本申請是2013年7月2日提交的申請?zhí)枮?01380035510.6、發(fā)明名稱為“特異性結(jié)合到dll4的新型單克隆抗體及其應(yīng)用”的中國發(fā)明專利申請的分案申請。

本發(fā)明涉及特異性結(jié)合到delta樣配體4(dll4)的新型單克隆抗體，尤其涉及特異性結(jié)合到人delta樣配體4以有效抑制delta樣配體4和notch受體之間的結(jié)合的單克隆抗體、編碼該單克隆抗體的多核苷酸、包含該多核苷酸的表達(dá)載體、包含該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化株、制備該單克隆抗體的方法、用于預(yù)防或治療癌癥的包含該單克隆抗體的藥物組合物、包含該單克隆抗體的用于診斷癌癥的組合物、使用該單克隆抗體診斷癌癥的方法以及用于預(yù)防或治療自身免疫性疾病的包含該單克隆抗體的藥物組合物。

背景技術(shù)：

據(jù)報道，notch信號傳導(dǎo)是脊椎動物和無脊椎動物進(jìn)化上高度保守的，在發(fā)育初始階段決定細(xì)胞命運上起著非常關(guān)鍵的作用。已知notch信號傳導(dǎo)是調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞、眼內(nèi)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肌細(xì)胞、血細(xì)胞等的分化的主要因素，也參與血管的發(fā)育。哺乳動物有四個notch受體(notch1、2、3和4)，且各notch受體以300-350kda大小的蛋白質(zhì)形式合成，并在高爾基體中被弗林樣轉(zhuǎn)化酶在s1位點裂解從而在細(xì)胞表面形成異質(zhì)二聚體。此外，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)四個notch配體(jagged-1/2和delta樣配體(dll)1/3/4)。

notch受體和配體均是膜蛋白且在兩毗連細(xì)胞間的界面結(jié)合從而誘導(dǎo)notch信號傳導(dǎo)。當(dāng)細(xì)胞互相接觸時，胞外域直接互相接觸以誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)，且出現(xiàn)根據(jù)配體和受體組合而不同的細(xì)胞反應(yīng)。當(dāng)配體和notch受體在notch信號傳導(dǎo)中相互結(jié)合，notch受體結(jié)構(gòu)改變，然后經(jīng)歷兩個連續(xù)的蛋白水解裂解。第一蛋白水解裂解開始于金屬蛋白酶adam10/17(去整合素和金屬蛋白酶10/17)/tace(tnf-α轉(zhuǎn)化酶)裂解胞外域(s2位點)。當(dāng)s2位點裂解，notch受體的跨膜區(qū)的s3位點接著被裂解。第二蛋白水解裂解由具有五個亞單位的γ-分泌酶復(fù)合物介導(dǎo)。γ-分泌酶復(fù)合物由早老素1、早老素2、nicastrin、pen-2和aph1組成。兩蛋白水解裂解后，notch胞內(nèi)域(nicd)釋放并遷移入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，nicd結(jié)合到轉(zhuǎn)錄抑制因子csl(cbf-1/無毛抑制因子/lag-1)以替代已結(jié)合到csl的輔抑制物(cor)。nicd/csl復(fù)合物募集共活化劑(coa)maml(mastermind樣)或p300從而激活和誘導(dǎo)notch靶基因的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白d1、p21、nf-κb、c-myc、pre-ta(前t細(xì)胞受體α鏈)、gata3、nrarp和deltex1。

已知激活的notch信號傳導(dǎo)在各種腫瘤模型中誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。當(dāng)激活的notchnicd在大鼠造血細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，t細(xì)胞白血病/淋巴瘤發(fā)生，在約50％的t-all(t細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病)中發(fā)現(xiàn)約50％激活的notch1(wengap等,science2004；306:71-269)。此外，對于乳腺癌，發(fā)現(xiàn)notch4受體在引入mmtv(小鼠乳腺瘤病毒)的大鼠(czechii)內(nèi)過表達(dá)，并報道在這些大鼠中發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤(gallahand等,journalofvirology1987；61:66-74)。據(jù)報道notch受體和配體及notch信號傳導(dǎo)靶在各種癌癥中被激活，如宮頸癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌(mielel等,clincancerresearch2006；12(4):1074-79)，且已知notch1受體與乳腺癌患者糟糕的預(yù)后相關(guān)(reedijkm等,cancerreserach2005；65:8530-7)，且與前列腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)(santagatas等,cancerresearch2004；64:6854-7)。

delta樣4(dl4)或delta樣配體4(dll4)(下文稱為"dll4")是結(jié)合到血管內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)的notch蛋白的delta類配體之一。已知為調(diào)節(jié)血管生成的主要因素。dll4特別結(jié)合到血管內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)的notch1或notch4受體。已知dll4在腫瘤血管中高度過表達(dá)，盡管它也在正常血管內(nèi)表達(dá)(reinacher-schicka等,natclinpractgastroenterolhepatol2008；5(5):250-67)。血管生成是指從已存在的血管形成新血管的機制。特別地，在腫瘤中，通過血管生成因子如vegf引發(fā)血管生成從而提供氧氣和營養(yǎng)物到腫瘤組織的缺氧區(qū)。已知腫瘤內(nèi)的血管生成不僅在腫瘤生長而且在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用。當(dāng)腫瘤內(nèi)dll4所致的notch信號傳導(dǎo)被阻斷，不容易控制血管生成，因此可以抑制腫瘤生長。此外，當(dāng)dll4所致的notch信號傳導(dǎo)被抑制，可以通過增加調(diào)節(jié)t細(xì)胞(treg)的數(shù)量治療自身免疫性疾病(us專利公布號：2011-0189200)?；谶@些原因，dll4成為治療癌癥和自身免疫疾病的新靶標(biāo)。

為通過靶向dll4治療癌癥或自身免疫疾病，已經(jīng)開展了對對各種不同部分中抑制notch信號傳導(dǎo)的研究。其中的實例包括干擾notch/配體結(jié)合的受體誘餌，參與notch信號傳導(dǎo)中notch蛋白裂解的γ-分泌酶抑制劑，以及用于抑制參與notch信號傳導(dǎo)的蛋白或notch靶基因的mirna或sirna。在這些各種不同的抑制notch信號傳導(dǎo)的方法中，對結(jié)合notch配體的、能在notch信號傳導(dǎo)初期起作用的單克隆抗體的研究已經(jīng)越來越重要。特別地，為臨床研究，已經(jīng)需要開發(fā)可以特異性結(jié)合到人dll4并在最大程度降低免疫原性的風(fēng)險的同時有效抑制dll4/notch受體相互作用的人單克隆抗體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

因此，本發(fā)明人已付出大量勞動以開發(fā)能夠特異性結(jié)合到人dll4且同時能夠有效抑制dll4/notch受體相互作用并可以最大程度降低免疫原性風(fēng)險的人單克隆抗體。結(jié)果本發(fā)明人已經(jīng)構(gòu)建出特異性結(jié)合到人dll4的人單克隆抗體，其中重鏈和輕鏈區(qū)全部是來自人抗生素庫的人源的，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該人單克隆抗體可以有效抑制dll4和notch蛋白間的相互作用，因此可以有效用于治療如癌癥等疾病，從而完成本發(fā)明。

技術(shù)問題的解決方案

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的單克隆抗體，該單克隆抗體特異性結(jié)合到人delta樣配體4(dll4)且同時抑制人delta樣配體4和notch受體間的相互作用。

本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述單克隆抗體的多核苷酸，包括該多核苷酸的表達(dá)載體以及包括該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化株。

本發(fā)明的再一目的在于提供制備上述單克隆抗體的方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供包含上述單克隆抗體的用于治療癌癥的藥物組合物。

本發(fā)明的再一目的在于提供使用上述單克隆抗體治療癌癥的方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供用于診斷癌癥的方法，該方法包括采用上述單克隆抗體，通過抗原-抗體反應(yīng)檢測從疑似具有癌癥的患者分離的生物樣本中delta樣配體4(dll4)蛋白的步驟。

本發(fā)明的再一目的在于提供包含上述單克隆抗體的用于診斷癌癥的組合物。

本發(fā)明的再一目的在于提供包括上述用于診斷癌癥的組合物的診斷癌癥的試劑盒。

本發(fā)明的再一目的在于提供包含上述單克隆抗體的用于治療自身免疫疾病的藥物組合物。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種使用上述單克隆抗體的用于治療自身免疫疾病的方法。

有益效果

本發(fā)明的人單克隆抗體對人dll4顯示出強親和力，并有效抑制dll4結(jié)合到notch受體，且顯示出低免疫原性，因其重鏈和輕鏈區(qū)全部是人源的。因此，本發(fā)明的人單克隆抗體可以有效用于診斷和治療疾病，如癌癥或自身免疫疾病。

附圖說明

圖1示出dll4的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。在圖1中，框是指框架區(qū)，cdr是指互補決定區(qū)。

圖2示出為檢測單克隆抗體與dll4結(jié)合能力而實施的酶聯(lián)免疫吸附測試(elisa)結(jié)果。

圖3示出為檢測hek293細(xì)胞中單克隆抗體與dll4結(jié)合能力而實施的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，其中dll4在hek293細(xì)胞中人為過表達(dá)((a)mlck-1；(b)mlck-2；(c)mlck-3；(d)mlck-4)。

圖4示出為檢測單克隆抗體中和dll4的能力而實施的elisa結(jié)果。

圖5示出通過使用biacore裝置檢測抗原dll4和本發(fā)明的抗dll4抗體mlck-1、mlck-2、mlck-3和mlck-4的親合力的結(jié)果。

圖6表明抗dll4抗體mlck-2阻斷dll4介導(dǎo)的huvec增殖抑制。

圖7示出免疫印跡結(jié)果，表明抗dll4抗體mlck-2通過破壞dll4和notch之間的相互作用抑制notch信號傳導(dǎo)。

本發(fā)明的最佳實施方式

在一方面，本發(fā)明提供一種新型的單克隆抗體，尤其一種人單克隆抗體，它特異性結(jié)合到人delta樣配體4(dll4)，同時抑制人delta樣配體4和notch受體間的相互作用

如本文所用，術(shù)語"抗體"是指起到特異性識別抗原的受體作用的蛋白分子，包括與特定抗原免疫反應(yīng)的免疫球蛋白分子。該術(shù)語還包括多克隆抗體、單克隆抗體、全抗體和抗體片段。此外，該術(shù)語還包括嵌合抗體(例如，人源化鼠抗體)、二價或雙特異分子(例如，雙特異抗體)、雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體。全抗體具有兩全長輕鏈和兩全長重鏈，各輕鏈通過二硫鍵連接到重鏈。全抗體包括iga、igd、ige、igm和igg，igg具有包括igg1、igg2、igg3和igg4在內(nèi)的亞型?？贵w片段是指具有結(jié)合抗原作用的片段，包括fab、fab'、f(ab')2和fv。fab具有輕鏈和重鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和第一重鏈恒定區(qū)(ch1域)，并包括一抗原結(jié)合位點。fab'與fab的不同在于它具有鉸鏈區(qū)，在重鏈ch1域的c末端區(qū)至少包括半胱氨酸殘基。通過fab'鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基間的二硫鍵制備f(ab')2抗體。fv(可變片段)是指僅具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的最小抗體片段。雙鏈fv(dsfv)具有通過二硫鍵連接到輕鏈可變區(qū)的重鏈可變區(qū)，單鏈fv(scfv)通常具有通過肽接頭連接到輕鏈可變區(qū)的重鏈可變區(qū)?？梢允褂玫鞍酌斧@得此類抗體片段(例如，可以通過用木瓜蛋白酶裂解全抗體獲得fab片段，可以通過胃蛋白酶裂解全抗體獲得f(ab')2片段)。優(yōu)選地，可以通過基因重組技術(shù)構(gòu)建抗體片段。

如本文所用，術(shù)語"單克隆抗體"是指具有單一分子組成的抗體分子，獲自一群基本相同的抗體。該單克隆抗體顯示出對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。

典型地，免疫球蛋白具有重鏈和輕鏈。各重鏈和輕鏈包含恒定區(qū)和可變區(qū)(區(qū)域也稱為"域")。輕鏈和重鏈可變區(qū)包含四個框架區(qū)，被三個超變區(qū)打斷，也稱為"互補決定區(qū)"(下文稱為"cdr")。cdr主要負(fù)責(zé)結(jié)合到抗原的表位。各鏈的cdr通常為cdr1、cdr2和cdr3，從n末端開始連續(xù)編號，通常也用特定cdr所處的鏈標(biāo)識。

如本文所用，術(shù)語"人抗體"是指源自人免疫球蛋白的分子，其中，包括互補決定區(qū)和框架區(qū)的抗體的全長氨基酸序列由人免疫球蛋白的氨基酸序列構(gòu)成。人抗體通常用于治療人類疾病且可以具有三個或多個有益效果。首先，人抗體可以更容易與人免疫系統(tǒng)作用以致可以通過，例如補體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng)(cdc)或抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)(adcc)更有效地破壞靶細(xì)胞。第二，效果在于人免疫系統(tǒng)不會將該抗體識別為外來抗體。第三，效果在于，即使以較小量以較低頻率施用抗體，它在人循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期與天然產(chǎn)生的抗體的半衰期相似。因此，本發(fā)明的人單克隆抗體顯示對dll4的強親和力，有效抑制notch1或notch4受體結(jié)合到表達(dá)dll4的細(xì)胞(如癌細(xì)胞)，還顯示低免疫原性，因為它的重鏈和輕鏈區(qū)域全部是人源的。因此，本發(fā)明的單克隆抗體可以有效用于治療如癌癥或自身免疫疾病等疾病。

如本文所用，短語"特異性結(jié)合人delta樣配體4(dll4)的單克隆抗體"是指可以結(jié)合到dll4從而抑制dll4生物活性的抗體，在本發(fā)明中它可以與“抗-dll4抗體”交換使用。特異性結(jié)合到dll4的單克隆抗體沒有限制，只要它特異性結(jié)合到dll4從而抑制dll4和notch受體間的相互作用。單克隆抗體的實例包括如上所述的全抗體和抗體片段。本發(fā)明的單克隆抗體可以特異性結(jié)合到人dll4同時抑制dll4和notch蛋白間的相互作用，因此可以有效用于治療涉及notch信號傳導(dǎo)的疾病，如癌癥或自身免疫疾病。

特異性結(jié)合到dll4的單克隆抗體可以優(yōu)選為這樣一種單克隆抗體，它包含seqidno:2所示的重鏈cdr1，并特異性結(jié)合到dll4，但不限于此。

包含seqidno:2所示重鏈cdr1的單克隆抗體可以優(yōu)選為包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體，重鏈可變區(qū)包括seqidno:2所示的重鏈cdr1、seqidno:3所示的重鏈cdr2和seqidno:4所示的重鏈cdr3；輕鏈可變區(qū)包括seqidno:16所示的輕鏈cdr1、seqidno:17所示的輕鏈cdr2和seqidno:18所示的輕鏈cdr3。更優(yōu)選地，包含seqidno:2所示重鏈cdr1的單克隆抗體可以為包括seqidno:1所示重鏈可變區(qū)氨基酸序列和seqidno:15所示輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的單克隆抗體，但不限于此。在本發(fā)明的實施例中，包括具有seqidno:1所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和seqidno:15所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體命名為"mlck-1"。

此外，包含seqidno:2所示重鏈cdr1的單克隆抗體可以優(yōu)選為包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體，重鏈可變區(qū)包括seqidno:2所示的重鏈cdr1、seqidno:6所示的重鏈cdr2和seqidno:7所示的重鏈cdr3；輕鏈可變區(qū)包括seqidno:20所示的輕鏈cdr1、seqidno:21所示的輕鏈cdr2和seqidno:22所示的輕鏈cdr3。更優(yōu)選地，包含seqidno:2所示重鏈cdr1的單克隆抗體可以為包括seqidno:5所示重鏈可變區(qū)氨基酸序列和seqidno:19所示輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的單克隆抗體，但不限于此。在本發(fā)明的實施例中，包括具有seqidno:5所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和seqidno:19所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體命名為“mlck-2”。

此外，包括seqidno:2所示重鏈cdr1的單克隆抗體可以優(yōu)選是包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體，重鏈可變區(qū)包括seqidno:2所示的重鏈cdr1、seqidno:9所示的重鏈cdr2和seqidno:10所示的重鏈cdr3；輕鏈可變區(qū)包括seqidno:24所示的輕鏈cdr1、seqidno:25所示的輕鏈cdr2和seqidno:26所示的輕鏈cdr3。更優(yōu)選地，包含seqidno:2所示重鏈cdr1的單克隆抗體可以為包括seqidno:8所示重鏈可變區(qū)氨基酸序列和seqidno:23所示輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的單克隆抗體，但不限于此。在本發(fā)明的實施例中，包括具有seqidno:8所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和seqidno:23所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體命名為"mlck-3"。

此外，特異性結(jié)合到dll4的單克隆抗體可以優(yōu)選為包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體，重鏈可變區(qū)包括seqidno:12所示的重鏈cdr1、seqidno:13所示的重鏈cdr2和seqidno:14所示的重鏈cdr3；輕鏈可變區(qū)包括seqidno:28所示的輕鏈cdr1、seqidno:29所示的輕鏈cdr2和seqidno:30所示的輕鏈cdr3。更優(yōu)選地，它可以為包括seqidno:11所示重鏈可變區(qū)氨基酸序列和seqidno:27所示輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的單克隆抗體，但不限于此。在本發(fā)明的實施例中，包括具有seqidno:11所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和seqidno:27所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體命名為"mlck-4"。

mlck-1、mlck-2、mlck-3和mlck-4重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列如圖1所示。

當(dāng)本發(fā)明的人單克隆抗體包括恒定區(qū)時，它可以包括源自igg、iga、igd、ige、igm的恒定區(qū)或它們的組合或雜交體。

如本文所用，術(shù)語"組合"是指編碼同一來源的單鏈免疫球蛋白恒定區(qū)的多肽連接到不同來源的單鏈多肽從而形成二聚體或多聚體。例如，二聚體或多聚體可由兩個或多個選自下組的恒定區(qū)形成：igg、iga、igd、ige和igm恒定區(qū)。

如本文所用，術(shù)語"雜交體"是指編碼不同來源的兩個或多個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的序列出現(xiàn)在單鏈免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。例如，結(jié)構(gòu)域雜交體可以由選自下組的1-4個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：igg、iga、igd、ige和igm的ch1、ch2、ch3和ch4。

同時，作為igg亞型的igg1、igg2、igg3和igg4重鏈可變區(qū)的組合或雜交體也是可能的。這些組合或雜交體如前所示。igg1重鏈恒定區(qū)可以是seqidno:31所示igg1重鏈恒定區(qū)；igg2重鏈恒定區(qū)可以是seqidno:32所示igg2重鏈恒定區(qū)；igg3重鏈恒定區(qū)可以是seqidno:33所示igg3重鏈恒定區(qū)；和igg4重鏈恒定區(qū)可以是seqidno:34所示igg4重鏈恒定區(qū)，但本發(fā)明的范圍不限于此。

此外，當(dāng)特異性結(jié)合到dll4的單克隆抗體包括輕鏈恒定區(qū)時，輕鏈恒定區(qū)可以是拉姆達(dá)(λ)或卡帕(κ)輕鏈來源。當(dāng)單克隆抗體的輕鏈恒定區(qū)是λ輕鏈來源時，它可以是seqidno:35所示λ輕鏈恒定區(qū)，但不限于此。

如本文所用，術(shù)語"delta樣配體4(dll4)"是指結(jié)合到notch受體的delta類配體之一，優(yōu)選是指結(jié)合到notch1或notch2的蛋白，但不限于此。dll4可以是任何哺乳動物dll4，但優(yōu)選人dll4。為本發(fā)明的目的，dll4可以指可以結(jié)合到癌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的notch1或4受體從而誘導(dǎo)癌癥生長或誘導(dǎo)自身免疫疾病的進(jìn)展的蛋白，但不限于此。

已知dll4在包括腫瘤血管在內(nèi)的各種不同腫瘤細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，并在癌癥模型的腫瘤內(nèi)通過增強血管功能參與癌癥的擴散和轉(zhuǎn)移。此外，已知抑制dll4可以治療自身免疫疾病。

dll4蛋白包括，但不限于，野生型或突變型dll4蛋白。本文所用的術(shù)語野生型dll4蛋白通常是指包括野生型dll4蛋白的氨基酸序列的多肽，短語野生型dll4蛋白的氨基酸序列通常是指在天然產(chǎn)生的dll4中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。關(guān)于dll4的信息可由已知的數(shù)據(jù)庫獲得，包括國立衛(wèi)生研究院的基因庫，可以是，但不限于，例如，基因庫登記號nm_019074.3(geneid:54567)。

如本文所用，術(shù)語"notch受體"是指介導(dǎo)notch信號傳導(dǎo)的蛋白，可以與notch互換使用。notch受體可以是介導(dǎo)notch信號傳導(dǎo)的任何蛋白。優(yōu)選地，notch受體可以是notch1或notch4受體，但不限于此。為本發(fā)明的目的，notch受體可以是結(jié)合到哺乳動物dll4的任何蛋白，但優(yōu)選是結(jié)合到人dll4的蛋白。如本文所用，術(shù)語"notch"是指包括全部野生型notch或突變型notch蛋白。如本文所用，術(shù)語"野生型notch"是指包括野生型notch蛋白的氨基酸序列的多肽，短語"野生型notch蛋白的氨基酸序列"通常是指在天然產(chǎn)生的notch受體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。

如本文所用，短語"抑制人delta樣配體4和notch受體間相互作用"是指本發(fā)明的dll4特異性單克隆抗體結(jié)合到dll4從而抑制dll4和notch受體間相互作用。優(yōu)選地，該短語是指dll4特異性單克隆抗體結(jié)合到dll4從而抑制dll4和notch1或notch4受體間相互作用，但不限于此。本發(fā)明的dll4特異性單克隆抗體通過結(jié)合dll4抑制dll4和notch受體間相互作用從而防止notch受體的結(jié)構(gòu)改變。因此，它阻止notch蛋白水解從而抑制notch信號傳導(dǎo)。已知當(dāng)在腫瘤內(nèi)dll4結(jié)合到notch受體時，它激活血管內(nèi)皮細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)或腫瘤干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞間的notch信號傳導(dǎo)，增大血管的大小并增強腫瘤內(nèi)的血管功能，從而在腫瘤擴散和轉(zhuǎn)移中起作用(ji-liangli等,cancerres2007；67(23):11244-53)。因此，當(dāng)腫瘤內(nèi)dll4所致的notch信號傳導(dǎo)被抑制，血管生成不易控制，因此可以抑制腫瘤生長。此外，當(dāng)dll4被阻斷，在血管生成位點末端的細(xì)胞內(nèi)側(cè)抑制的損失看來導(dǎo)致過度(血管)萌發(fā)，導(dǎo)致具有低產(chǎn)率的血管生成反應(yīng)減少，可以減少供氧灌注以在腫瘤周圍引起缺氧，導(dǎo)致抗腫瘤效果，甚至是對抗vegf治療顯示出耐受性的腫瘤(noquera-troisei等,novartisfoundsymp2007；283:106-20)。因此有效抑制dll4和notch間相互作用的本發(fā)明dll4特異性人單克隆抗體可以有效用于治療癌癥。此外，已知抑制dll4可以促進(jìn)調(diào)節(jié)t細(xì)胞的發(fā)育從而緩解自身免疫疾病如腦脊髓炎(bassil等,jimmunol2011；187(5)；2322-8)。此外已知dll4拮抗劑可以用于治療自身免疫疾病(us專利公布號：2011-0189200)和dll4結(jié)合蛋白如抗體可以用于治療自身免疫疾病(us專利公布號：2011-0117079)。因此，有效結(jié)合到dll4從而抑制dll4和notch受體之間相互作用的本發(fā)明抗體也可以有效用于治療自身免疫性疾病。

在本發(fā)明的實施例中，構(gòu)建dll4-特異性人單克隆抗體mlck-1、mlck-2、mlck-3和mlck-4，觀察到與對照相比，這些抗體與人dll4的結(jié)合能力分別為47.82％、59％、52.85％和52.46％(圖3)，這些抗體在0.1μm的低抗體濃度下阻斷dll4和人notch1受體間的大部分結(jié)合(圖4)。此外，本發(fā)明的抗-dll4抗體，mlck-1、mlck-2、mlck-3和mlck-4對hdll4的kd(m)分別為2.63x10^-7m、1.71x10^-9m、6.96x10^-9m和2.13x10^-6m(圖5)。另外，dll4(抗體)以濃度依賴方式抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(圖6)。另外，dll4-notch信號傳導(dǎo)的激活導(dǎo)致抑制nicd產(chǎn)生(圖7)，這些結(jié)果表明本發(fā)明的dll4特異性人單克隆抗體可以通過有效阻斷dll4和notch受體間結(jié)合和通過抑制notch信號傳導(dǎo)提供抗癌效果和對自身免疫疾病的治療效果。

在另一方面，本發(fā)明提供制備上述單克隆抗體的方法。

使用傳統(tǒng)的單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)可容易制備本發(fā)明的單克隆抗體。例如，可以通過使用獲自免疫動物的b淋巴細(xì)胞產(chǎn)生雜交瘤(koeher和milstein,1976,nature,256:495)，或可以通過使用噬菌體展示技術(shù)實施制備單克隆抗體的方法，但不限于此。

使用噬菌體展示的抗體庫是采用直接獲自b淋巴細(xì)胞的抗體基因在噬菌體表面表達(dá)抗體的方法，不需要制備雜交瘤。與由b細(xì)胞永生化生成單克隆抗體相關(guān)的許多難點可以通過噬菌體展示方法克服。傳統(tǒng)的噬菌體展示包括步驟：1)將具有隨機序列的寡核苷酸插入噬菌體外殼蛋白piii(或piv)n末端對應(yīng)的區(qū)域；2)表達(dá)由所述具有隨機序列的寡核苷酸編碼的多肽和天然外殼蛋白的融合蛋白；3)處理能夠結(jié)合到由所述寡核苷酸編碼的多肽的受體材料；4)使用低ph或具有結(jié)合競爭力的分子洗脫結(jié)合到受體的肽-噬菌體顆粒；5)通過淘選在宿主細(xì)胞內(nèi)擴增洗脫的噬菌體；6)重復(fù)所述步驟從而獲得所需量的噬菌體；和7)采用由淘選選擇的噬菌體克隆dna序列檢測活性肽的序列。

在優(yōu)選的實施方式中，可通過噬菌體展示方法實施制備本發(fā)明單克隆抗體的方法。本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以參考，例如在barbas等(《方法：酶學(xué)方法指南》(methods:acompaniontomethodsinenzymology)2:119,1991和j.virol.2001jul；75(14):6692-9)和winter等(ann.rev.immunol.12:433,1994)中公開的已知噬菌體展示技術(shù)容易地實施以上步驟。可以用于構(gòu)建抗體庫的噬菌體的實例包括，但不限于，絲狀噬菌體如fd、m13、f1、if1、ike、zj/z、ff、xf、pf1和pf3。此外，可以用于在絲狀噬菌體表面表達(dá)異源基因的載體的實例包括，但不限于，噬菌體載體如fuse5、faff1、fd-cat1或fdtetdog，或噬菌粒載體如phen1、pcomb3、pcomb8或psex。此外，可以用于提供成功再感染重組噬菌體所需的天然外殼蛋白的輔助噬菌體的實例包括，但不限于m13k07和vscm13。

使用常規(guī)方法可以容易分離編碼本發(fā)明雜交瘤衍生單克隆抗體或噬菌體展示克隆的多核苷酸并測序(例如通過使用設(shè)計用于從雜交瘤或噬菌體dna模板特異性擴增感興趣的重鏈和輕鏈區(qū)域的寡核苷酸引物)。一旦分離多核苷酸，它可以置于表達(dá)載體內(nèi)，然后轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞，可以從轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(即轉(zhuǎn)化株)制備所需單克隆抗體。因此，用于制備本發(fā)明的人單克隆抗體的方法包括擴增含有編碼人單克隆抗體的多核苷酸的表達(dá)載體的步驟，但不限于此。

在另一方面，本發(fā)明提供編碼單克隆抗體的多核苷酸，包括該多核苷酸的表達(dá)載體和包括該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化株。

單克隆抗體如上所述。

本發(fā)明的包括編碼單克隆抗體的多核苷酸的表達(dá)載體沒有特別限制，但可以是能在包括哺乳動物細(xì)胞(例如，人、猴、兔、大鼠、倉鼠或小鼠細(xì)胞)、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌(e.coli))在內(nèi)的真核或原核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和/或表達(dá)多核苷酸的載體。較佳地，它可以是載體，包括至少一選擇性標(biāo)記，可操作地連接到合適的啟動子，以致可以在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多核苷酸。例如，載體可以包括導(dǎo)入噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、微型染色體、病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體的多核苷酸。

包括編碼多核苷酸的多核苷酸的表達(dá)載體可以是包括單克隆抗體的重鏈或輕鏈的表達(dá)載體，或是包括編碼單克隆抗體的重鏈或輕鏈的多核苷酸的表達(dá)載體。

導(dǎo)入本發(fā)明的表達(dá)載體從而形成轉(zhuǎn)化株的細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，鏈霉菌(streptomyces)和鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)；酵母細(xì)胞；真菌細(xì)胞如畢赤酵母(pichiapastoris)；昆蟲細(xì)胞如果蠅或夜蛾sf9細(xì)胞；動物細(xì)胞，如中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞，sp2/0(小鼠骨髓瘤)，人淋巴樣母細(xì)胞，cos，nso(小鼠骨髓瘤)，293t，bowes黑素瘤細(xì)胞，ht-1080，bhk(幼倉鼠腎細(xì)胞)，hek(人胚腎細(xì)胞)，perc.6(人視網(wǎng)膜細(xì)胞)等；和植物細(xì)胞。

如本文所用，術(shù)語"導(dǎo)入"是指將包括編碼單克隆抗體的多核苷酸的載體遞送入宿主細(xì)胞。此導(dǎo)入可以通過本領(lǐng)域中已知的各種方法，包括磷酸鈣-dna共沉淀，deae-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，顯微注射，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體融合，脂轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)體融合進(jìn)行。此外，轉(zhuǎn)染是指用病毒顆粒通過感染將期望材料遞送入細(xì)胞。此外，該載體可以通過基因轟擊導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在本發(fā)明中，導(dǎo)入與轉(zhuǎn)染可以互換使用。

在另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療癌癥的包括單克隆抗體的藥物組合物。

本發(fā)明的單克隆抗體可結(jié)合dll4以抑制dll4和notch受體間相互作用，從而它可以參與抑制癌癥生長。這里，dll4和notch受體如上所述。

如本文所用，術(shù)語"癌癥"是指可以由本發(fā)明單克隆抗體治療的任何類型的癌癥。可以由單克隆抗體治療的癌癥的例子，包括，但不限于，食道癌，胃癌，大腸癌，直腸癌，口腔癌，咽癌，喉癌，肺癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，子宮頸癌，子宮內(nèi)膜癌，卵巢癌，前列腺癌，睪丸癌，膀胱癌，腎癌，肝癌，胰腺癌，骨癌，結(jié)締組織癌，皮膚癌，腦癌，甲狀腺癌，白血病，霍奇金病，淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤和血液腫瘤。

如本文所用，術(shù)語“預(yù)防”是指通過施用該組合物抑制或延緩癌癥發(fā)展的所有行為，術(shù)語“治療”是指通過施用該組合物恢復(fù)或有益改變癌癥癥狀的所有行為。

該藥物組合物可以進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。

如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指不會對生物體引起顯著刺激且不會消除所施用化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。

可用于將本發(fā)明組合物配制為液體溶液形式的藥學(xué)上可接受的載體包括生理鹽水，無菌水，林格氏溶液，緩沖鹽溶液，葡萄糖溶液，麥芽糊精溶液，甘油，乙醇，和其中兩種或更多種的混合物。如果需要，本發(fā)明的組合物也可含有其它常規(guī)添加劑，如抗氧化劑，緩沖劑和抑菌劑。此外，本發(fā)明組合物還可包含稀釋劑，分散劑，表面活性劑，粘合劑和潤滑劑，以將它配置成可注射制劑，如水性溶液，懸浮液和乳劑，丸劑，膠囊劑，顆粒劑和片劑。

藥物組合物可以是各種口服或胃腸外制劑形式。使用包括填料，填充劑，粘合劑，潤濕劑，崩解劑，和表面活性劑在內(nèi)的常規(guī)稀釋劑或賦形劑配制藥物組合物。固體口服制劑包括片劑，丸劑，粉劑，顆粒劑，膠囊等。這些固體制劑可通過將至少一種化合物與一種或多種賦形劑，例如，淀粉，碳酸鈣，蔗糖，乳糖，明膠等混合來制備。除了簡單的賦形劑，也可使用潤滑劑如硬脂酸鎂或滑石。此外，液體口服制劑包括懸浮液，溶液，乳劑和糖漿等。除了通常用作簡單稀釋劑的水和液體石蠟外，還可包括各種賦形劑，例如，潤濕劑，甜味劑，香料，防腐劑等。腸胃外給藥的制劑包括滅菌水溶液，非水溶劑，懸浮劑，乳劑，凍干劑，栓劑等。丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，可注射酯如油酸乙酯等可以用作非水溶劑和懸浮劑。栓劑主要成分可以包括witepsol，聚乙二醇，吐溫61，可可脂，月桂脂，甘油明膠等。

藥物組合物可具有選自下組的任意一種制劑：片劑，丸劑，粉末，顆粒，膠囊，懸浮液，溶液，乳劑，糖漿，滅菌水溶液，非水溶液，懸浮液，乳液，凍干制劑和栓劑。

本發(fā)明的藥物組合物可以藥學(xué)有效量施用。

如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)有效量”是指其用量足以治療疾病，以適用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理的利益/風(fēng)險比率。組合物的有效劑量水平可以根據(jù)受試者的類型、疾病的嚴(yán)重程度、受試者的年齡和性別、藥物活性、對藥物的敏感性、給藥時間，給藥途徑、排泄率、治療時間、與組合物聯(lián)用的藥物和醫(yī)療領(lǐng)域中其他已知因素來確定。本發(fā)明的藥物組合物可單獨使用或與其它治療劑組合施用，并且可以與常規(guī)的治療劑依次或同時給藥?？刹捎靡环N或多種劑型中施用組合物?？紤]所有上述因素，在能夠表現(xiàn)出最大效果而不引起副作用的最小量下施用組合物至關(guān)重要，該最小量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。

在另一個方面，本發(fā)明提供了使用該單克隆抗體治療癌癥的方法。

在另一方面，本發(fā)明提供使用單克隆抗體用于治療癌癥的方法。

此處的單克隆抗體和癌癥都如上所述。

用于治療癌癥的方法可以包括對患有癌癥或懷疑患有癌癥的對象施用包含單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物的步驟。在這方面，藥學(xué)上可接受的載體如上所述。對象實例包括哺乳動物，包括牛，豬，羊，雞，狗和人。對象可以是有待通過施用本發(fā)明的組合物來治療癌癥的任何對象。

可采用一種或多種劑型給予治療有效量的組合物。在此，該組合物可以液體，粉末，氣霧劑，膠囊，腸溶包衣片劑或膠囊劑，或栓劑的形式施用。此外，該組合物可以腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，皮內(nèi)，經(jīng)口，鼻內(nèi)，肺內(nèi)或直腸內(nèi)施用，但不限于此。然而，當(dāng)組合物口服給藥時，肽在胃中消化，并且因為這個原因，應(yīng)將口服組合物配制成包衣或保護(hù)活性成分以防在胃中分解。此外，可使用能夠遞送活性成分到靶細(xì)胞的任何系統(tǒng)施用該藥物組合物。

在另一方面，本發(fā)明提供用于診斷癌癥的方法，該方法包括利用上述單克隆抗體通過抗原-抗體反應(yīng)檢測分離自懷疑患有癌癥的對象的生物樣品中delta樣配體4(dll4)蛋白的步驟。

此處的單克隆抗體，癌癥，個體和dll4蛋白如上所述。

在診斷癌癥的方法中，可以通過本發(fā)明的dll4特異性單克隆抗體與分離自懷疑患有癌癥的個體的生物樣本反應(yīng)和檢測抗原-抗體復(fù)合物的形成來檢測dll4蛋白，由此可以提供診斷癌癥的信息或可以診斷癌癥。因為在包括卵巢癌細(xì)胞在內(nèi)的各種癌細(xì)胞中dll4過表達(dá)(weihu等,cancerres2011；71:6030-6039.)，可以通過比較生物樣本和對照組如正常細(xì)胞或組織中dll4表達(dá)水平來診斷癌癥，但不限于此。

具體地，診斷癌癥的方法可以是為癌癥診斷提供信息的方法或診斷癌癥的方法，該方法包括以下步驟：(a)采用上述單克隆抗體處理分離自懷疑患有癌癥的對象的生物樣品，以通過抗原-抗體反應(yīng)檢測dll4蛋白；和(b)比較步驟(a)中檢測的dll4蛋白的水平和對照組的dll4蛋白的水平，如果生物樣品中dll4蛋白水平比對照組高，判斷對象患有癌癥。

如本文所用，術(shù)語“生物樣品”是指包括組織，細(xì)胞，全血，血清，血漿，組織尸檢樣品(腦，皮膚，淋巴結(jié)，脊髓等)，細(xì)胞培養(yǎng)上清，破裂的真核細(xì)胞，以及細(xì)菌表達(dá)組織，但不限于此。這些生物樣品可以在操作或非操作狀態(tài)與本發(fā)明的單克隆抗體反應(yīng)，以確定dll4蛋白質(zhì)的存在，或存在或不存在癌癥。

如本文所用，術(shù)語“抗原-抗體復(fù)合物”是指樣品中dll4蛋白抗原和識別該dll4蛋白抗原的本發(fā)明單克隆抗體的結(jié)合物?？梢酝ㄟ^選自下組的任何方法檢測該抗原-抗體復(fù)合物的形成：比色法，電化學(xué)法，熒光法，發(fā)光法，粒子計數(shù)法，視覺評估和閃爍計數(shù)法，但不限于此，并且各種方法都可以使用。

在本發(fā)明中，各種標(biāo)記可用于檢測抗原-抗體復(fù)合物。標(biāo)記的具體例子包括，但不限于，酶，熒光材料，配體，發(fā)光材料，微粒，和放射性同位素。

用作檢測標(biāo)記的酶的例子包括乙酰膽堿酯酶，堿性磷酸酶，β-d-半乳糖苷酶，辣根過氧化物酶，β-內(nèi)酰胺酶。熒光材料的實例包括eu³⁺、eu³⁺螯合劑、穴狀化合物等。配體的實例包括生物素衍生物和類似物，發(fā)光材料的實例包括吖啶酯，異魯米諾衍生物等。此外，微粒的例子包括膠體金，有色膠乳等等，和放射性同位素的實例包括⁵⁷co、³h、¹²⁵i和¹²⁵i-巴頓亨特試劑(¹²⁵i-bontonhunterreagent)。

優(yōu)選地，可通過elisa方法檢測抗原-抗體復(fù)合物。elisa法的實例包括使用識別附著于固體載體上的抗原的標(biāo)記抗體的直接elisa，使用識別抗體復(fù)合物(識別附著于固體支持物的抗原)內(nèi)的捕獲抗體的標(biāo)記二抗的間接elisa，包括使用標(biāo)記抗體從而識別附著于固體支持物的抗原-抗體復(fù)合物內(nèi)抗原的直接夾心elisa，以及包括附著于固體支持物的抗原-抗體復(fù)合物內(nèi)的抗原與抗體反應(yīng)隨后標(biāo)記二抗與反應(yīng)抗體反應(yīng)的間接夾心elisa。

單克隆抗體可以具有檢測標(biāo)記。如果該單克隆抗體不具有檢測標(biāo)記，它可被捕獲并通過用具有檢測標(biāo)記的另一抗體處理來檢測。

在另一方面，本發(fā)明提供包括上述單克隆抗體的用于診斷癌癥的組合物。

此處的單克隆抗體和癌癥如上所述。

包括本發(fā)明dll4特異性單克隆抗體的診斷組合物可以用于診斷dll4的表達(dá)、與dll4的表達(dá)水平相關(guān)的疾病或dll4介導(dǎo)的疾病如癌癥。

在又一方面，本發(fā)明提供包括上述診斷組合物的用于診斷癌癥的試劑盒。

此處的組合物和癌癥如上所述。

此外，用于診斷癌癥的試劑盒還可包括組合物、溶劑或裝置，其具有適用于分析的一種或多種其他組分。

在又一方面，本發(fā)明提供包括上述單克隆抗體的用于預(yù)防或治療自身免疫疾病的藥物組合物。

此處的單克隆抗體、預(yù)防和治療如上所述。此外，藥物組合物還可包括藥學(xué)上可接受的載體。此處的藥學(xué)上可接受的載體如上所述。

如本文所用，術(shù)語"自身免疫疾病"統(tǒng)一是指由對患病對象的抗原的免疫反應(yīng)直接或間接導(dǎo)致的疾病。自身免疫疾病的實例包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性皮炎、牛皮癬、斑禿、哮喘、克羅恩氏病、白塞病(behcet'sdisease)、斯耶格侖綜合征(sjogren’ssyndrome)、格-巴二氏綜合征(gillaine-barresyndrome)、慢性甲狀腺炎、多發(fā)性硬化癥、多肌炎、強直性脊柱炎、腦脊髓炎、纖維組織炎和結(jié)節(jié)性多動脈炎。

如上所述，本發(fā)明的dll4特異性人單克隆抗體可以促進(jìn)調(diào)節(jié)t細(xì)胞的發(fā)育，因此可以用于治療自身免疫疾病。

在又一方面，本發(fā)明提供使用上述單克隆抗體治療自身免疫疾病的方法。

特別地，用于治療自身免疫疾病的方法可包括對患有或疑似患有自身免疫疾病的對象施以包括單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物的步驟。此處的自身免疫疾病、對象和藥學(xué)上可接受的載體如上所述。

發(fā)明實例

以下，將參考實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。但是應(yīng)理解，這些實施例僅用作描述的目的，并不是為了限制本發(fā)明的范圍。

實施例1：抗dll4抗體的制備

實施例1-1：dll4抗原的制備

用于本實施例的人dll4胞外域的抗原是購自r&d系統(tǒng)(r&dsystem)的人dll4蛋白(目錄：1506-d4/cf)。dll4抗原蛋白包括dll4的第27到第522位氨基酸殘基。此外，蛋白的c末端附以組氨酸標(biāo)簽。

然后，制備dll4胞外域的特異性區(qū)域的另一抗原。特異性區(qū)域包括dll4的第27到第251位氨基酸殘基。該區(qū)域包括已知與notch1受體結(jié)合的稱為delta/serrate/lag-2(dsl)結(jié)構(gòu)域的基序(tax等,1994,nature368:150-4)。采用標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)制備哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒載體，該載體包括編碼與fc蛋白融合的dll4胞外域的缺失片段的多核苷酸以及上游的cmv啟動子。還通過使用標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)制備編碼dll4的缺失片段(與fc蛋白融合的人dll4的嵌合體)的其他構(gòu)建體。包括與fc蛋白融合的人dll4第27到251位氨基酸殘基的重組融合蛋白瞬時轉(zhuǎn)染hek293e細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。為制備抗原蛋白，每72小時收集條件化培養(yǎng)基，該過程重復(fù)四次。通過a蛋白親和色譜從條件化培養(yǎng)基純化抗原蛋白。

實施例1-2：文庫噬菌體的制備

將10μg/ml重組人源dll4溶液(r&d系統(tǒng))加入免疫管，4℃下，dll4蛋白在免疫管表面上吸附過夜。然后，1％牛血清白蛋白(bsa)溶液加入到免疫管，以保護(hù)dll4未吸附的表面區(qū)域。排空免疫管后，加入分散在1％bsa溶液中的10¹²cfu抗體噬菌體文庫，這樣它們可以與抗原結(jié)合。采用磷酸鹽緩沖鹽水-0.05％吐溫20(pbs-t)溶液洗滌免疫管5次，以除去非特異性結(jié)合的噬菌體，用100mm的三乙胺溶液收集剩余的抗原特異性噬菌體抗體。將收集的噬菌體用1mtris緩沖液(ph7.4)中和，然后在37℃下轉(zhuǎn)染入大腸桿菌er2537，1小時。將轉(zhuǎn)染的e.coli細(xì)胞鋪到包含羧芐青霉素的luria-bertani(lb)瓊脂培養(yǎng)基上，并在37℃培養(yǎng)過夜。第二天，將培養(yǎng)的大腸桿菌細(xì)胞懸浮在4毫升超級肉湯(sb)-羧芐青霉素培養(yǎng)基中，并加入15％甘油。然后，將一部分細(xì)胞懸浮液儲存在-80℃，剩余50微升在37℃溫育于20毫升添加有2％葡萄糖溶液的sb-羧芐青霉素培養(yǎng)基內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物在600納米的吸光度達(dá)到0.6，離心除去培養(yǎng)基，剩下的細(xì)胞沉淀物再懸浮于20毫升sb-羧芐青霉素培養(yǎng)基中，并加入10¹²pfu的vcsm13輔助噬菌體。然后將細(xì)胞培養(yǎng)物于37℃緩慢攪拌下溫育。第二天，離心細(xì)胞培養(yǎng)物，僅收集培養(yǎng)基收集并加入4％的聚乙二醇8000(peg8000)和3％的氯化鈉(nacl)，在4℃放置30分鐘，然后離心。除去上清液，并將沉淀的噬菌體懸浮于1mlpbs中。使用該懸浮液作為文庫，重復(fù)上述淘選過程以擴增并濃縮抗原特異性克隆。

實施例1-3：通過噬菌體展示淘選

為篩選結(jié)合到人dll4蛋白內(nèi)notch1結(jié)合位點的抗體，對應(yīng)于人dll4蛋白特異性區(qū)域的缺失片段(第27至第251個氨基酸殘基)和人dll4蛋白進(jìn)行3輪交叉淘選。然后，將細(xì)胞鋪在含有抗體基因的lb-羧芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基上并培養(yǎng)以獲得單菌落，然后將其接種到400微升sb-羧芐青霉素培養(yǎng)基并溫育，之后通過添加iptg誘導(dǎo)大腸桿菌周質(zhì)內(nèi)scfv型蛋白的表達(dá)。大腸桿菌細(xì)胞懸浮于tes溶液(tris，edta，蔗糖)，并在4℃靜置1小時。接著離心懸浮液提取周質(zhì)，然后使用elisa技術(shù)將其用于檢查重組人dll4抗原和scfv間的結(jié)合(steinberger.rader和barbasiii.2000.噬菌體展示載體(phagedisplayvectors)，刊于噬菌體展示實驗手冊(phagedisplaylaboratorymanual)，第一版.冷泉港實驗室出版社.紐約.美國.第11.9-11.12頁)。使用辣根過氧化物酶(hrp)-抗ha抗體和四甲基聯(lián)苯胺(tmb)底物檢測結(jié)合scfv。檢測到的抗原特異性抗體的克隆進(jìn)行測序。

實施例2：抗dll4抗體對dll4的結(jié)合親合力試驗

實施例1中分離和純化的抗體分別命名為"mlck-1"、"mlck-2"、"mlck-3"和"mlck-4"，并發(fā)現(xiàn)分別包括seqidno:1所示重鏈可變區(qū)和seqidno:15所示輕鏈可變區(qū)(mlck-1)，seqidno:5所示重鏈可變區(qū)和seqidno:19所示輕鏈可變區(qū)(mlck-2)，seqidno:8所示重鏈可變區(qū)和seqidno:23所示輕鏈可變區(qū)(mlck-3)，和seqidno:11所示重鏈可變區(qū)和seqidno:27所示輕鏈可變區(qū)(mlck-4)。分離的抗體與抗原的親合力采用以下方法分析。

使用elisa結(jié)合試驗評價抗dll4抗體-抗原結(jié)合親和力。4℃，采用2微克/毫升hdll4-his蛋白的pbs溶液包被96孔微量滴定板(nunc-免疫板，nunc，羅切斯特，紐約)過夜，用bsa(牛血清白蛋白)封閉非特異性結(jié)合位點2小時。以抗體濃度范圍從0nm到128nm將96孔微量滴定板上的抗dll4抗體(純化蛋白)轉(zhuǎn)移到微量滴定板。然后溫育板2小時，之后采用含0.05％吐溫20的pbs洗板5次，為檢測板結(jié)合的dll4抗體，以1:10000比例稀釋hrp結(jié)合的fab多克隆抗體試劑(皮爾斯公司-pierce)，轉(zhuǎn)移到洗滌過的微量滴定板，然后在37℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)后，用比色底物(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺；西格瑪奧德里奇公司)進(jìn)行顯色。用0.5摩爾/升硫酸終止酶反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀(分子裝置)記錄450nm-650nm的吸光度。結(jié)果表明，抗體對dll4的結(jié)合親和力以濃度依賴方式增加(圖2)。

實施例3：檢測抗dll4抗體結(jié)合dll4配體的能力

通過facs分析和elisa一起檢測抗dll4抗體結(jié)合dll4的能力。

具體地，制備穩(wěn)定表達(dá)人dll4的人胚胎腎細(xì)胞(hek293)，采用制備的細(xì)胞和facscalibur系統(tǒng)(bd生物科學(xué)公司)檢測抗dll4抗體與dll4的結(jié)合程度。分離穩(wěn)定表達(dá)dll4的hek293細(xì)胞，用pbs洗滌，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×10⁵細(xì)胞/200微升pbs，用10微克各dll4單克隆抗體處理，然后使其在室溫下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后，將細(xì)胞用pbs洗滌，4℃下與fitc標(biāo)記的fc特異性抗體(山羊抗人iggfitc偶聯(lián)物，fc特異性，西格瑪，f9512；濃度：2.0mg/ml)以濃度為5微升/1×10⁵細(xì)胞/200微升pbs反應(yīng)1小時。反應(yīng)后用pbs洗滌細(xì)胞，并使用facscalibur系統(tǒng)進(jìn)行分析。對照組只用fitc標(biāo)記的fc特異性抗體處理。采用各dll4單克隆抗體處理的試驗組中人dll4-單克隆抗體-fitc結(jié)合的分析結(jié)果與對照組進(jìn)行比較

各單克隆抗體與人dll4抗原的(結(jié)合)程度的檢測結(jié)果示于圖3。從圖3可看出，相比對照組，單克隆抗體與dll4抗原的結(jié)合程度如下：mlck-1：47.82％(圖3a)；mlck-2：59％(圖3b)；mlck-3：52.85％(圖3c)和mlck-4：52.46％(圖3d)。

這樣的結(jié)果表明，本發(fā)明的mlck-1，mlck-2，mlck-3和mlck-4抗體對人dll4具有高度結(jié)合親和力。

實施例4:抗dll4抗體的中和作用的試驗

采用elisa溶液競爭試驗評價抗dll4抗體的中和作用。

4℃，采用100微升500ng/ml的hnotch-1-hfc蛋白(r&d系統(tǒng))(pbs稀釋)包被96孔微量滴定板(nunc-免疫板，nunc，羅切斯特，紐約)的各孔過夜，用bsa封閉非特異性結(jié)合位點2小時。

96孔微量滴定板上的抗dll4抗體(純化蛋白)以抗體濃度范圍從0nm至140nm與連續(xù)稀釋的抗原蛋白(dll4抗原，600納克/毫升)預(yù)混合?？乖?抗體混合物孵育30分鐘后，為檢測游離抗體將其轉(zhuǎn)移至預(yù)包被有dll4受體hnotch-1蛋白(50ng/孔)的微量滴定板。然后，將板孵育2小時，并用含0.05％吐溫20的pbs洗滌五次。為了檢測結(jié)合到板的dll4抗原，以1：500的比例稀釋hrp-偶聯(lián)his抗小鼠igg多克隆抗體試劑(羅氏應(yīng)用科學(xué))，并且將洗滌的微量滴定板用稀釋的抗體試劑處理，然后使其在37℃反應(yīng)1小時。然后，用比色底物(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺；西格瑪奧德里奇公司)進(jìn)行顯色，并用0.5摩爾/升硫酸終止酶反應(yīng)。檢測450nm-650nm的吸光度，檢測結(jié)果示于圖4。

實現(xiàn)與板包被notch1-fc結(jié)合的人dll4-his有50％降低所需的抗體的量(ic50)示于下表1

表1

結(jié)果是，本發(fā)明的四種抗體均表現(xiàn)出0.4-3.7nm的ic50值，表明這些抗體能以非常低的濃度抑制人notch-1與dll4配體的結(jié)合(圖4和表1)。該結(jié)果表明，本發(fā)明的四種抗體可通過抑制dll4配體和notch間的相互作用抑制癌細(xì)胞的生長。

實施例5：分析抗dll4抗體的結(jié)合能力

實施biacore測定法來確定抗dll4抗體的結(jié)合能力。

具體而言，biacoret200用于spr分析和hbs-ep(10mmhepes，ph7.4的，150mm氯化鈉，3mmedta，0.15％表面活性劑p20)作為電泳緩沖液。通過使用向?qū)С绦虻谋砻嫣幚砟繕?biāo)固定工具完成表面處理(條件：25℃，5微升/分鐘)。配體(hdll4)用10mm乙酸鈉(ph4.5)稀釋到終濃度為10微克/毫升，然后根據(jù)各測試組的目標(biāo)固定水平被固定到cm5芯片的表面。在固定化過程中，兩個流動池作為一組，其中第一流動池設(shè)置為空白和第二流動池具有本實驗中固定到其表面的hdll4。第一流動池用作參比以便解釋非特異性結(jié)合和緩沖液影響所致的實驗變化性，在分析中，減去的ru值(fc2-fc1)作為實驗的結(jié)果。結(jié)合于hdll4的抗dll4抗體，即mlck1，mlck2，mlck-3和mlck4在電泳緩沖液中被稀釋至終濃度為100nm，連續(xù)稀釋5倍，并且對5個稀釋液中的每一個進(jìn)行分析。將待分析的樣品制備成具有高純度，高濃度，充分稀釋最低100倍以上，從而最大限度地減少緩沖液影響。全部分析是通過使用向?qū)С绦蛲瓿?，每個樣品重復(fù)篩選和在各分析步驟之間包括再生步驟，以使實驗的標(biāo)準(zhǔn)保持不變。由bia評估軟件4.0版分析實驗結(jié)果。此時，為確定ru值(fc2-fc1和fc4-fc3)，基線設(shè)置為零，從整個傳感圖減去在緩沖液注射部分測定的值(分析物，0nm)。然后，通過1:1結(jié)合模型分析得到的ru值來確定結(jié)合親和力。待分析的因素包括ka(m^-1s^-1)、kd(s^-1)、ka(1/m)和kd(m)。具體而言，ka是表明結(jié)合親和力的締合常數(shù)，kd是表明穩(wěn)定性的解離常數(shù)。平衡解離常數(shù)kd(m)通過kd除以ka進(jìn)行計算(kd/ka)。

結(jié)果，如圖5所示，對于hdll4，mlck-1抗體的kd(m)為2.63×10^-7m，mlck-2抗體的kd(m)為1.71×10^-9m，mlck-3抗體的kd(m)為6.96×10^-9m和mlck-4抗體的kd(m)為2.13×10^-6m。

實施例6：分析抗dll4抗體對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)增殖的影響

為研究dll4結(jié)合抗體對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)增殖的影響，分析代表性的抗dll4抗體，mlck-2抗體對huvec增殖的影響。

具體而言，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)購自隆薩公司(lonza)用于本實驗。室溫下，用添加有1％明膠(西格瑪)的pbs緩沖液(gibco)包被t型燒瓶(nunc)4至6小時，用pbs洗滌后將它用于培養(yǎng)huvec。補充有egm-2singlequot(隆薩公司)的ebm-2(隆薩公司)用作培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)物的密度保持在80％以下，37℃，在5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。六代前的細(xì)胞用于本實驗。通過以下方法進(jìn)行huvec增殖測定。首先，為制備hdll4包被板，在實驗前一天，用碳酸鹽緩沖液稀釋rhdll4(r&d系統(tǒng))至在96孔板(bd)內(nèi)的終濃度為1微克/毫升，各孔接種100微升稀釋的rhdll4，將板在4℃孵育過夜。此外，在補充有0.1％fbs的ebm-2基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)huvec24小時以使血清影響最小化。在實驗的第一天，rhdll4包被板的各孔用pbs洗滌兩次，并且對于每個測試組，將用ebm-2基本培養(yǎng)基稀釋的mlck-2單克隆抗體(為20微克/毫升)添加到各孔，一式三份，室溫孵育20分鐘。饑餓24小時的huvec解離成單細(xì)胞，并用ebm-2基本培養(yǎng)基稀釋至4×10³細(xì)胞/孔。將稀釋的細(xì)胞接種在用抗體處理過的孔內(nèi)，37℃下在5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育96小時。一旦細(xì)胞增殖結(jié)束，10微升細(xì)胞計數(shù)成套試劑-8(cck-8，dojino)加入各孔，37℃下將板在5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5小時。使用儀器spectramax190(分子裝置)檢測樣品在450納米-650納米的吸光度，并比較不同實驗組之間的細(xì)胞增殖水平。

結(jié)果，如圖6所示，本發(fā)明的代表性抗dll4抗體以濃度依賴方式阻斷dll4介導(dǎo)的huvec增殖抑制。

實施例7：分析抗dll4抗體對dll4/notch信號傳導(dǎo)通路的抑制活性

在notch信號傳導(dǎo)中，當(dāng)dll4結(jié)合notch受體時，這將導(dǎo)致notch受體構(gòu)成變化致使其被裂解，然后notch的胞內(nèi)域(nicd)進(jìn)入細(xì)胞核并介導(dǎo)notch信號傳導(dǎo)。在這方面，可以證實本發(fā)明的抗dll4抗體是否能抑制dll4與notch受體間的結(jié)合，從而通過監(jiān)測如下notch受體裂解的抑制來干擾notch信號傳導(dǎo)。

具體而言，為了檢測dll4結(jié)合抗體對dll4/notch信號傳導(dǎo)通道的抑制活性，本實驗中分析huvec內(nèi)信號傳導(dǎo)通道的抑制。實驗前一天，重組人dll4(rhdll4，r&d系統(tǒng))用碳酸鹽緩沖液稀釋至1微克/毫升的終濃度，然后以1ml/孔將稀釋的rhdll4加入6孔板(bd)，并于4℃孵育過夜。對于未用rhdll4處理的對照組，僅將1ml/孔碳酸鹽緩沖液加入板并于4℃孵育過夜。第二天，從4℃冰箱取出dll4包被的板，用pbs洗滌一次，并將1ml的egm-2培養(yǎng)基加入該板的各孔中。然后，各抗體，20μg/ml抗vegfmab、0.08nmdbz和20μg/mlmlck-2mab加入實驗組的各孔。各孔中培養(yǎng)基終體積為2毫升?？贵w的加入體積是培養(yǎng)基體積的兩倍。將板孵育20分鐘?？贵w處理期間，取出含有第2代-第5代huvec的75t板，從板去除培養(yǎng)基后，將細(xì)胞解離成單細(xì)胞。通過離心，用新鮮的egm-2培養(yǎng)基洗滌并重懸huvec。細(xì)胞計數(shù)后，將樣品稀釋至5×10⁵細(xì)胞/ml并將1毫升細(xì)胞樣品接種到各孔中，37℃下在5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一天。培養(yǎng)huvec后，去除每個孔中的培養(yǎng)基，將細(xì)胞用pbs洗滌一次，并用2ml的包括0.2％fbs的ebm-2基本培養(yǎng)基處理。各孔中另添加濃度相同的各抗體，前一天處理的20μg/ml抗vegfmab、0.08nmdbz和20μg/mlmlck-2mab，37℃下將細(xì)胞在5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一天。然后，含有用抗體處理的huvec的各孔用100納克/毫升hvegf(r&d系統(tǒng))處理，并在37℃孵育5分鐘。然后取出板，快速去除培養(yǎng)基。將細(xì)胞用pbs洗滌一次，將150微升細(xì)胞溶解緩沖液(1％np-40，20nmtris，137mm氯化鈉，10％甘油，2mmedta，1mm的原釩酸鈉，1×蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物)加入各孔，并振蕩板以鋪散溶解緩沖液。

接著，將板置于冰上，使用刮刀從各孔收集huvec，放入1.5ml管中并儲存在冰上。每5分鐘，將含細(xì)胞的1.5毫升管渦旋3次，并再次置于冰上用于細(xì)胞溶解。然后將樣品在4℃以14000rpm離心10分鐘，分離的上清液轉(zhuǎn)移到新管中并稱重。對于sds-page分析，將上清液加入到5×sds樣品緩沖液并在100℃煮沸10分鐘，通過sds-page分析。此時，將制備的蛋白質(zhì)樣品通過4％-12％的bis-tris凝膠進(jìn)行電泳，根據(jù)其大小分離，并且用下列抗體對分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白印跡：nicd(cs公司-cellsignaling)、p-erk(cs公司)、erk(cs公司)、vegfr2(cs公司)、p-vegfr2(cs公司)和肌動蛋白(sc公司-santacruz)。

結(jié)果，如圖7所示，采用本發(fā)明的代表性抗體，mlck-2mab作細(xì)胞處理降低nicd水平(泳道7)，該水平之前通過dll4處理被增加(泳道4和5)。

盡管為說明已描述本發(fā)明優(yōu)選實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在不脫離所附權(quán)利要求公開的本發(fā)明的范圍和實質(zhì)的情況下，各種修改、增加和替換是可能的。

序列表

<110>韓華石油化學(xué)株式會社

<120>特異性結(jié)合到dll4的新型單克隆抗體及其應(yīng)用

<130>p2016-1708

<150>kr10-2012-0071996

<151>2012-07-02

<150>kr10-2013-0071261

<151>2013-06-20

<160>35

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-1的重鏈可變區(qū)

<400>1

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasptyr

202530

alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

sertrpiletyrseraspaspglyasnlystyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargalaasppropropheasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>2

<211>10

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<213>人工序列

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<400>2

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<213>人工序列

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151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

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<213>人工序列

<220>

<223>mlck-3的重鏈可變區(qū)的cdr3

<400>10

alaaspleupropheasptyr

15

<210>11

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-4的重鏈可變區(qū)

<400>11

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasntyr

202530

alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

sertrpiletyrhisglyglyglyaspthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargglyproasntyrthrpheglylyspropheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>12

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-4的重鏈可變區(qū)的cdr1

<400>12

glyphethrpheserasntyralametser

1510

<210>13

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-4的重鏈可變區(qū)的cdr2

<400>13

trpiletyrhisglyglyglyaspthrtyrtyralaaspservallys

151015

gly

<210>14

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-4的重鏈可變區(qū)的cdr3

<400>14

glyproasntyrthrpheglylyspropheasptyr

1510

<210>15

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-1的輕鏈可變區(qū)

<400>15

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysthrglyserserserasnileglyserasn

202530

asnvalsertrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu

354045

iletyrseraspasnasnargproserglyvalproaspargpheser

505560

glyserlysserglythrseralaserleualaileserglyleuarg

65707580

sergluaspglualaasptyrtyrcysalathrtrpaspserserleu

859095

asnglytyrvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>16

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-1的輕鏈可變區(qū)的cdr1

<400>16

thrglyserserserasnileglyserasnasnvalser

1510

<210>17

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-1的輕鏈可變區(qū)的cdr2

<400>17

seraspasnasnargproser

15

<210>18

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-1的輕鏈可變區(qū)的cdr3

<400>18

alathrtrpaspserserleuasnglytyrval

1510

<210>19

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-2的輕鏈可變區(qū)

<400>19

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysthrglyserserserasnileglyserasn

202530

aspvalthrtrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu

354045

iletyralaaspserlysargproserglyvalproaspargpheser

505560

glyserlysserglythrseralaserleualaileserglyleuarg

65707580

sergluaspglualaasptyrtyrcysglythrtrpasptyrserleu

859095

seralatyrvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>20

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-2的輕鏈可變區(qū)的cdr1

<400>20

thrglyserserserasnileglyserasnaspvalthr

1510

<210>21

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-2的輕鏈可變區(qū)的cdr2

<400>21

alaaspserlysargproser

15

<210>22

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-2的輕鏈可變區(qū)的cdr3

<400>22

glythrtrpasptyrserleuseralatyrval

1510

<210>23

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-3的輕鏈可變區(qū)

<400>23

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysserglyserserserasnileglyasnasn

202530

alavalthrtrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu

354045

iletyrseraspasnhisargproserglyvalproaspargpheser

505560

glyserlysserglythrseralaserleualaileserglyleuarg

65707580

sergluaspglualaasptyrtyrcysglythrtrpaspalaserleu

859095

serglytyrvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>24

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-3的輕鏈可變區(qū)的cdr1

<400>24

serglyserserserasnileglyasnasnalavalthr

1510

<210>25

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-3的輕鏈可變區(qū)的cdr2

<400>25

seraspasnhisargproser

15

<210>26

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-3的輕鏈可變區(qū)的cdr3

<400>26

glythrtrpaspalaserleuserglytyrval

1510

<210>27

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-4的輕鏈可變區(qū)

<400>27

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysargglyserproserasnileglyasnasn

202530

thrvaltyrtrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu

354045

iletyrseraspserglnargproserglyvalproaspargpheser

505560

glyserlysserglythrseralaserleualaileserglyleuarg

65707580

sergluaspglualaasptyrtyrcysglysertrpasptyrserleu

859095

seralatyrvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>28

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mlck-4的輕鏈可變區(qū)的cdr1

<400>28

argglyserproserasnileglyasnasnthrvaltyr

1510

<210>29

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cmlck-4的輕鏈可變區(qū)的cdr2

<400>29

seraspserglnargproser

15

<210>30

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cmlck-4的輕鏈可變區(qū)的cdr3

<400>30

glysertrpasptyrserleuseralatyrval

1510

<210>31

<211>330

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg1的重鏈恒定區(qū)

<400>31

alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys

151015

serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr

65707580

tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys

859095

lysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys

100105110

proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro

115120125

lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys

130135140

valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp

145150155160

tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu

165170175

gluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu

180185190

hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn

195200205

lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysgly

210215220

glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu

225230235240

metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr

245250255

proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn

260265270

asntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphephe

275280285

leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn

290295300

valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr

305310315320

glnlysserleuserleuserproglylys

325330

<210>32

<211>326

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg2的重鏈恒定區(qū)

<400>32

alaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysserarg

151015

serthrsergluserthralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserasnpheglythrglnthr

65707580

tyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasplys

859095

thrvalgluarglyscyscysvalglucysproprocysproalapro

100105110

provalalaglyproservalpheleupheproprolysprolysasp

115120125

thrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalasp

130135140

valserhisgluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspgly

145150155160

valgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasn

165170175

serthrpheargvalvalservalleuthrvalvalhisglnasptrp

180185190

leuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleupro

195200205

alaproileglulysthrileserlysthrlysglyglnproargglu

210215220

proglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasn

225230235240

glnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspile

245250255

alavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthr

260265270

thrproprometleuaspseraspglyserphepheleutyrserlys

275280285

leuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercys

290295300

servalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleu

305310315320

serleuserproglylys

325

<210>33

<211>377

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg3的重鏈恒定區(qū)

<400>33

alaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysserarg

151015

serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr

65707580

tyrthrcysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys

859095

argvalgluleulysthrproleuglyaspthrthrhisthrcyspro

100105110

argcysprogluprolyssercysaspthrproproprocysproarg

115120125

cysprogluprolyssercysaspthrproproprocysproargcys

130135140

progluprolyssercysaspthrproproprocysproargcyspro

145150155160

alaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolys

165170175

prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval

180185190

valvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnphelystrptyr

195200205

valaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglu

210215220

glntyrasnserthrpheargvalvalservalleuthrvalleuhis

225230235240

glnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlys

245250255

alaleuproalaproileglulysthrileserlysthrlysglygln

260265270

proarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumet

275280285

thrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrpro

290295300

seraspilealavalglutrpgluserserglyglnprogluasnasn

305310315320

tyrasnthrthrproprometleuaspseraspglyserphepheleu

325330335

tyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnile

340345350

phesercysservalmethisglualaleuhisasnargphethrgln

355360365

lysserleuserleuserproglylys

370375

<210>34

<211>327

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg4的重鏈恒定區(qū)

<400>34

alaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysserarg

151015

serthrsergluserthralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrlysthr

65707580

tyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasplys

859095

argvalgluserlystyrglyproprocysproprocysproalapro

100105110

gluphegluglyglyproservalpheleupheproprolysprolys

115120125

aspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalval

130135140

aspvalserglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalasp

145150155160

glyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnphe

165170175

asnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasp

180185190

trpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleu

195200205

proserserileglulysthrileserlysalalysglyglnproarg

210215220

gluproglnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlys

225230235240

asnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproserasp

245250255

ilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlys

260265270

thrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrser

275280285

argleuthrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalpheser

290295300

cysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysser

305310315320

leuserleuserleuglylys

325

<210>35

<211>105

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>λ輕鏈的恒定區(qū)

<400>35

glnprolysalaalaproservalthrleupheproproserserglu

151015

gluleuglnalaasnlysalathrleuvalcysleuileseraspphe

202530

tyrproglyalavalthrvalalatrplysalaaspserserproval

354045

lysalaglyvalgluthrthrthrproserlysglnserasnasnlys

505560

tyralaalasersertyrleuserleuthrprogluglntrplysser

65707580

hisargsertyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrvalglu

859095

lysthrvalalaproalaglucysser

100105