本發(fā)明涉及生物技術(shù)制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌肽融合蛋白及其制備方法，以及該融合蛋白在制備抗菌藥物中的應用。

背景技術(shù)：

抗菌肽(antimicrobialpeptides.amps)是生物體在受到病原微生物侵襲時自身誘導產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的小分子多肽,是天然免疫的主要成分，一般由20-60個氨基酸殘基組成，耐高溫、耐酸、水溶性好、抗菌譜廣、抗菌機制特殊、殺菌快速且不產(chǎn)生耐藥性。很多抗菌肽不僅能在較低濃度下有效抑制細菌、病毒、真菌和原蟲等多種病原微生物的生長，甚至還可以殺死腫瘤細胞,而對正常的沒有發(fā)生病變的真核細胞幾乎沒有作用。在食品工業(yè)上，抗菌肽可以作為食品保藏劑添加到食品中，減少有害防腐劑的使用。在臨床應用上，抗菌肽可用于抗感染、抗病毒和抗腫瘤和提高免疫力等。例如將短桿菌肽s和黏菌素b混合，可用于五官和局部傷口的抗感染治療。在醫(yī)藥行業(yè)上，抗菌肽的應用最為廣泛，發(fā)展前景最好，目前科研人員在這一領(lǐng)域取得了豐碩的成果，如：國內(nèi)的黃自然利用柞蠶抗菌肽研制的治療肝炎的“五齡丸”。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上，水生生物抗菌肽的高效抗病毒、抗菌作用等為水產(chǎn)養(yǎng)殖的抗病害問題提供了新的解決方案。在禽畜養(yǎng)殖業(yè)上，抗菌肽成為新型飼料添加劑進入人們的視野。在動物飼料中添加抗菌肽可以抑制病菌繁殖，改善動物腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高動物生產(chǎn)性能。

天蠶素cecropin是世界上發(fā)現(xiàn)最早、研究最徹底、效果最明顯的一類抗菌肽，是昆蟲非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，一般由31～39個氨基酸組成，分子量約為3.5～4kd左右，其分子結(jié)構(gòu)相對保守，主要由α螺旋構(gòu)成，屬于α螺旋類抗菌肽。這類抗菌肽熱穩(wěn)定性好、無免疫原性、抗菌能力強，能有效抑制格蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長。除此之外，天蠶素鯊肝肽具有抗病毒活性，抗寄生蟲和原蟲作用，抗腫瘤活性，具有免疫調(diào)節(jié)，促中性粒細胞、t細胞的化學趨勢，促進傷口愈合等作用。目前，天蠶素抗菌肽已應用在動物生產(chǎn)中、植物方面等，如：在動物日糧中添加天蠶素抗菌肽能夠提高動物的生長性能，增強免疫力，改善動物腸道結(jié)構(gòu)，促進免疫器官發(fā)育，提高免疫器官指數(shù)，提高免疫力，控制炎性反應，改善動物腸道菌群，減少應激，改善飼料轉(zhuǎn)化率；將天蠶素抗菌肽轉(zhuǎn)入糧食作物、經(jīng)濟作物、果樹、蔬菜等植物中，可以培育出抗病能力強的植物新品種。

但目前，抗菌肽大多都是單獨存在而發(fā)揮其抗菌功能，對不同菌株的殺菌能力還是存在一定的局限性，且抗菌活性也有待提高?，F(xiàn)代研究認為：目前最具潛力成為抗生素替代品的是抗菌肽，天蠶素是目前研究比較清楚的抗菌肽。由于人工合成抗菌肽的技術(shù)瓶頸多、工藝復雜，而且合成成本昂貴，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。單一提純物在使用時還可能具有溶血性問題，所以現(xiàn)在應用在人上的天蠶素抗菌肽基本上都是通過誘導家蠶或柞蠶產(chǎn)生的天蠶素與這些物質(zhì)的初級混合物，作為保健食品使用，但其中含有的天蠶素抗菌肽是極微的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對以上現(xiàn)有技術(shù)，提供一種抗菌肽融合蛋白以及該融合蛋白的制備方法，該融合蛋白的表達體系蛋白表達量大，利于純化復性和保持活性，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，且更為重要的是，表達出的融合蛋白抗菌活性強、穩(wěn)定性高、對宿主毒害作用小，其本身和編碼基因可應用于抗菌藥物制備中，能為抗菌藥物制備提供新的良好的材料來源。

肝臟細胞刺激因子(hepaticstimulatorsubstance,hss)是一類肝特異性刺激因子，最初發(fā)現(xiàn)于胎肝或再生肝中，它具有促進肝細胞再生，刺激肝細胞合成dna并進行有絲分裂的功能，能啟動肝細胞增殖和修復肝損傷。鯊肝活性肽apsl(鯊肝肽)是一種近似hss活性物質(zhì)，具備調(diào)節(jié)免疫、增加肝細胞增殖、修復及改善胰島β細胞損害的功能，對肝損害及糖尿病有潛在醫(yī)治作用，此外在肝損害治療時能夠調(diào)節(jié)免疫起到輔助作用。鯊魚是豐富的海洋資源，其肝臟占自身內(nèi)臟的75％，具有強烈的增強免疫的作用。我們從鯊魚肝臟cdna文庫中篩選的長度為105bp、等電點為11.42的鯊肝活性肽orf-863基因具有潛在的抗菌活性(orf-863一共34個氨基酸，含有14個疏水性氨基酸和18個正電荷氨基酸，而這些正是融合蛋白抗菌的機理：通過疏水作用和正電荷的促進作用與細菌細胞膜結(jié)合，從而通過膜穿孔和和非膜穿孔形式導致細菌死亡)。天蠶素和鯊肝活性肽orf-863融合表達得到的融合蛋白有可能會是具有更高活性和穩(wěn)定性的新型抗菌肽，因此我們構(gòu)建了petdute-his-sumo-apsl-cecropin重組表達載體和petdute-his-sumo-cecropin-apsl重組表達載體來進行融合蛋白的表達。注：這是做鯊肝肽和天蠶素融合蛋白的原因。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種抗菌肽融合蛋白，該蛋白包括抗菌肽天蠶素cecropin蛋白、orf-863鯊肝肽蛋白，所述抗菌肽天蠶素cecropin蛋白與orf-863鯊肝肽蛋白之間通過3gsa柔性肽片段連接，所述抗菌肽天蠶素cecropin蛋白氨基酸序列如seqidno.1所示，所述orf-863鯊肝肽蛋白氨基酸序列如seqidno.2所示，所述3gsa柔性肽片段如seqidno.3所示。即該蛋白從n端-c端依次包含了抗菌肽天蠶素cecropin蛋白、3gsa柔性肽、orf-863鯊肝肽蛋白，或orf-863鯊肝肽蛋白、3gsa柔性肽、抗菌肽天蠶素cecropin蛋白。

該蛋白是抗菌肽天蠶素cecropin蛋白編碼基因、orf-863鯊肝肽編碼基因、以及位于抗菌肽天蠶素cecropin蛋白編碼基因與orf-863鯊肝肽編碼基因之間的3gsa柔性肽編碼基因在基因水平融合后在原核表達的可溶性重組蛋白。所述抗菌肽融合蛋白的編碼基因序列如seqidno.4所示或如seqidno.5所示。

上述抗菌肽融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

(1)采用人工合成的方法獲得包含抗菌肽天蠶素cecropin蛋白編碼基因序列、3gsa柔性肽編碼基因序列、orf-863鯊肝肽編碼基因的orf-863融合基因序列和orf-863s融合基因序列，分別如seqidno.4所示、如seqidno.5所示；

(2)以petduet質(zhì)粒為載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌e.colitg1中，通過鑒定、篩選，得到陽性克?。?/p>

(3)將陽性克隆轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌bl21中，通過氨芐青霉素抗生素的篩選獲得表達菌株；

(4)挑取陽性單克隆至lb培養(yǎng)基，lb培養(yǎng)基中含50ug/ml氨芐青霉素，37℃培養(yǎng)至od600為0.5～0.7左右，加入終濃度1mm的iptg進行蛋白誘導，誘導條件為16℃培養(yǎng)16～20h，得到在上清表達的帶sumo標簽的融合蛋白；

(5)對得到的帶sumo標簽的融合蛋白進行濃縮，然后切除sumo標簽，得到抗菌肽融合蛋白。

作為優(yōu)選，步驟(4)中陽性單克隆培養(yǎng)至od600為0.6，此時大腸桿菌處于生長的對數(shù)期，有利于融合蛋白的大量表達，加入iptg16℃培養(yǎng)20h再進行蛋白誘導，有利于融合蛋白表達在上清中。

本發(fā)明進一步提供上述抗菌肽融合蛋白在制備抗菌藥物中的應用。

本發(fā)明還進一步提供上述抗菌肽融合蛋白的編碼基因在制備抗菌藥物中的應用。

生物領(lǐng)域內(nèi)對天蠶素和其他基因融合表達的研究并不多，本發(fā)明是生物領(lǐng)域內(nèi)首次進行鯊肝活性肽和天蠶素基因融合蛋白的表達及其活性研究，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點和有益效果：

(1)通過對抗菌肽基因和orf-863鯊肝肽基因的選擇，以及柔性肽和標簽蛋白的選擇和合適排布，采取基因工程的方法設(shè)計融合基因，把抗菌肽天蠶素cecropin和orf-863鯊肝肽基因密碼子串聯(lián)并在二者間插入3gsa柔性肽的方法，以sumo為融合蛋白，petduet為載體，在工程菌e.colibl21(de3)內(nèi)成功表達在上清的抗菌肽融合蛋白，表達量大，活性高，有利于保證后期純化復性及融合蛋白活性，該抗菌肽融合蛋白活性強、穩(wěn)定性高、對宿主毒害作用?。?/p>

(2)以往在研究目的蛋白的抗菌活性時，目的蛋白需要進行鎳柱純化、透析、超濾濃縮才能取得抑菌試驗的成功，證明目的蛋白具有抑菌活性。本研究的天蠶素基因和orf863鯊肝肽基因融合的orf863、orf863s重組蛋白在超聲破碎取得上清后只進行了超濾濃縮就取得了抑菌試驗的成功，證明了orf863、orf863s融合蛋白具有抑菌活性，而且抑菌圈明顯。本實驗結(jié)果說明了orf863、orf863s融合蛋白具有較高的表達量和抗菌活性。本研究解決了天然抗菌肽表達量低，對宿主傷害大的問題。orf863、orf863s或其編碼基因可應用于抗菌藥物制備中，這為研制新一代的抗菌藥物打下了基礎(chǔ)，對研發(fā)新型高效的抗菌肽具有重要意義。在動物飼養(yǎng)、植物培育、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面具有廣泛的應用。

(3)鯊肝肽orf-863基因和天蠶素cecropin基因融合蛋白具有一定的穩(wěn)定性，超聲破碎后的上清放在-20℃冰箱后再次進行抑菌活性實驗，融合蛋白依然具有抑菌活性，說明該融合蛋白具有一定的穩(wěn)定性，有利于融合蛋白的長時間保存和大量生產(chǎn)。

(4)從氨基酸序列來看，天蠶素cecropin和鯊肝肽apsl的融合基因表達出的融合蛋白氨基酸的氨基端具有支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)，而且鯊肝肽orf-863基因和天蠶素cecropin基因融合蛋白也較一般的融合蛋白體內(nèi)體外的穩(wěn)定性更強。也明顯可以得出天蠶素cecropin和鯊肝肽apsl兩者之間具有一般基因融合預料不到的協(xié)同增效作用和預料不到的穩(wěn)定性作用。

附圖說明

圖1所示的是本發(fā)明實施例1中重組表達載體的雙酶切鑒定電泳圖，其中m:marker，1:orf-863雙酶切結(jié)果，2:orf-863s雙酶切結(jié)果；

圖2所示的是本發(fā)明實施例2中重組質(zhì)粒誘導表達的sds-page鑒定圖，其中7：orf-863基因工程菌未誘導的菌液，8：orf-863基因工程菌誘導后的菌液，11：orf-863s基因工程菌未誘導的菌液，12：orf-863s基因工程菌誘導后的菌液；

圖3所示的是本發(fā)明實施例2中重組質(zhì)粒誘導表達的sds-page檢測融合蛋白的表達存在形式圖，其中3：orf-863基因工程菌的誘導蛋白超聲波破碎上清，4：orf-863基因工程菌的誘導蛋白超聲波破碎沉淀，5：orf-863s基因工程菌的誘導蛋白超聲波破碎上清，6：orf-863s基因工程菌的誘導蛋白超聲波破碎沉淀；

圖4所示的是本發(fā)明實施例3中重組蛋白的抑菌活性檢測圖，其中水是陰性對照，amp是陽性對照，863是重組蛋白orf-863對革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌)抑菌活性檢測圖；

圖5所示的是本發(fā)明實施例3中重組蛋白的抑菌活性檢測圖，其中水是陰性對照，amp是陽性對照，863是重組蛋白orf-863對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌tg1)抑菌活性檢測圖；

圖6所示的是本發(fā)明實施例3中重組蛋白的抑菌活性檢測圖，其中水是陰性對照，amp是陽性對照，863s是重組蛋白orf-863s對革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌)抑菌活性檢測圖；

圖7所示的是本發(fā)明實施例3中重組蛋白的抑菌活性檢測圖，其中水是陰性對照，amp是陽性對照，863s是重組蛋白orf-863s對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌tg1)抑菌活性檢測圖；

圖8：重組蛋白orf863的蛋白三級結(jié)構(gòu)模擬圖(白色：β轉(zhuǎn)角，亮灰色：氫鍵，深灰色：α螺旋)；

圖9：重組蛋白orf863s的蛋白三級結(jié)構(gòu)模擬圖(淺灰色：α螺旋，深灰色：氫鍵，灰色：β轉(zhuǎn)角)。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步具體描述。應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發(fā)明提供進一步的說明。除非另有說明，本發(fā)明使用的所有科學和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。

材料和試劑：

1.菌種、質(zhì)粒：

e.colitg1菌株、e.colibl21菌株、枯草芽孢桿菌菌株及質(zhì)粒pet-duet-his-sumo由中國科學院上海藥物研究所贈予；菌株pet-duet-his-sumo-cecropin由浙江理工大學生物實驗室在質(zhì)粒pet-duet-his-sumo的基礎(chǔ)上自行構(gòu)建，其中的天蠶素cecropin基因序列同seqidno.6。

2.主要酶類及其生化試劑：

瓊脂糖購自boehringermannheim公司；蛋白胨(tryptone)、酵母提取物(yeastextract)購自英國oxoid公司；限制性內(nèi)切酶、t4dnaligase及其相關(guān)試劑是takara的產(chǎn)品；amp、iptg為promega公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。所需重組基因由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。常規(guī)試劑配制如無特別說明，均參照《分子克隆實驗指南》第三版。

實施例1：重組表達載體的構(gòu)建

1.目的片段的設(shè)計與合成

通過ncbi數(shù)據(jù)庫獲得天蠶素cecropin核酸序列(如seqidno.6所示)，在本實驗室的鯊肝小肽cdna數(shù)據(jù)庫中找到鯊肝肽orf-863基因(如seqidno.7所示)，orf-863鯊肝肽是從條紋斑竹鯊再生肝臟cdna文庫中篩選出的等電點為11.42的可能具有潛在生物學活性的鯊肝肽orf-863基因翻譯的小肽，在兩個核苷酸序列中間加入3個串聯(lián)片段(gly+ser+ala)編碼基因(如seqidno.8所示)，形成天蠶素cecropin+3gsa編碼片段+鯊肝肽orf-863融合基因(下簡稱orf-863s融合基因，如seqidno.4所示)和鯊肝肽orf-863+3gsa編碼片段+天蠶素cecropin融合基因(下簡稱orf-863s融合基因，如seqidno.5所示)，并在其5’端加上bamhi酶切位點，3’端加上xhoi酶切位點，委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

序列seqidno.4翻譯成的氨基酸序列如seqidno.9所示，序列seqidno.5翻譯成的氨基酸序列如seqidno.10所示。

本發(fā)明為了確保預表達的兩個融合蛋白的空間構(gòu)象不受干擾，利用3個串聯(lián)片段(gly+ser+ala)將天蠶素cecropin和orf-863鯊肝肽鉸鏈起來，這樣有利于兩個蛋白的天然構(gòu)象不發(fā)生改變。

2.重組表達載體的構(gòu)建和篩選

orf-863融合基因與orf-863s融合基因分別用bamhi酶和xhoi酶雙酶切獲得目的片段，得到的目的片段分別克隆至載體petduet-his-sumo上，構(gòu)建兩個重組質(zhì)粒petduet-his-sumo-orf-863(下簡稱orf-863重組質(zhì)粒)和petduet-his-sumo-orf-863s(下簡稱orf-863s重組質(zhì)粒)。

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，雙酶切后在250bp-500bp之間有清晰條帶，融合目的基因大小為255bp，與瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶大小相符，petduet-his-sumo載體大小為5684bp，與電泳結(jié)果相符，如圖1。

將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到e.colitg1大腸桿菌，將含有重組質(zhì)粒的tg1大腸桿菌送到生工生物公司進行測序，結(jié)果顯示重組載體構(gòu)建成功，并未發(fā)生基因突變。

實施例2：融合蛋白的誘導表達和濃縮

1.重組融合蛋白的誘導表達

測序正確后，提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到bl21(de3)大腸桿菌，進行誘導表達。

成功構(gòu)建的兩種工程菌接種于100mllb培養(yǎng)液，分別于37℃恒溫搖床培養(yǎng)至a600值為0.6左右，再加入iptg至終濃度為1mmol/l，16℃誘導20h，12000rpm離心收集菌體，pbs洗滌兩次后，將誘導后的重組菌超聲破碎30min，超聲3s，停3s，然后12000rpm離心25min，分別取上清和沉淀，sds-page電泳檢測表達產(chǎn)物的存在形式，結(jié)果如圖2所示。

重組菌經(jīng)iptg誘導和超聲裂解后的電泳結(jié)果顯示：與陰性對照組相比，在30kda左右有明顯特異性條帶，與重組融合蛋白orf-863和重組融合蛋白orf-91-863s預測大小相符，并且表達的重組融合蛋白存在于超聲上清液中(圖3)。

2.重組融合蛋白的濃縮及sumo肽的切除

重組融合蛋白濃縮：將經(jīng)過sds-page電泳檢測驗證后表達在上清的重組融合蛋白溶液進行超濾濃縮。

切除sumo肽：在濃縮的重組融合蛋白溶液中加入sumo蛋白酶(按照1:100的比例混勻)，4℃酶切過夜，切除sumo肽。

體外保存試驗表明，在大腸桿菌中表達的融合蛋白比較穩(wěn)定，在-20℃存放一段時間后，活性未發(fā)生明顯改變，這就避免了體外表達蛋白容易降解的矛盾。

實施例3：牛津杯法檢測抑菌活性

重組蛋白orf-863與重組蛋白orf-863s抑菌活性檢測

將121℃、20min滅過菌的瓊脂粉和固體培養(yǎng)基拿到超凈臺中，先將瓊脂粉倒薄薄的一層于玻璃培養(yǎng)皿上，再將活化好的tg1大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別加到溫度降至為大約50℃左右的固體培養(yǎng)基中，待瓊脂粉凝固后將含有菌液的固體培養(yǎng)基進行倒板。待平板凝固后，將滅過菌、經(jīng)酒精燈火焰灼燒后的牛津杯放到平板上產(chǎn)生加樣孔，向牛津杯中分別加入200μl的amp(1mg/ml)、ddh2o、orf863、orf863s，amp為陽性對照，ddh2o為陰性對照。37℃培養(yǎng)過夜后觀察抑菌圈的大小，判斷樣品的抗菌活性。

結(jié)果顯示：重組蛋白orf-863與重組蛋白orf-863s在革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌檢測平板上均產(chǎn)生了抑菌圈，在革蘭氏性菌上形成的抑菌圈但在革蘭氏陽性菌上形成的抑菌圈比在革蘭氏陰性菌上形成的抑菌圈大。因此，可以初步判斷重組蛋白orf-863與重組蛋白orf-863s對革蘭氏陽性菌有抑菌活性且活性較強，對革蘭氏陰性菌有抑菌效果但活性較弱，如圖4，圖5，圖6，圖7。

綜合上述實驗結(jié)果可以得出結(jié)論：重組蛋白orf-863與重組蛋白orf-863s對革蘭氏陽性菌有抑菌活性且活性較強，對革蘭氏陰性菌有抑菌效果但活性較弱。抑菌活性實驗表明產(chǎn)物具有較高的抗菌活性，表明本發(fā)明orf-863鯊肝肽和天蠶素cecropin融合蛋白或者融合基因可應用于抗菌藥物制備中，這為研制新一代的抗菌藥物打下了基礎(chǔ)，對研發(fā)新型高效的抗菌肽具有重要意義。在動物飼養(yǎng)、植物培育、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面具有廣泛的應用。

從orf-863鯊肝肽和天蠶素cecropin融合蛋白的序列特征可以推測，比較天蠶素cecropin和與orf-863鯊肝肽融合后的序列，發(fā)現(xiàn)融合后的蛋白比天蠶素多了很多疏水性氨基酸和正電荷(orf-863一共34個氨基酸，含有14個疏水性氨基酸和18個正電荷氨基酸)，而這些正是融合蛋白抗菌的機理：通過疏水作用和正電荷的促進作用與細菌細胞膜結(jié)合，從而通過膜穿孔和和非膜穿孔形式導致細菌死亡。除此之外，天蠶素氨基酸和orf863鯊肝肽氨基酸的氨基端具有支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)，這也是融合蛋白orf863、orf863s具有活性的一個原因。因此從氨基酸序列來看，融合后的蛋白具有增加了天蠶素cecropin和鯊肝肽apsl的抗菌活性的潛力。

鯊肝肽orf-863基因和天蠶素cecropin基因融合蛋白具有一定的穩(wěn)定性，超聲破碎后的上清放在-20℃冰箱后再次進行抑菌活性實驗，融合蛋白依然具有抑菌活性，說明該融合蛋白具有一定的穩(wěn)定性，我們后續(xù)會進行具體實驗分析融合蛋白的體內(nèi)穩(wěn)定性和體外穩(wěn)定性。利用高效液相色譜對融合蛋白進行體外穩(wěn)定性分析；通過制備多克隆抗體測其半衰期對融合蛋白進行體內(nèi)穩(wěn)定性分析。

圖8：重組蛋白orf863的蛋白三級結(jié)構(gòu)模擬圖(白色：β轉(zhuǎn)角，亮灰色：氫鍵，深灰色：α螺旋)。圖9：重組蛋白orf863s的蛋白三級結(jié)構(gòu)模擬圖(淺灰色：α螺旋，深灰色：氫鍵，灰色：β轉(zhuǎn)角)。

從融合蛋白orf863、orf863s的三級結(jié)構(gòu)模擬圖中可以發(fā)現(xiàn)，在2個融合蛋白中分別有2個α螺旋、2個β轉(zhuǎn)角以及較多的氫鍵，比單一的天蠶素蛋白、鯊肝肽蛋白多了一些二級結(jié)構(gòu)。α-螺旋(α-helix)是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式之一，多肽鏈主鏈圍繞中心軸呈有規(guī)律的螺旋式上升，每3.6個氨基酸殘基螺旋上升一圈，向上平移0.54nm，兩個氨基酸殘基之間的距離為0.15nm，螺旋的方向為右手螺旋，氨基酸側(cè)鏈r基團伸向螺旋外側(cè)，每個肽鍵的n-h和第四個肽鍵的羰基氧形成氫鍵，氫鍵的方向與螺旋長軸基本平行，肽鏈中的全部肽鍵都可形成氫鍵，α-螺旋十分穩(wěn)定。β-轉(zhuǎn)角(β-turn)是一種簡單的非重復性結(jié)構(gòu)，是一種常見的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，含有極性和帶電荷的氨基酸殘基。β-轉(zhuǎn)角中第一個殘基的c＝o與第四個殘基的n-h氫鍵鍵合形成一個緊密的環(huán),使β-轉(zhuǎn)角成為比較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。分子內(nèi)、分子間的氫鍵能使蛋白質(zhì)更為穩(wěn)定。這些正是融合蛋白更為穩(wěn)定的原因。

本發(fā)明實施例涉及到的材料、試劑和實驗設(shè)備，如無特別說明，均為符合生物工程技術(shù)領(lǐng)域的市售產(chǎn)品。

以上所述，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)的前提下，還可以做出改進和潤飾，這些改進和潤飾也應屬于本發(fā)明的專利保護范圍。與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應認為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。

序列表：

seqidno.1：

kwklfkkiekvgqrvrdavisagpavatvaqatalak

seqidno.2：

vippqrqppptralppnthdterarshkaqrpeg

seqidno.3：

gsagsagsa

seqidno.4：

gtgattccgccgcagcgtcagcctccccctacacgtgcactgccgccgaatacccatgataccgaacgcgcacgtagccataaagcccagcgcccggaaggtggtagcgccggtagcgccggcagcgcaaaatggaaactgtttaagaaaattgaaaaagttggccagcgcgtgcgcgatgcagtgattagcgccggtccggcagttgcaaccgttgcacaggccaccgcactggccaaa

seqidno.5：

aaatggaaactgtttaagaaaattgaaaaagtgggccagcgcgtgcgcgatgccgttattagcgccggtccggcagttgcaaccgttgcacaggcaaccgccctggccaaaggtagcgcaggtagcgccggtagcgccatgattgtgagcctgcgcggtgccgtgaaactggtgctgattccgaccctgatcaagggcccgagctacaaaatcaccaacccgttcctgagcagcccgagc

seqidno.6：

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seqidno.7：

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seqidno.9：

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seqidno.10：

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序列表：

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seqidno.2：

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seqidno.3：

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seqidno.4：

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seqidno.5：

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