專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)調(diào)整肥胖(ob)基因的效應(yīng)的化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新方法，更具體地說(shuō)，涉及一種用于檢測(cè)模擬、增強(qiáng)或抑制ob蛋白的生理效應(yīng)的化合物的方法。
ob蛋白(或肥胖蛋白(leptin))是一種分泌型激素，作為從脂肪組織到其它器官的信號(hào)，調(diào)控重量以及能量平衡(Zhang等人，Nature，1994，372，425)。已經(jīng)表明ob蛋白還在造血功能和生殖功能中具有其它作用(Cioffi等人，Nature Medicine，1996，2(5)，585)。含有一個(gè)由四個(gè)α-螺旋組成的核、并且所述四個(gè)α-螺旋形成一束上-上-下-下的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的蛋白分子包含一個(gè)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的家族。這個(gè)家族的蛋白引起膜受體的同型和異型寡聚化，而這種寡聚化已知會(huì)激活激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄。這個(gè)家族的由寡聚化激活的受體分為兩大類(lèi)一類(lèi)如表皮生長(zhǎng)因子受體，在它們的胞內(nèi)域具有整合的酪氨酸激酶活性(A.Ullrich和J.Schlessinger，Cell，1990，61，203-212)；一類(lèi)如IL4受體和促紅細(xì)胞生成素受體，缺少這種活性，而是通過(guò)一種相關(guān)的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶來(lái)介導(dǎo)它們的反應(yīng)(J.N.Ihle等人，TIBS，1994，19，222-227)。兩種受體亞類(lèi)都由細(xì)胞因子激活，但4-螺旋束蛋白僅激活非整合酪氨酸激酶的亞類(lèi)。非整合蛋白酪氨酸激酶的受體一般通過(guò)一種途徑行使功能，所述途徑涉及Janus激酶(JAK)和與所述受體有聯(lián)系的轉(zhuǎn)錄的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和激活劑(STAT)蛋白。在受到激活時(shí)，STAT蛋白結(jié)合DNA效應(yīng)元件，從而控制基因轉(zhuǎn)錄。包含一般序列為T(mén)T(N)nAA的DNA調(diào)節(jié)元件的寡核苷酸已經(jīng)被鑒定(Seidel等人，Proc Nat.Acad.Sci.USA，1995，92，3041)為STAT效應(yīng)元件。這些元件響應(yīng)如細(xì)胞因子等的信號(hào)分子而與STAT蛋白結(jié)合。
在共同未決的英國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第9509164.1號(hào)中，我們已經(jīng)陳述了我們的發(fā)現(xiàn)，即ob蛋白的特征為一個(gè)四螺旋束的三級(jí)結(jié)構(gòu)。我們現(xiàn)在相信ob蛋白與一種膜結(jié)合受體相互作用，這種相互作用激活JAK-STAT激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并因此構(gòu)成用于檢測(cè)模擬、增強(qiáng)或抑制ob蛋白的生理效應(yīng)的化合物的分析系統(tǒng)的基礎(chǔ)。這樣的一種分析可用來(lái)篩選化合物以用于治療o(wú)b蛋白所調(diào)節(jié)的重量失調(diào)、能量平衡失調(diào)、造血障礙、生育力障礙和其它病癥。這種分析在篩選用于治療與肥胖、厭食、惡病質(zhì)和糖尿病有關(guān)的病癥的化合物中特別有用。
共同未決的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/EP96/02291號(hào)涉及使用JAK-STAT技術(shù)的新檢測(cè)方法。我們現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種也利用這種技術(shù)的特別有利的檢測(cè)方法。
因此，本發(fā)明提供了模擬、增強(qiáng)或抑制ob蛋白生理效應(yīng)的化合物的檢測(cè)方法，所述方法包括(a)對(duì)于模擬ob蛋白的生理效應(yīng)的化合物來(lái)說(shuō)，評(píng)估所述化合物對(duì)連接了一個(gè)報(bào)道基因的ob蛋白轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和激活劑(STAT)DNA效應(yīng)元件的效應(yīng)；或(b)對(duì)于增強(qiáng)或抑制ob蛋白的生理效應(yīng)的化合物來(lái)說(shuō)，評(píng)估所述化合物對(duì)連接了一個(gè)報(bào)道基因的受ob蛋白激活的STAT DNA效應(yīng)元件上ob蛋白所提供的響應(yīng)的影響；其中所述效應(yīng)元件和所述報(bào)道基因在一個(gè)ob蛋白效應(yīng)細(xì)胞系中表達(dá)，所述細(xì)胞系選自以下的細(xì)胞系下丘腦衍生細(xì)胞系；嗜鉻細(xì)胞瘤衍生細(xì)胞系；造血衍生細(xì)胞系；胰衍生細(xì)胞系；肝衍生細(xì)胞系；前脂肪細(xì)胞衍生細(xì)胞系；骨骼肌衍生細(xì)胞系；和卵巢衍生細(xì)胞系；或所述效應(yīng)元件和所述報(bào)道基因在一個(gè)細(xì)胞系中表達(dá)，所述細(xì)胞系(工程改造的細(xì)胞系)還被一種多肽轉(zhuǎn)染并含有合適的STAT蛋白，其中所述多肽能介導(dǎo)ob蛋白對(duì)受ob蛋白激活的STAT DNA效應(yīng)元件的刺激作用。
一種合適的細(xì)胞系是一種下丘腦衍生細(xì)胞系。
一種合適的細(xì)胞系是一種嗜鉻細(xì)胞瘤衍生細(xì)胞系。
一種合適的細(xì)胞系是一種造血衍生細(xì)胞系。
一種合適的細(xì)胞系是一種胰衍生細(xì)胞系。
一種合適的細(xì)胞系是一種肝衍生細(xì)胞系。
一種合適的細(xì)胞系是一種前脂肪細(xì)胞衍生細(xì)胞系。
一種合適的細(xì)胞系是一種骨骼肌衍生細(xì)胞系。
一種合適的細(xì)胞系是一種卵巢衍生細(xì)胞系。
所述效應(yīng)元件和所述報(bào)道基因較適宜地在一個(gè)細(xì)胞系中表達(dá)，所述細(xì)胞系(工程改造的細(xì)胞系)還被一種多肽轉(zhuǎn)染并含有合適的STAT蛋白，其中所述多肽能介導(dǎo)ob蛋白對(duì)受ob蛋白激活的STATDNA效應(yīng)元件的刺激作用。
一個(gè)下丘腦衍生細(xì)胞系的例子是W.C.Wetsel在Cellular andMolecular Neurobiology，1995，15(1)，43中所述的神經(jīng)元GT1-7細(xì)胞系。
一個(gè)嗜鉻細(xì)胞瘤衍生細(xì)胞系的例子是腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤大鼠PC12細(xì)胞(L.A.Greene和A.S.Tischler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1976，73(7)，2424)。
一個(gè)造血衍生細(xì)胞系的例子是從人類(lèi)紅白血病得到的HEL92.1.7(ATCC TIB 180)細(xì)胞系(P.Martin，Science.1982，216(4551)，1233)另一個(gè)造血衍生細(xì)胞系的例子是從人類(lèi)慢性髓細(xì)胞性白血病得到的K562(ATCC CCL-243)細(xì)胞系(Proc Soc.Exp.Biol Med.1981，166，546和Blood，1975，45，321)。
一個(gè)胰衍生細(xì)胞系的例子是βTC-3細(xì)胞系(T.J.Kieffer等人，Biochem.and Biophys.Res.Comm.，1996，224，552)。
其它胰細(xì)胞系的例子包括RIN5mF細(xì)胞，所述細(xì)胞最近報(bào)道是響應(yīng)肥胖蛋白的(Md Shahidul Islam等人；Biochem Biophys Res Comm.1997，238，851-855)。
一個(gè)前脂肪細(xì)胞衍生細(xì)胞系的例子是30A5細(xì)胞系(Y.Bai等人，JBiol.Chem.，1996，271(24)，13939)。
其它前脂肪細(xì)胞衍生細(xì)胞系的例子包括分化型3T3-L1和分化型3T3-F442A細(xì)胞系，這兩種細(xì)胞系現(xiàn)在都可以作為商品買(mǎi)到。
一個(gè)肝衍生細(xì)胞系的例子是HepG2細(xì)胞系(B Cohen等人；Science，1996，274，1185-1188和Y Wang等人；J Biol Chem，1997，272，16216-16223)或H35細(xì)胞系(Y Wang等人；J Biol Chem，1997，272，16216-16223)。
其它肝衍生細(xì)胞系的例子有WRL68肝細(xì)胞和Change肝細(xì)胞，這兩個(gè)細(xì)胞系現(xiàn)在都可以作為商品買(mǎi)到。
一個(gè)骨骼肌衍生細(xì)胞系的例子是小鼠肌管C2 C12細(xì)胞系(Nature，1977，270，725)。
一個(gè)卵巢衍生細(xì)胞系的例子是SK-OV-3細(xì)胞系，ATCC號(hào)HTB77，(J.Fogh和G Trempe在Human Tumour Cells In Vitro第155-159頁(yè)，J.Fogh(編輯)Plenum Press，New York，1975；J.Fogh和G Trempe J.Natl.Cancer Inst Bethesda，1977，587209-214)一種合適的能介導(dǎo)ob蛋白對(duì)受ob蛋白激活的STAT DNA效應(yīng)元件的刺激作用的多肽是ob基因受體的一種功能性同種型，例如Tartaglia等人(Cell，1995，83，1263)所鑒定的。
所述效應(yīng)元件合適地是連接于一個(gè)啟動(dòng)子基因，優(yōu)選一個(gè)最小化的啟動(dòng)子。
一種合適的效應(yīng)元件是式TT(N)nAA的核苷酸，其中N是任何核苷酸，n是4，5或6。
一種優(yōu)選的效應(yīng)元件是被ob蛋白與它的受體相互作用所介導(dǎo)的胞內(nèi)事件所選擇性地激活。這樣的選擇性效應(yīng)元件的確定可以通過(guò)將一定范圍的效應(yīng)元件-報(bào)道基因構(gòu)成物轉(zhuǎn)染進(jìn)一個(gè)ob效應(yīng)細(xì)胞系后，檢測(cè)ob蛋白與其它細(xì)胞因子相比的相對(duì)激活作用。
一種優(yōu)選的效應(yīng)元件是式為T(mén)T(N)nAA的核苷酸，其中N是任何核苷酸，n是4或5。
另一個(gè)合適的效應(yīng)元件是TTCCCGGAA。
另一種合適的效應(yīng)元件是由ob蛋白調(diào)控的基因的啟動(dòng)子中STAT相互作用所必需的那一個(gè)區(qū)。這個(gè)基因取決于由所述分析所要篩選的化合物的具體的治療應(yīng)用。
合適的報(bào)道基因是螢火蟲(chóng)螢光素酶或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。
合適的啟動(dòng)子是一個(gè)最小化的啟動(dòng)子，如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子或SV40啟動(dòng)子。
其它效應(yīng)細(xì)胞系可以使用一個(gè)置換結(jié)合分析來(lái)鑒定。然而，結(jié)合可能并不結(jié)合到受體的功能性長(zhǎng)形式(functional long form)，即傳遞一個(gè)信號(hào)給細(xì)胞質(zhì)的形式?？梢酝ㄟ^(guò)PCR或Northern印跡分析來(lái)鑒定受體的功能性長(zhǎng)期形式(如人類(lèi)ob受體Tartaglia等人，Cell，1995，83，1263)。最后通過(guò)監(jiān)測(cè)在不同濃度的肥胖蛋白的存在下所發(fā)生的細(xì)胞事件來(lái)檢出效應(yīng)細(xì)胞系。鑒定候選細(xì)胞系或監(jiān)測(cè)這些細(xì)胞事件的可能的方法包括以下幾種1.微型生理計(jì)(microphysiometer)這種方法檢測(cè)由細(xì)胞內(nèi)的生化改變所引起的pH的微小改變。ob蛋白效應(yīng)細(xì)胞在受到刺激時(shí)會(huì)經(jīng)歷生化改變，這些改變會(huì)引起可以用硅微型生理計(jì)檢測(cè)到的細(xì)胞外酸化作用率的微小變化。微型生理計(jì)生物傳感器方法學(xué)已經(jīng)由McConnell，Science，1992，257，1906綜述。
2.電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)將從ob蛋白處理過(guò)的細(xì)胞中得到的核提取物與放射性標(biāo)記的寡核苷酸混合，其中所述的寡核苷酸含有一種混棲或特異性的STAT效應(yīng)元件DNA序列。響應(yīng)ob蛋白的細(xì)胞提取物會(huì)引起STAT效應(yīng)元件的寡核苷酸的凝膠移位。
參考文獻(xiàn)書(shū)“Recombinant DNA”，第二版，Watson等人，1992，第158頁(yè)；Lamb等人，Blood，1994，83，2063。
3.蛋白質(zhì)磷酸化分析的方法通過(guò)使用識(shí)別磷酸化酪氨酸的抗體可以分析受體激活通過(guò)對(duì)胞內(nèi)蛋白的酪氨酸磷酸化與最終反應(yīng)的偶聯(lián)。更具體地說(shuō)，由于肥胖蛋白受體可以刺激JAK/STAT途徑的酪氨酸磷酸化，因此這種方法提供了一種檢出肥胖蛋白效應(yīng)細(xì)胞系的方法?？梢詫⑻禺愋訨AK/STAT抗體連同抗酪氨酸磷酸化抗體一起使用，檢測(cè)肥胖蛋白效應(yīng)細(xì)胞系中的肥胖蛋白激活。蛋白質(zhì)磷酸化的抑制和刺激都有可能發(fā)生。尤其是在過(guò)量表達(dá)胰島素受體的rat-1成纖維細(xì)胞中，已經(jīng)顯示了ob蛋白對(duì)受胰島素刺激的胰島素受體和胰島素受體底物-1的磷酸化的抑制(Kroder等人1996，Exp.Clin.Endocrinol.Diabete，104，增刊2，第66頁(yè))。
4.置換結(jié)合在將細(xì)胞系與放射性標(biāo)記的肥胖蛋白，如[125I]-肥胖蛋白溫育后，可以通過(guò)加入未標(biāo)記的肥胖蛋白來(lái)研究肥胖蛋白的非特異性結(jié)合和特異性結(jié)合的關(guān)系。高特異性對(duì)非特異性比例的結(jié)合表明所述細(xì)胞系可能含有肥胖蛋白受體。
5.通過(guò)使用選擇性抗體檢測(cè)ob受體的功能性形式，優(yōu)選功能性長(zhǎng)形式的蛋白。
6.通過(guò)Northern分析、RT-PCR分析或“狹線印跡”分析檢測(cè)ob受體的功能性形式，優(yōu)選功能性長(zhǎng)形式的mRNA。
7.在用肥胖蛋白處理后，檢測(cè)增加的c-fos mRNA?？梢允褂肗orthern分析、RT-PCR分析或“狹線印跡”分析檢測(cè)c-fos mRNA。
已知涉及到控制具體疾病狀態(tài)的某些方面、并且這些方面是正在尋找化合物加以治療的細(xì)胞系是優(yōu)選的。
得自于肝、腦、或胰組織的細(xì)胞系和成纖維細(xì)胞是用于分析針對(duì)肥胖或糖尿病的化合物的特別有用的“ob效應(yīng)”細(xì)胞。腦的某些區(qū)域是ob蛋白的重量控制效應(yīng)和能量平衡調(diào)控效應(yīng)的焦點(diǎn)。肝臟控制許多調(diào)節(jié)脂類(lèi)和葡萄糖水平的代謝過(guò)程。由這些器官特定區(qū)域得到的含有合適內(nèi)源JAK、STAT蛋白和其它介導(dǎo)肥胖蛋白的效應(yīng)所需胞內(nèi)蛋白的細(xì)胞是優(yōu)選的。
將效應(yīng)元件、報(bào)道基因、以及優(yōu)選地還有啟動(dòng)子恰當(dāng)?shù)夭迦胍环N能轉(zhuǎn)染ob效應(yīng)細(xì)胞系的載體。
合適的載體是可以作為商品買(mǎi)到的載體，如pGL2-基礎(chǔ)螢光素酶載體(Promega)。
所述載體的一種合理配置是將STAT DNA效應(yīng)元件置于一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)報(bào)道基因的上游。所述載體的一種更合理的配置是將多串聯(lián)重復(fù)(2-10)的STAT DNA效應(yīng)元件插入一個(gè)胸苷激酶啟動(dòng)子和一個(gè)螢光素酶報(bào)道基因的上游。
構(gòu)建一些載體，它們包含一個(gè)連接到最小化啟動(dòng)子上的報(bào)道基因，其中所述最小化啟動(dòng)子的例子有單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子或SV40啟動(dòng)子，所述報(bào)道基因的例子有螢火蟲(chóng)螢光素酶或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。使用在最小化啟動(dòng)子上游的合適的限制酶位點(diǎn)將STAT效應(yīng)元件的DNA片段插入所述載體。
使用常規(guī)表達(dá)技術(shù)將效應(yīng)元件、報(bào)道基因和啟動(dòng)子按照要求加入載體，如使用最小化啟動(dòng)子上游的合適限制酶位點(diǎn)將效應(yīng)元件的DNA片段插入載體。
可以如Lamb等人，Blood，1994，8，2063和Seidel等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.，1995，92，3041所述，構(gòu)建STAT效應(yīng)元件-螢光素酶報(bào)道基因系統(tǒng)。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)，用STAT效應(yīng)元件-最小化啟動(dòng)子-螢光素酶報(bào)道基因構(gòu)成物轉(zhuǎn)染ob效應(yīng)細(xì)胞。為糾正轉(zhuǎn)染效率的差異，可以用一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一段時(shí)間(12-24小時(shí))后，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。分析溶胞產(chǎn)物的螢光素酶活性，如果合適，分析β-半乳糖苷酶活性。通過(guò)在需評(píng)價(jià)的化合物中提前或同時(shí)加入合適濃度的ob蛋白并測(cè)量與ob蛋白單獨(dú)作用時(shí)相比螢光素酶反應(yīng)的增強(qiáng)或減弱，可以分析增強(qiáng)或拮抗劑的活性。已經(jīng)有分析螢光素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法(如Ow等人，Science，1986，234，856和de Wet等人，Mol.Cell Biol.，1987，7，725)以及一些商品試劑盒。
通過(guò)用報(bào)道基因構(gòu)成物和一個(gè)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)染一個(gè)“ob效應(yīng)”細(xì)胞系，可以產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。選擇標(biāo)記通常用于產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系，如Recombinant DNA，第二版，J.D.Watson等人，1992，216頁(yè)中所述。這些被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系能用于產(chǎn)生對(duì)模擬、增強(qiáng)或阻斷ob蛋白的生理效應(yīng)的化合物的高生產(chǎn)量分析(high throughput assay)。
本發(fā)明也延伸到用這里公開(kāi)的方法所鑒定的模擬、增強(qiáng)或抑制ob蛋白生理效應(yīng)的化合物。
本發(fā)明也延伸到部分改變以使用這里公開(kāi)的方法的試劑盒。
這里使用的“模擬ob蛋白生理效應(yīng)的化合物”所指的化合物能夠在不存在ob蛋白時(shí)，或是刺激ob蛋白受體以提供與ob蛋白切實(shí)相同的生理效應(yīng)，或激活這個(gè)受體下游(受體后的(post-receptor))反應(yīng)。
這里使用的“增強(qiáng)ob蛋白生理效應(yīng)的化合物”是指增強(qiáng)ob蛋白的效力和/或最大生理效應(yīng)的化合物。
這里使用的“抑制ob蛋白生理效應(yīng)的化合物”是指減弱或基本阻斷ob蛋白生理效應(yīng)的化合物。
可以將編碼所述多肽的功能形式的cDNA轉(zhuǎn)染并置于一個(gè)組成型啟動(dòng)子(如一個(gè)病毒性啟動(dòng)子)或一個(gè)可調(diào)控啟動(dòng)子的控制下，根據(jù)需要為鑒定激動(dòng)劑或拮抗劑來(lái)最優(yōu)化所述多肽的表達(dá)。或者，所述效應(yīng)元件和報(bào)道基因在一個(gè)細(xì)胞系中表達(dá)，其中一個(gè)組成型或可調(diào)控的啟動(dòng)子已經(jīng)用同源重組的方法插入ob蛋白受體的染色體編碼基因上游的一個(gè)位置。這樣的方法已經(jīng)由Waldman，Critical Review inOncology/Hematology，1992，12，49綜述，Riele等人，Proceeding of theNational Academy of Sciences，1992，89，5128給出了一個(gè)具體的例子。
下面的實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明，但并未在任何方面限制本發(fā)明。
實(shí)施例一般方法使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)所以一個(gè)報(bào)道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ob效應(yīng)細(xì)胞，其中所述報(bào)道質(zhì)粒包含一個(gè)最小化啟動(dòng)子(如單純皰疹病毒胸苷激酶)和一個(gè)螢光素酶報(bào)道基因構(gòu)成物上游的多個(gè)串聯(lián)重復(fù)拷貝的STAT效應(yīng)元件。為糾正轉(zhuǎn)染效率的差異，可以用一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一段時(shí)間(12-24小時(shí))后，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。分析溶胞產(chǎn)物的螢光素酶活性，如果合適，分析β-半乳糖苷酶活性。通過(guò)在需評(píng)價(jià)的化合物中提前或同時(shí)加入合適濃度的ob蛋白并測(cè)量與ob蛋白單獨(dú)作用時(shí)相比螢光素酶反應(yīng)的減弱，可以分析拮抗劑的活性。已經(jīng)有分析螢光素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法(如Ow等人，Science，1986，234，856和de Wet等人，Mol.Cell Biol.，1987，7，725)以及一些商品試劑盒。實(shí)施例1使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)用報(bào)道質(zhì)粒pGL2-基礎(chǔ)螢光素酶載體(Promega)轉(zhuǎn)染Gt1-7細(xì)胞(W.C.Wetsel，Cellular and Molecular Neurobiology，1995，15(1)，43)，其中所述質(zhì)粒包含有在最小化啟動(dòng)子(如單純皰疹病毒胸苷激酶(-35到+10))的上游對(duì)應(yīng)于四個(gè)串聯(lián)重復(fù)的STAT效應(yīng)元件TTCCCGGAA的寡核苷酸插入片段。為糾正轉(zhuǎn)染效率的差異，可以用一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一段時(shí)間(12-24小時(shí))后，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。分析溶胞產(chǎn)物的螢光素酶活性，如果合適，分析β-半乳糖苷酶活性。通過(guò)在需評(píng)價(jià)的化合物中提前或同時(shí)加入合適濃度的ob蛋白并測(cè)量與ob蛋白單獨(dú)作用時(shí)相比螢光素酶反應(yīng)的減弱，可以分析拮抗劑的活性。已經(jīng)有分析螢光素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法(如Ow等人，Science，1986，234，856和de Wet等人，Mol.Cell Biol.，1987，7，725)以及一些商品試劑盒。實(shí)施例2使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)用報(bào)道質(zhì)粒pGL2-基礎(chǔ)螢光素酶載體(Promega)轉(zhuǎn)染大鼠PC12細(xì)胞(L.A.Greene和A.S.Tischler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1976，73(7)，2424)，其中所述質(zhì)粒包含有在最小化啟動(dòng)子(如單純皰疹病毒胸苷激酶(-35到+10))的上游對(duì)應(yīng)于四個(gè)串聯(lián)重復(fù)的STAT效應(yīng)元件TTCCCGGAA的寡核苷酸插入片段。為糾正轉(zhuǎn)染效率的差異，可以用一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一段時(shí)間(12-24小時(shí))后，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。分析溶胞產(chǎn)物的螢光素酶活性，如果合適，分析β-半乳糖苷酶活性?？梢匀缟纤龇治鲛卓箘┖臀灩馑孛傅幕钚?。實(shí)施例3使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)用報(bào)道質(zhì)粒pGL2-基礎(chǔ)螢光素酶載體(Promega)轉(zhuǎn)染來(lái)自人類(lèi)紅白血病的HEL 92.1.7(ATCC TIB 180)細(xì)胞(P.Martin，Science，1982，216(4551)，1233)，其中所述質(zhì)粒包含有在最小化啟動(dòng)子(如單純皰疹病毒胸苷激酶(-35到+10))的上游對(duì)應(yīng)于四個(gè)串聯(lián)重復(fù)的STAT效應(yīng)元件TTCCCGGAA的寡核苷酸插入片段。為糾正轉(zhuǎn)染效率的差異，可以用一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一段時(shí)間(12-24小時(shí))后，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。分析溶胞產(chǎn)物的螢光素酶活性，如果合適，分析β-半乳糖苷酶活性?？梢匀缟纤龇治鲛卓箘┖臀灩馑孛傅幕钚?。實(shí)施例4使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)用報(bào)道質(zhì)粒pGL2-基礎(chǔ)螢光素酶載體(Promega)轉(zhuǎn)染從人類(lèi)慢性髓細(xì)胞性白血病得到的K562(ATCC CCL-243)細(xì)胞系(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1981，166，546和Blood，1975，45，321)，其中所述質(zhì)粒包含有在最小化啟動(dòng)子(如單純皰疹病毒胸苷激酶(-35到+10))的上游對(duì)應(yīng)于四個(gè)串聯(lián)重復(fù)的STAT效應(yīng)元件TTCCCGGAA的寡核苷酸插入片段。為糾正轉(zhuǎn)染效率的差異，可以用一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一段時(shí)間(12-24小時(shí))后，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。分析溶胞產(chǎn)物的螢光素酶活性，如果合適，分析β-半乳糖苷酶活性。可以如上所述分析拮抗劑和螢光素酶的活性。實(shí)施例5使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)用報(bào)道質(zhì)粒pGL2-基礎(chǔ)螢光素酶載體(Promega)轉(zhuǎn)染胰島瘤βTC-3細(xì)胞系(T.J.Kieffer等人，Biochem and Biophys.Res.Comm.，1996，224，552)，其中所述質(zhì)粒包含有在最小化啟動(dòng)子(如單純皰疹病毒胸苷激酶(-35到+10))的上游對(duì)應(yīng)于四個(gè)串聯(lián)重復(fù)的STAT效應(yīng)元件TTCCCGGAA的寡核苷酸插入片段。為糾正轉(zhuǎn)染效率的差異，可以用一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一段時(shí)間(12-24小時(shí))后，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。分析溶胞產(chǎn)物的螢光素酶活性，如果合適，分析β-半乳糖苷酶活性?？梢匀缟纤龇治鲛卓箘┖臀灩馑孛傅幕钚?。實(shí)施例6使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)用報(bào)道質(zhì)粒pGL2-基礎(chǔ)螢光素酶載體(Promega)轉(zhuǎn)染前脂肪細(xì)胞衍生的30A5細(xì)胞系(Y.Bai等人，J.Biol.Chem.，1996，271(24)，13939)，其中所述質(zhì)粒包含有在最小化啟動(dòng)子(如單純皰疹病毒胸苷激酶(-35到+10))的上游對(duì)應(yīng)于四個(gè)串聯(lián)重復(fù)的STAT效應(yīng)元件TTCCCGGAA的寡核苷酸插入片段。為糾正轉(zhuǎn)染效率的差異，可以用一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一段時(shí)間(12-24小時(shí))后，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。分析溶胞產(chǎn)物的螢光素酶活性，如果合適，分析β-半乳糖苷酶活性。可以如上所述分析拮抗劑和螢光素酶的活性。實(shí)施例7使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)用報(bào)道質(zhì)粒pGL2-基礎(chǔ)螢光素酶載體(Promega)轉(zhuǎn)染小鼠肌管C2 C12細(xì)胞系(Nature，1977，270，725)，其中所述質(zhì)粒包含有在最小化啟動(dòng)子(如單純皰疹病毒胸苷激酶(-35到+10))的上游對(duì)應(yīng)于四個(gè)串聯(lián)重復(fù)的STAT效應(yīng)元件TTCCCGGAA的寡核苷酸插入片段。為糾正轉(zhuǎn)染效率的差異，可以用一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一段時(shí)間(12-24小時(shí))后，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。分析溶胞產(chǎn)物的螢光素酶活性，如果合適，分析β-半乳糖苷酶活性?？梢匀缟纤龇治鲛卓箘┖臀灩馑孛傅幕钚?。實(shí)施例8使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)用報(bào)道質(zhì)粒pGL2-基礎(chǔ)螢光素酶載體(Promega)轉(zhuǎn)染卵巢SK-OV-3細(xì)胞，ATCC號(hào)HTB77，(J.Fogh和G Trempe，HumanTumour Cells In Vitro第155-159頁(yè)，J.Fogh(編輯)Plenum Press，NewYork，1975；J.Fogh和G Trempe J.Natl.Cancer Inst Bethesda，1977，587209-214)，其中所述質(zhì)粒包含有在最小化啟動(dòng)子(如單純皰疹病毒胸苷激酶(-35到+10))的上游對(duì)應(yīng)于四個(gè)串聯(lián)重復(fù)的STAT效應(yīng)元件TTCCCGGAA的寡核苷酸插入片段。為糾正轉(zhuǎn)染效率的差異，可以用一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一段時(shí)間(12-24小時(shí))后，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。分析溶胞產(chǎn)物的螢光素酶活性，如果合適，分析β-半乳糖苷酶活性?？梢匀缟纤龇治鲛卓箘┖臀灩馑孛傅幕钚浴?shí)施例9使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，如磷酸鈣法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)用報(bào)道質(zhì)粒pGL2-基礎(chǔ)螢光素酶載體(Promega)共轉(zhuǎn)染被肥胖蛋白受體的功能形式(Baumann等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，1996，8374-8378)轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞瘤衍生細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒包含有在最小化啟動(dòng)子(如單純皰疹病毒胸苷激酶(-35到+10))的上游對(duì)應(yīng)于四個(gè)串聯(lián)重復(fù)的STAT效應(yīng)元件TTCCCGGAA的寡核苷酸插入片段。為糾正轉(zhuǎn)染效率的差異，可以用一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的參比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一段時(shí)間(12-24小時(shí))后，用不同濃度的化合物處理細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。分析溶胞產(chǎn)物的螢光素酶活性，如果合適，分析β-半乳糖苷酶活性?？梢匀缟纤龇治鲛卓箘┖臀灩馑孛傅幕钚浴?shí)施例10使WRL68細(xì)胞在同時(shí)存在10％胎牛血清的其標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)匯合。在細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無(wú)血清培養(yǎng)基中至少18小時(shí)(降低血清濃度也可以產(chǎn)生相似效果)。然后以5分鐘到2小時(shí)的不同時(shí)間長(zhǎng)度用肥胖蛋白或血清(作為c-fos上調(diào)的陽(yáng)性對(duì)照)處理血清饑餓的細(xì)胞。從細(xì)胞中提取RNA并進(jìn)行凝膠電泳和Northern印跡。用一個(gè)c-fos標(biāo)記探針探測(cè)印跡RNA以分析c-fos的表達(dá)，通過(guò)分析β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)來(lái)使數(shù)據(jù)歸一化。肥胖蛋白處理如同陽(yáng)性對(duì)照血清處理一樣，顯著增強(qiáng)了WRL68細(xì)胞中c-fos的表達(dá)(表1)，并因此預(yù)期會(huì)激活STAT。因此可以預(yù)期將WRL68細(xì)胞用于對(duì)肥胖蛋白模擬物的鑒定是合適的。其它細(xì)胞系也可以通過(guò)分析響應(yīng)肥胖蛋白的c-fos表達(dá)來(lái)進(jìn)行鑒定。
權(quán)利要求
1.模擬、增強(qiáng)或抑制ob蛋白生理效應(yīng)的化合物的檢測(cè)方法，所述方法包括(a)對(duì)于模擬ob蛋白生理效應(yīng)的化合物來(lái)說(shuō)，評(píng)估所述化合物對(duì)連接了一個(gè)報(bào)道基因的受ob蛋白激活的轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和激活劑(STAT)DNA效應(yīng)元件的作用；或(b)對(duì)于增強(qiáng)或抑制ob蛋白生理效應(yīng)的化合物來(lái)說(shuō)，評(píng)估所述化合物對(duì)連接了一個(gè)報(bào)道基因的受ob蛋白激活的STAT DNA效應(yīng)元件上ob蛋白所提供的響應(yīng)的影響；其中所述效應(yīng)元件和所述報(bào)道基因在一個(gè)ob蛋白效應(yīng)細(xì)胞系中表達(dá)，所述細(xì)胞系選自以下的細(xì)胞系下丘腦衍生細(xì)胞系；嗜鉻細(xì)胞瘤衍生細(xì)胞系；造血衍生細(xì)胞系；胰衍生細(xì)胞系；肝衍生細(xì)胞系；前脂肪細(xì)胞衍生細(xì)胞系；骨骼肌衍生細(xì)胞系；和卵巢衍生細(xì)胞系；或所述效應(yīng)元件和所述報(bào)道基因在一個(gè)細(xì)胞系中表達(dá)，所述細(xì)胞系(工程改造的細(xì)胞系)還被一種多肽轉(zhuǎn)染并含有合適的STAT蛋白，其中所述多肽能刺激受ob蛋白激活的STAT DNA效應(yīng)元件。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述下丘腦衍生細(xì)胞系是神經(jīng)元GT1-7細(xì)胞系。
3.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述嗜鉻細(xì)胞瘤衍生細(xì)胞系是腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤大鼠PC12細(xì)胞。
4.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述造血衍生細(xì)胞系是從人類(lèi)紅白血病得到的HEL 92.1.7(ATCC TIB 180)細(xì)胞系或從人類(lèi)慢性髓細(xì)胞性白血病得到的K562(ATCC CCL-243)細(xì)胞系。
5依照權(quán)利要求1的方法，其中所述胰衍生細(xì)胞系是Beta TC-3細(xì)胞系或RIN5mF細(xì)胞。
6.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述前脂肪細(xì)胞衍生細(xì)胞系是30A5細(xì)胞系或分化型3T3-L1或分化型3T3-F442A細(xì)胞系。
7.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述肝衍生細(xì)胞系是HepG2細(xì)胞系或WRL68肝細(xì)胞和Change肝細(xì)胞。
8依照權(quán)利要求1的方法，其中所述骨骼肌衍生細(xì)胞系是小鼠肌管C2 C12細(xì)胞系。
9.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述卵巢衍生細(xì)胞系是SK-OV-3細(xì)胞系，ATCC號(hào)HTB77。
10.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述能刺激ob蛋白激活的STAT DNA效應(yīng)元件的多肽是肥胖蛋白的一種功能性同種型。
11.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述效應(yīng)元件連接到一個(gè)啟動(dòng)子基因、優(yōu)選一個(gè)最小化啟動(dòng)子上。
12.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述效應(yīng)元件是式TT(N)nAA的核苷酸，式中的N是任何核苷酸，n是4、5或6。
13 依照權(quán)利要求12的方法，其中所述效應(yīng)元件是TTCCCGGAA。
全文摘要
模擬、增強(qiáng)或抑制ob蛋白生理效應(yīng)的化合物的檢測(cè)方法,所述方法包括:(a)對(duì)于模擬ob蛋白生理效應(yīng)的化合物來(lái)說(shuō),評(píng)估所述化合物對(duì)連接了一個(gè)報(bào)道基因的受ob蛋白激活的轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和激活利(STAT)DNA效應(yīng)元件的作用;或(b)對(duì)于增強(qiáng)或抑制ob蛋白生理效應(yīng)的化合物來(lái)說(shuō),評(píng)估所述化合物對(duì)連接了一個(gè)報(bào)道基因的受ob蛋白激活的STAT DNA效應(yīng)元件上ob蛋白所提供的響應(yīng)的影響;其中所述效應(yīng)元件和所述報(bào)道基因在一個(gè)ob蛋白效應(yīng)細(xì)胞系中表達(dá),所述細(xì)胞系選自以下的細(xì)胞系:下丘腦衍生細(xì)胞系;嗜鉻細(xì)胞瘤衍生細(xì)胞系;造血衍生細(xì)胞系;胰衍生細(xì)胞系;肝衍生細(xì)胞系;前脂肪細(xì)胞衍生細(xì)胞系;骨骼肌衍生細(xì)胞系;和卵巢衍生細(xì)胞系;或所述效應(yīng)元件和所述報(bào)道基因在一個(gè)細(xì)胞系中表達(dá),所述細(xì)胞系(工程改造的細(xì)胞系)還被一種多肽轉(zhuǎn)染并含有合適的STAT蛋白,其中所述多肽能刺激受ob蛋白激活的STAT DNA效應(yīng)元件。
文檔編號(hào)C07K14/72GK1242055SQ9718098
公開(kāi)日2000年1月19日 申請(qǐng)日期1997年10月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月30日
發(fā)明者L·J·比利 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司