的能力(krauss等，2001)。與在類似的離體培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的模擬電穿孔的對(duì)照t細(xì)胞相比，在經(jīng)car-修飾的t細(xì)胞中，線粒體形狀是不同的(圖29a和29b)。當(dāng)在共刺激不存在的情況下，將用cd28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域修飾的t細(xì)胞與用cd137t細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域修飾的細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，某些經(jīng)car-修飾的t細(xì)胞具有縮合狀態(tài)線粒體的觀察變得驚人(圖30)。因此，離體生長(zhǎng)的未修飾和經(jīng)修飾的t細(xì)胞的代謝需求和消耗模式是不同的，并且當(dāng)在特異性共刺激不存在的情況下離體繁殖細(xì)胞時(shí)變得突出。與此同時(shí)，在小鼠模型中顯示，在cd8+t細(xì)胞中維持線粒體功能和src(備用呼吸容量)對(duì)感染后穩(wěn)定的cd8⁺記憶t細(xì)胞形成是關(guān)鍵的(pearce等，2013；vanderwindt等，2012)。src被描述為可用于在細(xì)胞中在增加的工作或應(yīng)激的條件下產(chǎn)生能量的額外線粒體容量，并且被認(rèn)為對(duì)于長(zhǎng)期細(xì)胞存活和功能是重要的。在體外進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)以確定具有高線粒體強(qiáng)度的t細(xì)胞與具有規(guī)律線粒體質(zhì)量的t細(xì)胞相比，是否能夠更好地存活，從而在體內(nèi)更有效。

遺傳修飾t細(xì)胞以表達(dá)熒光報(bào)告蛋白。使用如前所述的睡美人介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座(rushworth等，2014)，開發(fā)熒光報(bào)告蛋白eyfp-grx2(圖31)并在t細(xì)胞上表達(dá)。質(zhì)粒eyfp-grx2-sb編碼在hef1a啟動(dòng)子控制下表達(dá)的融合蛋白eyfp-mito，將所述質(zhì)粒全部嵌入睡美人(sb)載體主鏈中。sb載體ir/dr序列有助于由從第二質(zhì)粒pcmv-kan-sb11表達(dá)的酶sb11(轉(zhuǎn)座酶)引導(dǎo)的編碼具有線粒體定位序列(grx2)的熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)座。與熒光蛋白報(bào)告子和sb11一起，再表達(dá)兩種質(zhì)粒，一種質(zhì)粒編碼對(duì)于腫瘤相關(guān)抗原(諸如her1-3、ror1、cd19或cd123)是特異的嵌合抗原受體(car)，且一種質(zhì)粒含有與將熒光蛋白引導(dǎo)至細(xì)胞核的核定位序列(nls)融合的第二熒光蛋白mcherry(即，mcherry-nls-sb)。使用人t-細(xì)胞核轉(zhuǎn)染試劑盒(amaxa/lonza)和電穿孔裝置(lonza)，通過電穿孔將所有組合的四種質(zhì)粒遞送至細(xì)胞。表達(dá)熒光蛋白質(zhì)粒的載體圖的示意圖描繪于圖31中。

car⁺t細(xì)胞的產(chǎn)生。通過sb介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座和dna轉(zhuǎn)移(通過對(duì)pbmc來源的t細(xì)胞電穿孔進(jìn)行的)的類似方法產(chǎn)生靶向特異性腫瘤相關(guān)抗原的嵌合抗原受體陽性t細(xì)胞。設(shè)計(jì)具有靶向b細(xì)胞惡性腫瘤上的cd19和/或ror1、白血病干細(xì)胞(急性髓樣白血病)上的cd123或egfr陽性乳腺癌上的her1-3的特異性的car+t細(xì)胞，并通過電穿孔的類似方法將其在t細(xì)胞上表達(dá)。每個(gè)car被設(shè)計(jì)來含有t細(xì)胞共刺激胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域cd28或4-1bb(cd137)以及cd3z。每個(gè)car含有經(jīng)修飾的igg4-fc莖，其用作支架來在細(xì)胞表面上突出與t細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的scfv。使用fc-莖特異性抗體確認(rèn)car在t細(xì)胞表面上的表達(dá)。

設(shè)計(jì)和產(chǎn)生car種類的方法(參見例如，國(guó)際(pct)專利公布第wo/2015/123642號(hào)，其通過引用并入本文)是已知的，但預(yù)測(cè)哪些體外或動(dòng)物試驗(yàn)將鑒定出在人中輸注時(shí)具有優(yōu)異治療潛力的car設(shè)計(jì)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。目前，研究者通常依賴于以下測(cè)試的陣列來推進(jìn)用于診所的car結(jié)構(gòu)：對(duì)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(aicd)和car介導(dǎo)的增殖的抗性、殺傷和細(xì)胞因子產(chǎn)生。本文中教授的是鑒定可具有改善的治療潛力的car設(shè)計(jì)的單一測(cè)試。cd8⁺記憶t細(xì)胞(但非cd8⁺效應(yīng)t細(xì)胞)具有顯著的線粒體備用呼吸容量(src)。記憶細(xì)胞，與效應(yīng)細(xì)胞不同，具有獨(dú)特組的代謝需求。在高腫瘤負(fù)荷期間應(yīng)激增加的情況下，遺傳修飾的t細(xì)胞的線粒體從正統(tǒng)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為縮合形式(圖29b和33a-33b)。然而，只有一些細(xì)胞保留了轉(zhuǎn)換回原始正統(tǒng)線粒體結(jié)構(gòu)的靈活性，這是t效應(yīng)細(xì)胞的性能特征(characteristicfeature)。具有高線粒體src的t細(xì)胞能夠在與高腫瘤負(fù)荷相關(guān)的不利條件(諸例如缺氧、缺乏用于糖酵解的營(yíng)養(yǎng)物和抑制性細(xì)胞因子環(huán)境)下存活，但仍然可以保留它們的細(xì)胞毒性能力(圖34)。此類細(xì)胞毒性t細(xì)胞在本文中被定義為“高能細(xì)胞”，其可以是體內(nèi)腫瘤的最佳系列殺傷劑。

car⁺t細(xì)胞的離體擴(kuò)增。將car-t細(xì)胞與表達(dá)car特異性配體(2d3scfv，參見例如，pct申請(qǐng)第pct/us2014/039365號(hào))的經(jīng)輻照的k562hla^cneg細(xì)胞一起共同培養(yǎng)，并且外源性添加il2但不存在共刺激(rushworth等，2014)。在car-t細(xì)胞的遺傳修飾后，以1∶2(1car-t細(xì)胞：2aapc)的比例添加經(jīng)輻照的、活化和繁殖的(aapc)飼養(yǎng)細(xì)胞(圖30)。

鑒定并在數(shù)值上擴(kuò)增了可在人體試驗(yàn)中長(zhǎng)期體內(nèi)存活的具有代謝活性的高能car⁺t細(xì)胞。這通過使用介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的睡美人(sb)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)。在經(jīng)輻照的“通用”活化和繁殖細(xì)胞(k562-uapc)上共同培養(yǎng)已經(jīng)歷從sb系統(tǒng)(編碼car和sb轉(zhuǎn)座酶)進(jìn)行的兩種dna質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)移的t細(xì)胞。為了鑒定具有參與“高能”代謝的能力的遺傳修飾的t細(xì)胞，同時(shí)也對(duì)命名為eyfp-grx2-sb的第三sbdna種類進(jìn)行電穿孔。該sb轉(zhuǎn)座子表達(dá)融合蛋白eyfp-2a-grx2并含有線粒體定位序列。熒光報(bào)告子鑒定了具有額外線粒體備用呼吸容量(src)的car⁺t細(xì)胞。這些細(xì)胞可基于eyfp熒光的強(qiáng)度來分選，并將其輸注以用于體內(nèi)腫瘤殺傷。

流式細(xì)胞術(shù)。按照標(biāo)準(zhǔn)分選程序在lsr-fortessa流式細(xì)胞儀(bd)上基于eyfp的內(nèi)源表達(dá)，分選car-t的高線粒體強(qiáng)度，而無需任何染色標(biāo)志物(圖32)。

顯微術(shù)。將經(jīng)car修飾的細(xì)胞固定在1％多聚甲醛溶液中，并使用標(biāo)準(zhǔn)程序通過透射電子顯微術(shù)進(jìn)行分析。使用leicadmi6000倒置熒光顯微鏡和metamorph成像軟件(7.8版)定量經(jīng)car修飾的和未修飾的t細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，以確定高線粒體強(qiáng)度的經(jīng)car修飾的t細(xì)胞(et-細(xì)胞)是否具有額外的線粒體備用呼吸容量(圖35、36、37a和37b)。

具有高eyfp表達(dá)的car可具有旁路細(xì)胞凋亡、上調(diào)car⁺t細(xì)胞中的抗凋亡基因的必要特征，并且在體內(nèi)持久以達(dá)到臨床相關(guān)的抗腫瘤作用?？赡芷谕麖碾娹D(zhuǎn)移的體外轉(zhuǎn)錄的mrna種類瞬時(shí)表達(dá)報(bào)告基因和/或表達(dá)可用于順磁珠基選擇的細(xì)胞表面分子(例如，截短的神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體)。代替針對(duì)某些car設(shè)計(jì)的人應(yīng)用的排序，該方法提供了一種途徑，通過該途徑可在體外篩選大量不同的car分子(例如，如由ez-car系統(tǒng)產(chǎn)生的)的報(bào)告基因(例如，eyfp)的共同表達(dá)，從而基于期望的線粒體src選擇所述car分子。

實(shí)施例8-4-1bb(cd137)介導(dǎo)的t細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)

car⁺t細(xì)胞的基因修飾和離體繁殖引起改變的線粒體代謝，并且4-1bb介導(dǎo)的t細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)car⁺t細(xì)胞在有挑戰(zhàn)性的培養(yǎng)環(huán)境中更好地存活。

比較靶向ror1或her1-3的兩種不同的car，以測(cè)定信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?qū)ο拗菩耘囵B(yǎng)條件下的car-t細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。如前所述，在睡美人(sb)載體主鏈上建立car構(gòu)建體。car在各自的載體構(gòu)建體中使用cd28-cd3z信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或cd137(4-1bb)-cd3z信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。除了靶向單獨(dú)的腫瘤抗原之外，car主鏈如先前針對(duì)cd19特異性car所述的還保持不變，所述cd19特異性car利用靶向腫瘤抗原的小鼠scfv和人igg4fc來源的莖連接car與跨膜和信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。先前已描述了靶抗原，即cll上的ror1(deniger等，plosone，2015)和乳腺腫瘤上的her1-3(jena等，ash，2014)。在sb介導(dǎo)的基因修飾之后，在經(jīng)輻照的通用活化和繁殖細(xì)胞上繁殖car-t細(xì)胞(uapc；rushworth等，jimmunothrer.2014)。如實(shí)施例7中所述，研究car-t細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、線粒體結(jié)構(gòu)和線粒體形態(tài)學(xué)。

與cd137-cd3z信號(hào)傳導(dǎo)相比，含有cd28-cd3z信號(hào)傳導(dǎo)的car-t細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活較差，與所用的轉(zhuǎn)座子負(fù)載或靶抗原無關(guān)(圖38和39)。在本研究中共測(cè)試了總共3種不同的car，即含有cd28z或cd137z信號(hào)傳導(dǎo)的cd19-car、her1-3car、ror1⁺car。在通用aapc上活化并擴(kuò)增所有car，其中t細(xì)胞僅通過car-莖經(jīng)由嵌合在k562細(xì)胞上的scfv配體進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。在特異性共刺激不存在的情況下，含有cd28信號(hào)傳導(dǎo)的car-t細(xì)胞迅速進(jìn)行細(xì)胞凋亡，而含有cd137z信號(hào)傳導(dǎo)的car-t細(xì)胞持續(xù)更長(zhǎng)的時(shí)間，并且始終顯示增加的線粒體質(zhì)量(通過共焦顯微術(shù)觀察到高eyfp強(qiáng)度)。

在cd28z-car-t細(xì)胞中線粒體數(shù)量很少且?guī)缀鯖]有分布，而cd137z-car-t細(xì)胞記錄了更亮和更高水平的eyfp信號(hào)。這證明了線粒體的高備用呼吸容量(src)，并提供了cd137z-cart細(xì)胞在限制性培養(yǎng)環(huán)境中存活的機(jī)理證據(jù)。

***

雖然本文已經(jīng)顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，此類實(shí)施方案僅以示例的方式提供。在不脫離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)將會(huì)想到許多變型、變化和替代。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的本發(fā)明的實(shí)施方案的各種替代方案可用于實(shí)施本發(fā)明。以下權(quán)利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，并且在這些權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)由些覆蓋。

參考文獻(xiàn)

以下參考文獻(xiàn)在其提供對(duì)本文所闡述的那些補(bǔ)充的示例性程序或其他細(xì)節(jié)的程度上通過引用具體并入本文。

u.s.patentno.4,690,915

u.s.patentno.6,225,042

u.s.patentno.6,355,479

u.s.patentno.6,362,001

u.s.patentno.6,410,319

u.s.patentno.6,790,662

u.s.patentno.7,109,304

u.s.patentapplicationpublicationno.2009/0017000

u.s.patentapplicationpublicationno.2009/0004142

pctpublicationno.wo2007/103009

pctapplicationno.pct/us2014/039365

pctapplicationno.pct/us14/39365

pctapplicationno.pct/us14/38005

altenschmidtetal.，j.mol.med.，75：259，1997.

barthelandgoldfeld，j.immunol.，171：3612-3619，2003.

brentjensetal.，blood，118：4817-4828，2011.

brentjensetal.，sci.transl.med.，5：177ral38，2013.

brockeretal.，adv.immunol.，68：257，1998.

cooperandbollard，blood，119：2700-2702，2012.

cooperetal.，blood105：1622-31，2005.

corrigan-curayetal.，moleculartherapy.22，1564-1574，2014.

denigeretal.，plosone.2015；10(6)：e0128151.doi：10.1371/journal.pone.0128151.

eshharetal.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.，90：720，1993.

eshhar，cancerimmunol.immunother.，45：131，1997.

fitzer-attasetal.，j.immunol.，160：145，1998.

frauwirthetal.，immunity，16：769-777，2002.

grossetal.，fasebj.，6：3370，1992.

gruppetal.，neweng.j.ofmed.，18：1509-1518，2013.

hackettetal.，molther18：674-83，2010.

hekeleetal.，int.j.cancer，68：232，1996.

hwuetal.，cancerres.，55：3369，1995.

jenaetal.，blood，116：1035-1044，2010.

jenaetal.，curr.hematol.malig.rep.，9：50-56，2014.

jenaetal.，2014.abstract.blood.124(21).

jinetal.，genether18：849-56，2011.

kalosetal.，sci.transl.med.，3：95ra73，2011.

kebriaeietal.，humgenether23：444-50，2012.

kimetal.，nature，22(4)：403-410，2004.

kochenderferetal.，blood，116：4099-4102，2010.

kochenderferetal.，blood，119：2709-2720，2012.

kraussetal.，immunity，15：497-502，2001.

marodonetal.，blood，101：3416-3423，2003.

maudeetal.，n.engl.j.med.，371：1507-1517，2014.

moritzetal.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.，91：4318，1994.

pearceetal.，science，342：210，2013.

porteretal.，n.engl.j.med.，365：725-733，2011.

robertsetal.，blood，84：2878，1994.

rushworthetal.，j.ofimmunotherapy.37：204-213，2014.

schneider，j.embryol.exp.morph.，27：353-365，1972.

stancovskietal.，j.immunol.，151：6577，1993.

tilletal.，blood，112：2261-2271，2008.

topalianandrosenberg，actahaematol.，78(suppl.1)：75-76，1987.

vanderwindtetal.，immunity，36：68-78，2012.

weijtensetal.，j.immunol.，157：836，1996.

序列表

<110>得克薩斯州大學(xué)系統(tǒng)董事會(huì)

<120>基因修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞和用于擴(kuò)增免疫效應(yīng)細(xì)胞的工程化的細(xì)胞

<130>utfc.p1251wo

<140>未知的

<141>2015-11-05

<150>us62/075,561

<151>2014-11-05

<150>us62/075,642

<151>2014-11-05

<150>us62/075,667

<151>2014-11-05

<150>us62/169,979

<151>2015-06-02

<160>28

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>230

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成igg4fc區(qū)

<400>1

gluserlystyrglyproprocysproprocysproalaprogluphe

151015

gluglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

202530

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

354045

serglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyval

505560

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheglnser

65707580

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

859095

asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproser

100105110

serileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

115120125

glnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlysasngln

130135140

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

145150155160

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

165170175

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserargleu

180185190

thrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalphesercysser

195200205

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

210215220

leuserleuglylysmet

225230

<210>2

<211>75

<212>prt

<213>智人

<400>2

lysprothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothr

151015

ilealaserglnproleuserleuargproglualacysargproala

202530

alaglyglyalavalhisthrargglyleuaspphealacysaspile

354045

tyriletrpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleuser

505560

leuvalilethrleutyrcysasnhisargasn

657075

<210>3

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成igg4鉸鏈區(qū)

<400>3

gluserlystyrglyproprocysproprocyspro

1510

<210>4

<211>422

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成il-15-il-15受體融合物

<400>4

metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval

151015

hisserasntrpvalasnvalileseraspleulyslysilegluasp

202530

leuileglnsermethisileaspalathrleutyrthrgluserasp

354045

valhisprosercyslysvalthralametlyscyspheleuleuglu

505560

leuglnvalileserleugluserglyaspalaserilehisaspthr

65707580

valgluasnleuileileleualaasnasnserleuserserasngly

859095

asnvalthrgluserglycyslysglucysglugluleugluglulys

100105110

asnilelysglupheleuglnserphevalhisilevalglnmetphe

115120125

ileasnthrserserglyglyglyserglyglyglyglyserglygly

130135140

glyglyserglyglyglyglyserglyglyglyserleuglnilethr

145150155160

cysproproprometservalgluhisalaaspiletrpvallysser

165170175

tyrserleutyrserarggluargtyrilecysasnserglyphelys

180185190

arglysalaglythrserserleuthrglucysvalleuasnlysala

195200205

thrasnvalalahistrpthrthrproserleulyscysileargasp

210215220

proalaleuvalhisglnargproalaproproserthrvalthrthr

225230235240

alaglyvalthrproglnprogluserleuserproserglylysglu

245250255

proalaalaserserproserserasnasnthralaalathrthrala

260265270

alailevalproglyserglnleumetproserlysserproserthr

275280285

glythrthrgluileserserhisgluserserhisglythrproser

290295300

glnthrthralalysasntrpgluleuthralaseralaserhisgln

305310315320

proproglyvaltyrproglnglyhisseraspthrthrvalalaile

325330335

serthrserthrvalleuleucysglyleuseralavalserleuleu

340345350

alacystyrleulysserargglnthrproproleualaservalglu

355360365

metglualametglualaleuprovalthrtrpglythrserserarg

370375380

aspgluaspleugluasncysserhishisleuserargmetasptyr

385390395400

lysaspaspaspasplysasptyrlysaspaspaspasplysasptyr

405410415

lysaspaspaspasplys

420

<210>5

<211>22

<212>prt

<213>智人

<400>5

metleuleuleuvalthrserleuleuleucysgluleuprohispro

151015

alapheleuleuilepro

20

<210>6

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成vl結(jié)構(gòu)域

<400>6

aspileglnmetthrglnthrthrserserleuseralaserleugly

151015

aspargvalthrilesercysargalaserglnaspileserlystyr

202530

leuasntrptyrglnglnlysproaspglythrvallysleuleuile

354045

tyrhisthrserargleuhisserglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythrasptyrserleuthrileserasnleuglugln

65707580

gluaspilealathrtyrphecysglnglnglyasnthrleuprotyr

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilethr

100105

<210>7

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>whitlow接頭肽

<400>7

glyserthrserglyserglylysproglyserglygluglyserthr

151015

lysgly

<210>8

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成vh結(jié)構(gòu)域

<400>8

gluvallysleuglngluserglyproglyleuvalalaprosergln

151015

serleuservalthrcysthrvalserglyvalserleuproasptyr

202530

glyvalsertrpileargglnproproarglysglyleuglutrpleu

354045

glyvaliletrpglysergluthrthrtyrtyrasnseralaleulys

505560

serargleuthrileilelysaspasnserlysserglnvalpheleu

65707580

lysmetasnserleuglnthraspaspthralailetyrtyrcysala

859095

lyshistyrtyrtyrglyglysertyralametasptyrtrpglygln

100105110

glythrservalthrvalserser

115120

<210>9

<211>230

<212>prt

<213>智人

<400>9

gluserlystyrglyproprocysprosercysproalaprogluphe

151015

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

202530

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

354045

serglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyval

505560

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasnser

65707580

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

859095

asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproser

100105110

serileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

115120125

glnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlysasngln

130135140

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

145150155160

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

165170175

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserargleu

180185190

thrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalphesercysser

195200205

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

210215220

leuserleuglylysmet

225230

<210>10

<211>230

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成igg4鉸鏈

<400>10

gluserlystyrglyproprocysproprocysproalaprogluphe

151015

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

202530

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

354045

serglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyval

505560

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasnser

65707580

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

859095

asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproser

100105110

serileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

115120125

glnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlysasngln

130135140

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

145150155160

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

165170175

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserargleu

180185190

thrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalphesercysser

195200205

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

210215220

leuserleuglylysmet

225230

<210>11

<211>68

<212>prt

<213>智人

<400>11

phetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrserleu

151015

leuvalthrvalalapheileilephetrpvalargserlysargser

202530

argleuleuhisserasptyrmetasnmetthrproargargprogly

354045

prothrarglyshistyrglnprotyralaproproargasppheala

505560

alatyrargser

65

<210>12

<211>68

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成cd28跨膜結(jié)構(gòu)域

<400>12

phetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrserleu

151015

leuvalthrvalalapheileilephetrpvalargserlysargser

202530

argglyglyhisserasptyrmetasnmetthrproargargprogly

354045

prothrarglyshistyrglnprotyralaproproargasppheala

505560

alatyrargser

65

<210>13

<211>112

<212>prt

<213>智人

<400>13

argvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglngly

151015

glnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyr

202530

aspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylys

354045

proargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlys

505560

asplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluarg

65707580

argargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthrala

859095

thrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg

100105110

<210>14

<211>27

<212>prt

<213>智人

<400>14

phetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrserleu

151015

leuvalthrvalalapheileilephetrpval

2025

<210>15

<211>42

<212>prt

<213>智人

<400>15

lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet

151015

argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe

202530

proglugluglugluglyglycysgluleu

3540

<210>16

<211>41

<212>prt

<213>智人

<400>16

argserlysargserargleuleuhisserasptyrmetasnmetthr

151015

proargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyralapro

202530

proargaspphealaalatyrargser

3540

<210>17

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成cd28細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域

<400>17

argserlysargserargglyglyhisserasptyrmetasnmetthr

151015

proargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyralapro

202530

proargaspphealaalatyrargser

3540

<210>18

<211>12

<212>prt

<213>智人

<400>18

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1510

<210>19

<211>32

<212>prt

<213>智人

<400>19

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151015

valleuleuleuserleuvalilethrleutyrcysasnhisargasn

202530

<210>20

<211>43

<212>prt

<213>智人

<400>20

lysprothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothr

151015

ilealaserglnproleuserleuargproglualacysargproala

202530

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3540

<210>21

<211>2037

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<400>21

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<212>prt

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<220>

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115120125

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165170175

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180185190

glyleuglutrpvalserglyilevalserserglyglyserthrala

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glyproprocysproprocysproalaproglupheleuglyglypro

275280285

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290295300

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tyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproserserileglulys

370375380

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serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu

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aspseraspglyserphepheleutyrserargleuthrvalasplys

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serargtrpglngluglyasnvalphesercysservalmethisglu

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alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserleugly

485490495

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glugluglyglycysgluleuargvallyspheserargseralaasp

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metglnalaleuproproarg

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<212>prt

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aspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylys

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202530

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354045

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505560

glylysalaprolysleuileilehisaspvalilegluargserser

65707580

glyvalproaspargpheserglyserlysserglyasnthralaser

859095

leuthrileserglyleuglnalagluaspglualaasptyrtyrcys

100105110

trpserphealaglyglytyrtyrvalpheglythrglythraspval

115120125

thrvalleuglyserthrserglyserglylysproglyserglyglu

130135140

glyserthrlysglygluvalglnleuleugluserglyglyglyleu

145150155160

valglnproglyglyserleuargleusercysalaalaserglyphe

165170175

thrpheserthrtyrglnmetsertrpvalargglnalaproglylys

180185190

glyleuglutrpvalserglyilevalserserglyglyserthrala

195200205

tyralaaspservallysglyargphethrileserargaspasnser

210215220

lysasnthrleutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthr

225230235240

alavaltyrtyrcysalaglygluleuleuprotyrtyrglymetasp

245250255

valtrpglyglnglythrthrvalthrvalserserlysprothrthr

260265270

thrproalaproargproprothrproalaprothrilealasergln

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proleuserleuargproglualacysargproalaalaglyglyala

290295300

valhisthrargglyleuaspphealacysaspiletyriletrpala

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proleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethr

325330335

leutyrcysasnhisargasnlysargglyarglyslysleuleutyr

340345350

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370375380

leuargvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglngln

385390395400

glyglnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglu

405410415

tyraspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglygly

420425430

lysproargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleugln

435440445

lysasplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglyglu

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arg

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505560

serleuleuleuileglnserserglnarggluglnthrserglyarg

65707580

leuasnalaserleuasplysserserglyargserthrleutyrile

859095

alaalaserglnproglyaspseralathrtyrleucysalavalarg

100105110

proleutyrglyglysertyrileprothrpheglyargglythrser

115120125

leuilevalhisprotyrileglnasnproaspproalavaltyrgln

130135140

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610