本發(fā)明涉及免疫學(xué)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體是采用雜交瘤方法生產(chǎn)一種能夠快速裂解血小板栓塊并抑制血管內(nèi)皮新生的單克隆抗體5a10及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

動脈血栓形成是心血管、腦血管和外周動脈疾病共同的病理生理機(jī)制。它對人類健康危害極大，可引起相應(yīng)器官，尤其是心腦等重要臟器出現(xiàn)缺血、缺氧性壞死，危及生命。血小板在動脈血栓形成過程中起著關(guān)鍵性作用。動脈粥樣硬化斑塊損傷或破裂后可誘發(fā)血小板粘附、聚集在受損內(nèi)皮，形成血栓，堵塞血管。目前臨床常用的抗血小板藥物：如血栓烷素抑制劑(阿司匹林)，adp受體抑制劑(氯吡格雷)，血小板膜糖蛋白iib/iiia(gpiib/iiia)受體抑制劑(阿昔單抗)等都是通過抑制正常血小板的粘附、激活和聚集功能來預(yù)防血小板激活及栓塊的形成。但對已形成的血小板栓塊無作用。因此，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用方式將具有重要臨床意義和社會價值。

整合素包括a和β兩種亞基。血小板上存在有整合素aiibβ3，而血管內(nèi)皮細(xì)胞上存在整合素avβ3。它們共有的是整合素β3亞基。血小板上的整合素aiibβ3與血小板的粘附、激活、聚集及血栓形成相關(guān)。而血管內(nèi)皮細(xì)胞上的整合素avβ3與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)特性相關(guān)。前期研究中，發(fā)現(xiàn)一類特殊的抗血小板整合素β3(gpiiia)的抗體。它與血小板膜gpiiia49-66表位結(jié)合后，可激活血小板內(nèi)ros氧化通路，氧化破碎血小板。動物實驗發(fā)現(xiàn)，這類抗體的(多克隆抗體或噬菌體單鏈片段形式)可溶解動脈血栓中的血小板團(tuán)塊，縮小卒中大鼠的腦梗死面積。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

血小板膜gpiiia49-66免疫表位在人和鼠之間具有高度同源性，可高達(dá)83％。利用gpiiia49-66片段免疫正常balb/c小鼠時無法獲得相應(yīng)的單克隆抗體。本發(fā)明的目的是通過用gpiiia49-66片段免疫整合素gpiiia缺失型balb/c小鼠并結(jié)合雜交瘤技術(shù)，首次制備出一種能夠快速裂解血小板栓塊并抑制血管內(nèi)皮新生的抗血小板整合素糖蛋白iiia單克隆抗體5a10；5a10可裂解血小板栓塊，亦可抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)增殖、遷移和管型形成。能夠用于制備治療動脈血栓性疾病及腫瘤疾病的藥物。其單克隆抗體5a10的制備方法具有快速、穩(wěn)定，且適合工業(yè)化生產(chǎn)。

實現(xiàn)本發(fā)明目的的具體技術(shù)方案是：

一種抗血小板整合素糖蛋白iiia單克隆抗體5a10，特點在于該單克隆抗體5a10是通過用血小板整合素gpiiia49-57片段免疫整合素gpiiia缺陷型balb/c小鼠，并采用雜交瘤方法制備而得，其抗體的重鏈為igg1型，輕鏈為κ型，抗體分子量為150kda。

一種上述抗血小板整合素糖蛋白iiia單克隆抗體5a10的制備方法，該方法包括以下步驟：

a)將化學(xué)合成的血小板整合素gpiiia49-57小肽即capesiefp片段與鑰孔血藍(lán)蛋白即klh偶聯(lián)，通過皮下多點免疫的方式免疫整合素gpiiia缺陷的balb/c小鼠；抗原用pbs稀釋至0.3mg/ml，取1000ul與1000ul弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑混合，乳化，皮下多點免疫；每隔2周免疫一次，共免疫4次；末次免疫后，對小鼠進(jìn)行眼眶靜脈采血，收集血清，用elisa方法檢測小鼠血清效價；選定elisa檢測為陽性的合格小鼠，取抗原各50ug直接腹腔注射合格小鼠，三天后進(jìn)行細(xì)胞融合。

b)用免疫鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞即sp2/0細(xì)胞融合，經(jīng)hat選擇性培養(yǎng)基篩選，亞克隆獲得抗血小板整合素gpiiia49-57單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為：hyd-5a10；其中，hat的h：次黃嘌呤a：氨基蝶呤t：胸腺嘧啶核苷酸。

c)雜交瘤細(xì)胞株hyd-5a10接種到預(yù)先腹腔注射石蠟油的小鼠體內(nèi)，接種hyd-5a10細(xì)胞后每天觀察小鼠生長狀態(tài)，在小鼠瀕死前對小鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死，用滴管將腹水吸出，經(jīng)proteing柱純化，得到所述抗血小板整合素糖蛋白iiia單克隆抗體5a10；其中，hyd-5a10接種量為1～2×10⁶個細(xì)胞/小鼠。

一種上述抗血小板整合素糖蛋白iiia單克隆抗體5a10在制備治療動脈血栓性疾病的藥物中的應(yīng)用。

一種上述抗血小板整合素糖蛋白iiia單克隆抗體5a10在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明有益效果：

1)本發(fā)明制備方法得到的單克隆抗體5a10，可裂解血小板栓塊，用于動脈血栓性疾病治療。此外，這類抗體可以破碎血小板/腫瘤栓塊外的活化血小板，用于腫瘤的防治。

2)本發(fā)明得到的單克隆抗體5a10，亦可抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)增殖、遷移和管型形成，具有潛在的抗腫瘤血管新生作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備方法流程圖；

圖2為本發(fā)明的單克隆抗體5a10與血小板結(jié)合圖；

圖3為本發(fā)明的單克隆抗體5a10與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合圖；

圖4為本發(fā)明的單克隆抗體5a10誘導(dǎo)血小板栓塊解聚圖；

圖5為本發(fā)明的單克隆抗體5a10抑制huvec增殖圖；

圖6為本發(fā)明的單克隆抗體5a10誘導(dǎo)huvec凋亡圖；

圖7為本發(fā)明的單克隆抗體5a10的抑制huvec遷移圖；

圖8為本發(fā)明的單克隆抗體5a10的抑制huvec血管形成圖。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實施例1

參閱圖1，本發(fā)明一種抗血小板整合素糖蛋白iiia49-57(gpiiia49-57)鼠源性單克隆抗體5a10的制備，包括以下具體步驟：

a、小鼠免疫

選取健康的6～8周的雌性balb/c老鼠10只，用klh-gpiiia49-57(capesiefp)作為抗原通過皮下多點免疫的方式對小鼠進(jìn)行免疫，具體為：

第一天，抗原用pbs稀釋至0.3mg/ml，每個抗原取1000ul與1000ul弗氏完全佐劑混合，乳化，皮下多點注射10只小鼠；

第十五天，抗原分用pbs稀釋至0.3mg/ml，每個抗原取1000ul抗原與1000ul弗氏不完全佐劑混合，乳化，皮下多點注射10只小鼠；

第二十九天，抗原用pbs稀釋至0.3mg/ml，每個抗原取1000ul與1000ul弗氏不完全佐劑混合，乳化，皮下多點注射10只小鼠；

第三十六天，對10只小鼠進(jìn)行眼眶靜脈采血，收集血清，用elisa方法檢測小鼠血清效價；

第四十三天，抗原用pbs稀釋至0.3mg/ml，每個抗原取1000ul與1000ul弗氏完全佐劑混合，乳化，皮下多點注射10只小鼠；

選定elisa檢測為陽性的合格小鼠，取抗原50ug直接腹腔注射合格小鼠，三天后進(jìn)行細(xì)胞融合。

b、細(xì)胞融合及篩選

hat選擇性培養(yǎng)基篩選法：細(xì)胞融合之后，若只考慮最多兩種細(xì)胞的融合情況，則分為5種情況：效應(yīng)b細(xì)胞及其自身融合細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞及其自身融合細(xì)胞以及雜交瘤細(xì)胞。在雜交瘤細(xì)胞的篩選中，采用的是hat(h：次黃嘌呤a：氨基蝶呤t：胸腺嘧啶核苷酸)選擇性培養(yǎng)基篩選法，是根據(jù)dna合成過程中次黃嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途經(jīng)設(shè)計的，dna合成有兩種途徑，從頭合成途徑(d途徑)和補(bǔ)救合成途徑(s途徑)。其中d途徑是由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為dna分子合成提供原料，此過程中，葉酸作為重要的輔酶參與，而hat培養(yǎng)基中的氨基蝶呤是一種葉酸的拮抗物，可以阻斷d途徑，s途徑是利用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hgprt)和胸腺嘧啶核苷激酶(tk)催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應(yīng)的核苷酸，兩種酶缺一不可。因此，效應(yīng)b細(xì)胞及其自身融合細(xì)胞的d途徑被氨基蝶呤阻斷，s途徑雖然正常，但卻不能無限繁殖，一般細(xì)胞會在生長幾天后死亡。骨髓瘤細(xì)胞及其自身融合細(xì)胞因本身為hgprt缺陷型無s途徑，d途徑又被氨基蝶呤阻斷，因此只有雜交瘤細(xì)胞既有s途徑，又可以無限繁殖。

1)骨髓瘤細(xì)胞即sp2/0細(xì)胞的收集

①選擇生長狀態(tài)良好的sp2/0細(xì)胞(應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，融合前一天應(yīng)換液)，用槍將細(xì)胞吹下，收集于50ml離心管中，1200rpm離心5min。

②棄去上清，用20mldmem培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，記數(shù)，取3×10⁷個細(xì)胞，1200rpm離心5min。

③棄去上清，用20mldmem培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，置培養(yǎng)箱中備用。

2)脾細(xì)胞的收集

①小鼠摘眼球取血(37℃放置1小時后8000rpm離心10min，所析出的上清即為血清，可作為陽性對照，分裝凍存于-20℃)，頸椎脫臼處死，放入75％乙醇中消毒5min。

②將消毒好的小鼠轉(zhuǎn)入超凈臺中，左側(cè)向上，將皮膚剪一個小口，從開口處拉開皮膚暴露腹膜，用無菌手術(shù)剪剪開腹膜，取出脾臟放入篩網(wǎng)中。

③在篩網(wǎng)中研磨脾臟，用15mldmem培養(yǎng)基沖洗篩網(wǎng)收集脾細(xì)胞，1200rpm離心5min。

④棄去上清，用10mldmem培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸。

3)細(xì)胞融合

①將脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞混勻，1200rpm離心5min。

②棄去上清(注意要將上清倒的盡量干凈，可輕輕將管口倒置，用酒精棉球?qū)⒐芸跉埩舻囊稽c液體吸干)，將細(xì)胞彈松，吸取1ml預(yù)熱的融合劑(peg1450)，在1分鐘內(nèi)逐滴加入，再放置37℃水浴中反應(yīng)1分鐘，然后加入終止液(在5分鐘內(nèi)加入25mldmem培養(yǎng)基，并輕輕攪拌細(xì)胞)，1200rpm離心5min。

③棄去上清，加入100ml預(yù)熱的hat培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸，輕輕混勻(用吸管從底部吸起細(xì)胞，在液面頂部輕輕盤旋滴入)。用排槍加入預(yù)先接種飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，每孔100ul，鋪10塊板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5％co2)。

4)雜交瘤細(xì)胞的篩選及檢測

①細(xì)胞融合后，需每天仔細(xì)觀察克隆的生長狀況以及有無污染，以確保細(xì)胞處于正常生長狀態(tài)。

②待觀察到克隆團(tuán)細(xì)胞數(shù)目達(dá)到數(shù)百個以上(7天左右)后，準(zhǔn)備換液。用排槍將融合板中的培養(yǎng)基上清棄去，然后每孔補(bǔ)加200ul新鮮的ht培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5％co2)。

③換液2天后，將96孔板中的上清每孔吸出100ul轉(zhuǎn)入包被好抗原的酶標(biāo)板中，并標(biāo)注相應(yīng)的編號，elisa檢測上清中是否有特異性抗體。

④elisa結(jié)果為陽性的孔，對應(yīng)板上的編號觀察孔內(nèi)有無細(xì)胞，若有細(xì)胞則將孔內(nèi)培養(yǎng)液吸出并補(bǔ)加200ul新鮮ht培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5％co2)。

⑤換液2天后，96孔板中的上清每孔再次吸出100ul轉(zhuǎn)入包被好抗原的酶標(biāo)板中，并標(biāo)注相應(yīng)的編號，elisa復(fù)檢。

c、亞克隆及建株

有限稀釋法：

在免疫動物過程中，應(yīng)選用較高純度的抗原，因為一種抗原理論上有很多個抗原決定簇，一個動物在正常情況下受到外源性抗原刺激后所產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，實質(zhì)上所產(chǎn)生的并不是一種抗體，而是眾多b淋巴細(xì)胞群的抗體分泌，針對目標(biāo)抗原表位的b細(xì)胞只占極少的部分，因此在篩選中應(yīng)將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)目在0-數(shù)個細(xì)胞之間(30％的孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量為0則能保證每個孔中都是單個細(xì)胞)。

①elisa復(fù)檢結(jié)果為陽性的孔，準(zhǔn)備進(jìn)行亞克隆。

②用移液槍將96孔板中的細(xì)胞吹打制成懸液，取少量懸液用苔盼藍(lán)染液染色計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果取120個細(xì)胞加入10mlht培養(yǎng)基中，分別接種于預(yù)先接種飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，每孔100ul，孔板上作好標(biāo)記，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5％co2)。

③每天觀察克隆的生長狀況、有無污染，保證細(xì)胞以正常狀態(tài)生長，96孔板中的克隆生長到全孔的1/6時，標(biāo)記單克隆及多克隆，每塊板選擇24個生長良好的克隆，編號。

④1天后，將96孔板中的上清每孔吸出100ul轉(zhuǎn)入包被好抗原的酶標(biāo)板中，并標(biāo)注相應(yīng)的編號，elisa檢測上清。

⑤elisa結(jié)果為陽性的孔，選擇吸光值比較高且生長狀態(tài)良好的單克隆細(xì)胞，繼續(xù)亞克隆，重復(fù)3-4次，直到所有的孔中細(xì)胞上清elisa結(jié)果均為陽性，可以建株。

⑥建株后將細(xì)胞從96孔板轉(zhuǎn)到24孔板中，細(xì)胞長滿后轉(zhuǎn)入t-25方瓶中，細(xì)胞長滿后轉(zhuǎn)入t-75方瓶中，待細(xì)胞狀態(tài)良好時準(zhǔn)備凍存。

⑦用彎頭吸管將細(xì)胞吹打制成懸液，吸取少量計數(shù)，計算細(xì)胞總數(shù)，1200rpm離心6min。⑧棄去上清，用凍存液將細(xì)胞重懸，分裝入凍存管中(2×10⁶cell/ml/管)，作好標(biāo)記，封口膜封口。

⑨將細(xì)胞放入程序降溫盒中，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱。

⑩2天后，復(fù)蘇1支細(xì)胞，第二天鏡檢細(xì)胞活率>80％證明凍存合格，一周內(nèi)轉(zhuǎn)入液氮罐中；若細(xì)胞活率<80％，需重新凍存。

d、單抗生產(chǎn)

1)雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇

①從液氮中取出1支細(xì)胞，迅速投入37℃水浴鍋中，并不斷搖晃。

②待細(xì)胞完全融化后用75％酒精擦拭凍存管放入超凈臺中，將細(xì)胞吸出轉(zhuǎn)入10mldmem培養(yǎng)基中，1200rpm離心5min。

③棄去上清，重懸沉淀，用5ml完全培養(yǎng)基混勻，轉(zhuǎn)入1個t-25方瓶中，置培養(yǎng)箱中(37℃，5％co2)培養(yǎng)。

2)雜交瘤細(xì)胞的接種

①預(yù)先腹腔注射石蠟油到小鼠體內(nèi)(0.5ml/只，注射石蠟油至少7天后方可用于制備腹水)。

②待細(xì)胞基本布滿瓶底，細(xì)胞狀態(tài)良好時收集細(xì)胞。將雜交瘤細(xì)胞用彎頭吸管重懸并計數(shù)，1200rpm離心5min。

③棄去上清，用少量dmem培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，腹腔注射入石蠟鼠體內(nèi)(每只小鼠注射1-2×10⁶個細(xì)胞)。

3)腹水的收集和保存

①接種雜交瘤細(xì)胞后每天觀察小鼠生長狀態(tài)。

②在小鼠瀕死前對小鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死，用手術(shù)剪剪開腹部皮膚，撕開皮膚暴露腹膜，再在腹膜上剪一個小口，用滴管將腹水吸出。

③吸出的腹水3000rpm離心30min，吸取上清，分裝凍存于-80℃，并取少量elisa檢測腹水效價。

4)抗體純化

①取1ml腹水12000rpm離心4min，取上清加入4mlpbs進(jìn)行稀釋。

②取出proteing柱(柱體積1ml)，用10mlpbs平衡，待pbs流干后，腹水上樣過柱，收集流穿。

③用10mlpbs平衡，待pbs流干后，加入1ml的0.1m的ph2.5甘氨酸溶液，流干后再加入2.5ml的0.1m的ph2.5甘氨酸溶液，收集洗脫液，加入250ul1mtris溶液(ph8.8)中和。

④加入10mlpbs平衡，流干后加入2ml的20％乙醇，4℃保存柱內(nèi)。

將抗體洗脫液用pbs透析過夜，elisa檢測效價。

實施例2

本發(fā)明一種能夠快速裂解血小板栓塊并抑制血管內(nèi)皮新生的單克隆抗體5a10與血小板結(jié)合。1000rpm離心人血樣15min，提取富含血小板的血漿。棄去沉淀，收集上清于抗凝管中，再將上清每孔10ul鋪于96孔板內(nèi)。向96孔板中分別加入四種單克隆抗體(抗體終濃度：50ug/ml)，每種抗體設(shè)置3個平行組，室溫孵育2h。向96孔板中加入fitc標(biāo)記的熒光二抗，室溫孵育1h。樣品過濾后流式細(xì)胞儀檢測熒光偏移情況。參閱圖2，表明單克隆抗體5a10能與血小板特異結(jié)合。

實施例3

本發(fā)明一種能夠快速裂解血小板栓塊并抑制血管內(nèi)皮新生的單克隆抗體5a10與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。huvecs生長至70％～80％，吸棄培養(yǎng)液，pbs(gibco,20012-027)洗1遍，0.25％胰酶-edta(gibco,25200-056)室溫消化約1min，輕輕吸棄胰酶，加入新鮮的完全培養(yǎng)基終止消化，將貼壁細(xì)胞輕柔吹打下來，轉(zhuǎn)至離心管，1000rpm，5min離心，棄上清，冰pbs洗1遍，冰tyrode’sbuffer(含hepes；beyotime,st090)重懸細(xì)胞并計數(shù)。本實驗分組為buffer、igg對照組和抗體1c1、1e7、5a10實驗組，各組抗體設(shè)置3個濃度梯度為1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml。每份取5×10⁵細(xì)胞，按相應(yīng)濃度加入buffer與各抗體，冰上孵育30min，用含0.35％bsa(牛血清白蛋白,bovineserumalbumin；beyotime,st023)的冰tyrode’sbuffer洗2～3遍，4℃，1000rpm，5min離心。按1∶500稀釋比例加入fitc(異硫氰酸熒光素,fluoresceinisothiocyanate)標(biāo)記山羊抗小鼠igg(beyotime,a0568)，冰上避光孵育30min，冰tyrode’sbuffer洗1～2遍。每份加500μl冰tyrode’sbuffer制備1×10⁶/ml細(xì)胞終液。300目尼龍膜(multisciences,n3002)過濾，按150～200μl/孔加入96孔板，每份設(shè)2～3復(fù)孔。96孔板放入流式細(xì)胞儀(guava,easycyte6ht-2l)分析，每孔收樣1×10⁴細(xì)胞。流式細(xì)胞儀軟件mguavasoft2.7內(nèi)置功能處理結(jié)果。參閱圖3，表明單克隆抗體5a10能與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)特異結(jié)合。

實施例4

本發(fā)明一種能夠快速裂解血小板栓塊并抑制血管內(nèi)皮新生的單克隆抗體5a10誘導(dǎo)血小板栓塊解聚。將人血小板按1×10³每孔加入96孔培養(yǎng)板中，隨后加入100mg/ml纖維蛋白原及10μmadp于37℃共孵育30min，誘導(dǎo)血小板栓塊形成。1000rpm離心15min后棄去上清。加入5a10100mg/ml及無關(guān)對照試劑，于不同時間點，在顯微鏡下計數(shù)每1000個血小板中的血小板栓塊數(shù)目(即血小板栓塊解聚常數(shù))。參閱圖4，表明單克隆抗體5a10誘導(dǎo)血小板栓塊解聚隨時間增加而增多。

實施例5

本發(fā)明一種能夠快速裂解血小板栓塊并抑制血管內(nèi)皮新生的單克隆抗體5a10抑制huvec增殖。時效測定:96孔板提前鋪200μl/孔0.5％明膠，于37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜放置。取對數(shù)期細(xì)胞，消化，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，制備細(xì)胞懸液。本實驗設(shè)調(diào)零孔(只加完全培養(yǎng)基不加細(xì)胞)，并分為buffer、igg對照組和抗體1c1、1e7、5a10實驗組，每組設(shè)5復(fù)孔。取180μl/孔上述細(xì)胞懸液加入96孔板(5000/孔)，四周孔內(nèi)加入pbs以封板。待過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞貼壁。按100μg/ml終濃度加入抗體igg、1c1、1e7、5a10，buffer組加入pbs。加抗體后分別于1天、2天、3天，加入20μl/孔5mg/mlmtt(噻唑藍(lán),methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide；beyotime,st316)，37℃5％co2培養(yǎng)箱中靜置避光孵育4h，吸棄上清，加入150μl/孔dmso(sigma,d2650)，37℃放置10min并振蕩至甲瓚結(jié)晶全溶，吹風(fēng)機(jī)吹破孔內(nèi)氣泡，酶標(biāo)儀(moleculardevices,spectramaxm5)于550nm測定od550值。結(jié)果分析之抑制率ir計算按照如下公式：

參閱圖5，表明抗gpiiia49-57單克隆抗體5a10與對照抗體相比，能顯著抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)增殖。

實施例6

本發(fā)明一種能夠快速裂解血小板栓塊并抑制血管內(nèi)皮新生的單克隆抗體5a10誘導(dǎo)huvec凋亡。細(xì)胞復(fù)蘇并經(jīng)1次傳代，2～3天后生長至70％～80％，消化計數(shù)并取等量細(xì)胞種至3個培養(yǎng)皿，待細(xì)胞過夜貼壁后，換棄原培養(yǎng)液，向3皿生長狀態(tài)相同的細(xì)胞中分別加入buffer、igg(100μg/ml)和抗體5a10(100μg/ml)預(yù)處理細(xì)胞?？贵w處理48h后，取對數(shù)期細(xì)胞，將上清及其中懸浮細(xì)胞收集至離心管，用不含edta的0.25％胰酶(gibco,15050-065)消化細(xì)胞，后者與相應(yīng)上清培養(yǎng)基合并，4℃，1200rpm，3min離心，吸棄上清液。預(yù)冷pbs洗滌細(xì)胞1～2遍并計數(shù)，4℃，1200rpm，3min離心，充分吸棄上清，細(xì)胞置冰上。本實驗用fitc-annexinv凋亡檢測試劑盒(dojindo,ad10)檢測細(xì)胞凋亡，并根據(jù)實驗需要而進(jìn)一步優(yōu)化與細(xì)化：提前將10×annexinvbindingbuffer用milli-qwater(merk,merk-milli-qadvantage)稀釋10倍。加入預(yù)冷1×annexinvbindingbuffer制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×10⁶/ml(500μl以上)。每個樣品取100μl上述單細(xì)胞懸液至新的1.5mlep管；另外，各個樣品取相等體積上述單細(xì)胞懸液混合為100μl/份(3份)，用于制備調(diào)校樣品。每個樣品分別加入5μlfitc-annexinv結(jié)合物，輕輕混勻，冰上避光孵育15min；再加入400μl預(yù)冷1×annexinvbindingbuffer，輕輕混合；立即加入5μlpi溶液，輕輕混勻，避光置冰上。另外，調(diào)校樣品1份為未染色細(xì)胞，1份為fitc-annexinv單染細(xì)胞，1份為pi單染細(xì)胞，其他操作與試驗樣品染色步驟相同。300目尼龍膜過濾，以150～200μl/孔加入96孔板，每個樣品設(shè)2～3復(fù)孔，每個調(diào)校樣品則各設(shè)1孔即可。5min內(nèi)放置于流式細(xì)胞儀分析，每孔收樣1×10⁴細(xì)胞，至多1h內(nèi)完成檢測。流式細(xì)胞儀需提前15～20min清洗1遍方能投諸檢測。流式細(xì)胞儀軟件mguavasoft2.7內(nèi)置功能處理結(jié)果。參閱圖6，單克隆抗體5a10能誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)凋亡。

實施例7

本發(fā)明一種能夠快速裂解血小板栓塊并抑制血管內(nèi)皮新生的單克隆抗體5a10的抑制huvec遷移。細(xì)胞復(fù)蘇并經(jīng)1次傳代，2～3天后生長至70％～80％，消化計數(shù)并取等量細(xì)胞種至5個6cm培養(yǎng)皿(16萬/皿)，待細(xì)胞過夜貼壁后，換棄原培養(yǎng)液，向5皿生長狀態(tài)相同的細(xì)胞中分別加入buffer、igg(100μg/ml)和抗體5a10(1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml)預(yù)處理細(xì)胞?？贵w處理48h后，棄去含抗體完全培養(yǎng)液，pbs洗1～2遍，換上基礎(chǔ)培養(yǎng)基(ecm+p/s，無fbs無ecgs)，饑餓4～6h。取對數(shù)期細(xì)胞，0.25％胰酶-edta消化細(xì)胞，吸棄胰酶(幾乎不丟棄細(xì)胞)，加新鮮完全培養(yǎng)基終止消化(確保血清足以終止消化)，1000rpm，5min，吸棄上清，pbs洗1遍，基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，取一定量細(xì)胞加基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×10⁵/ml。transwell小室(8μm；costar,3422)預(yù)水化平衡，下室加液600μl，放入小室(確保無氣泡)，上室加液100μl，上下室皆加基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37℃5％co2過夜(至少1h)放置，吸棄培養(yǎng)基，待用。下室加入600μl完全培養(yǎng)基(ecm+5％fbs+1％ecgs+p/s)，放入小室(確保無氣泡)，上室加入上述細(xì)胞懸液100μl(2.5×10⁴/小室)，每組設(shè)3個平行小室。37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h。甲醇室溫固定30min，無菌pbs清洗2～3遍。0.1％結(jié)晶紫(bogoo,pt007)室溫染色30min，無菌pbs清洗2～3遍。用濕棉棒小心擦除小室膜上側(cè)未遷移細(xì)胞，用力持續(xù)均勻，避免破膜，尤其是小室膜上側(cè)邊緣細(xì)胞，會顯著影響結(jié)果，需擦除。小室過夜晾干。倒置熒光顯微鏡(olympus,dp80,ix73)選擇明場與100×倍數(shù)，取9～10個隨機(jī)視野拍照。用10％乙酸(冰醋酸:蒸餾水＝1∶9)于搖床脫色10min，洗脫液轉(zhuǎn)移至96孔板，酶標(biāo)儀于595nm讀取od595值。參閱圖7，單克隆抗體5a10以劑量依賴方式抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)遷移。

實施例8

本發(fā)明一種能夠快速裂解血小板栓塊并抑制血管內(nèi)皮新生的單克隆抗體5a10的抑制huvec血管形成。提前將bme-rgf(trevigen,3433-005-01)4℃冰水浴，過夜；實驗時bme-rgf溶液需一直置于冰上，高于8℃則凝固聚合。將200μl槍頭、96孔板4℃預(yù)冷。本實驗用體外血管形成實驗試劑盒(trevigen,3470-096-k)測定huvecs血管形成，并根據(jù)實驗需要而進(jìn)一步優(yōu)化與細(xì)化：12000rpm1min離心50μgcalcein-am粉末(trevigen,4892-010-01)，開蓋，加入25μl無菌dmso(25μl原液；2μg/μl，2mm)，用槍頭上下混合，保存于-20℃；每次實驗前均需重新稀釋，按1∶1000將4μl原液加入4mlpbs(4ml終液；2μm)。按1∶50將2μl10mmnegativect(sulforaphane；trevigen,3470-096-02)加入98μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基(100μl終液；200μm)；每次實驗前均需重新制備。超凈臺內(nèi)，bme溶液置冰上，平衡器平衡超凈臺上預(yù)冷的96孔板，預(yù)冷槍頭將60μl/孔bme懸空于孔中央加入96孔板，確保鋪滿鋪勻并無氣泡，膠四周孔內(nèi)用pbs封板。37℃放置30-60min。取對數(shù)期細(xì)胞，消化收集，pbs洗1遍，加入完全培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液，準(zhǔn)確計數(shù)。取一定體積混勻的細(xì)胞液，加完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞終密度為10萬/ml。按1∶200向細(xì)胞終液中加入1μg/mlvegf(recombinantmurinevegf165；peprotech,450-32)至終濃度約為5ng/ml。將10萬/ml細(xì)胞終液混勻，等體積分裝，加入相應(yīng)buffer、negativect(20μm)、igg(100μg/ml)、5a10(1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml)。細(xì)胞懸液混勻，以100μl/孔沿孔壁同一方向固定位置慢慢加入96孔板(1萬/孔)，每組設(shè)4復(fù)孔。37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，150μl/孔pbs洗1遍，加100μl/孔2μmcalcein-am，于37℃，5％co2孵育30min，小心吸出calcein-am，加100μl/孔pbs。倒置熒光顯微鏡，選擇blue2通道(藍(lán)光激發(fā)綠光)及40×視野，拍照。利用imagej軟件統(tǒng)計小管總長度與細(xì)胞覆蓋面積比例等量化指標(biāo)，分析結(jié)果。參閱圖8，單克隆抗體5a10呈劑量依賴性抑制內(nèi)皮細(xì)胞形成血管。

本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以上實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。