專利名稱：一種依替巴肽的液相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種依替巴肽的液相合成方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
依替巴肽(Eptifibatide)由美國(guó)COR Therapeutic公司研發(fā)，1998年在美國(guó)上市，用于急性冠脈綜合癥(Acute Coronary Syndrome, ACS)的治療。通過(guò)抑制凝血因子I (Fibrinogen),與血小板糖蛋白II b / III a受體結(jié)合,從而抑制血小板聚集。在臨床應(yīng)用中，對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死、冠狀動(dòng)脈介入等心血管疾病的治療均顯示了良好療效。目前，心血管疾病逐年增加已成為現(xiàn)代社會(huì)對(duì)人類健康威脅嚴(yán)重的常見(jiàn)病之一，作為具有藥效高、毒副作用低、不會(huì)在體內(nèi)蓄積中毒等優(yōu)勢(shì)的多肽藥物，依替巴肽可有效減少心血管事件的發(fā)生率，降低死亡率，其臨床應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣。目前已知的依替巴肽化學(xué)合成方法中，固相合成作為實(shí)驗(yàn)室研究是一個(gè)較好的方法，此方法高效、迅速，但固相合成原料利用率低，使用的試劑及溶劑昂貴、不易處理，用到的乙二硫醇、DMF等毒性較大不適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。其中，采用Fmoc-Har-OH這一特殊氨基酸衍生物為起始原料，不但價(jià)格相當(dāng)昂貴，而且由于側(cè)鏈基團(tuán)未保護(hù)，在有機(jī)溶劑中溶解性差，導(dǎo)致副產(chǎn)物增加，合成效率降低。此外，規(guī)模較小，僅局限在IL左右的反應(yīng)體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能大規(guī)模制備依替巴肽的液相合成方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下一種依替巴肽的液相合成方法，包括合成三肽，合成四肽，合成七肽，環(huán)化，脫除保護(hù)基和胍基化六個(gè)階段。具體步驟如下I)合成三肽將H-Cys (Trt) -NH2與Fmoc-Pro-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到二肽Fmoc-PiO-Cys (Trt) -NH2 ;然后脫除所述Fmoc-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc 保護(hù)基，得到 H-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再將得到的所述H-Pro-Cys (Trt)-NH2與Fmoc-Trp-OH進(jìn)行偶合反應(yīng),然后再依次進(jìn)行洗漆、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到三肽Fmoc-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ；2)合成四肽將Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2 中的 Fmoc 保護(hù)基脫除，得到H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;然后將所述 H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 與 Fmoc-Asp (OtBu) -OH 進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到四肽FmOC-Asp(0tBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再將所述 Fmoc-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc保護(hù)基脫除，得到四肽 H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ；3)合成七肽首先制備三肽Mpa (Trt)-Lys (Boc)-Gly-OH
將H-Gly-OMe與Cbz-Lys (Boc) -OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到二肽Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe ;然后將所述Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe 中的 Cbz 保護(hù)基脫除，得到 H-Lys(Boc)-Gly-OMe ;再將所述H-Lys (Boc) -Gly-OMe與Mpa (Trt) -OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OMe ;再將所述三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OMe用NaOH溶液水解，然后再依次用水和乙醚浸洗，得到三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OH,其中所述水和乙醚質(zhì)量比為3:1 ；其次將四肽H-Asp (OtBu)-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2 與三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OH進(jìn)行偶合反應(yīng),然后再依次進(jìn)行洗漆、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到線性七肽 Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ；4)環(huán)化
Mpa-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-NH2將線性七肽環(huán)化得到環(huán)肽丨^I
權(quán)利要求
1.一種依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將H-Cys(Trt) -NH2與Fmoc-Pro-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到二肽Fmoc-PiO-Cys (Trt) -NH2 ;然后脫除所述Fmoc-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc 保護(hù)基，得到 H-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再將得到的所述H-Pro-Cys (Trt)-NH2與Fmoc-Trp-OH進(jìn)行偶合反應(yīng),然后再依次進(jìn)行洗漆、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到三肽Fmoc-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ； 2)將步驟I)中得到的Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt) -NH2中的Fmoc保護(hù)基脫除，得到H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;然后將所述 H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 與 Fmoc-Asp (OtBu) -OH 進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到四肽FmOC-Asp(0tBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再將所述 Fmoc-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc保護(hù)基脫除，得到四肽 H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2,備用； 3)將H-Gly-OMe與Cbz-Lys(Boc) -OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到二肽Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe ;然后將所述Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe 中的 Cbz 保護(hù)基脫除，得到 H-Lys(Boc)-Gly-OMe ;再將所述H-Lys (Boc) -Gly-OMe與Mpa (Trt) -OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OMe ;再將所述三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OMe用NaOH溶液水解，然后再依次用水和乙醚浸洗，得到三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OH,其中所述水和乙醚質(zhì)量比為3:1 ； 4)將步驟2)中得到的四肽H-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2與步驟3)中得到的三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗漆、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到線性七肽 Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2;5)將步驟4)得到的線性七肽 Mpa(Trt) -Lys (Boc) -Gly-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2環(huán)化得到環(huán)肽 6)將步驟5)得到的
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟I)中，所述H-Cys (Trt) -NH2與Fmoc-Pro-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為在偶和試劑為DIC和HOCt，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O 35°C的條件下反應(yīng)，其中，所述H-Cys (Trt)-NH2、Fmoc-Pro-OH及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為I : I : 1.2; 所述脫除Fm0c-Pr0-Cys(Trt)-NH2中的Fmoc保護(hù)基的工藝條件為在試劑為Et2NH和DCM,反應(yīng)溫度為O 35°C的條件下，反應(yīng)6小時(shí)； 所述H-Pro -Cys (Trt)-NH2與Fmoc-Trp-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為在偶和試劑為DIC和HOCt，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O 35°C的條件下反應(yīng)，其中，所述H-Pro-Cys (Trt)-NH2、Fmoc-Trp-OH及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為I : I : I. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟2)中，所述脫除Fmoc-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2中的Fmoc保護(hù)基的工藝條件為在試劑為Et2NH和DCM，反應(yīng)溫度為O 35°C的條件下，反應(yīng)6小時(shí)； 所述H-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2與Fmoc-Asp (OtBu)-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為在偶和試劑為DIC和HOCt，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O 35°C的條件下反應(yīng)，其中，所述H-Pro-Cys (Trt) -NH2> Fmoc-Asp (OtBu) -OH 及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為 1:1:1.2 ； 所述脫除Fmoc-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2中的Fmoc保護(hù)基的工藝條件為在試劑為Et2NH和DCM，反應(yīng)溫度為O 35°C的條件下，反應(yīng)6小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟3)中，所述H-Gly-OMe與Cbz-Lys (Boc) -OH進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為在偶和試劑為DIC和HOCt，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O 35°C的條件下反應(yīng)，其中，所述H-Gly-OMe、Cbz-Lys (Boc)-OH及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為I: I: I. 2 ; 所述脫除Cbz-Lys(B0c)-Gly-OMe中的Cbz保護(hù)基的具體步驟為以Pd-C為催化劑，MeOH為溶劑，反應(yīng)溫度為0-35°C的條件下，通入H2進(jìn)行催化氫化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間12小時(shí)；其中，所述Pd-C催化劑的重量為所述Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe的10_20%，所述Pd-C催化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% ； 所述H-Lys (Boc) -Gly-OMe與Mpa (Trt) -OH進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為在偶和試劑為DIC和HOCt，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O 35 °C的條件下反應(yīng)，其中，所述H-Lys(Boc)-Gly-OMe、Mpa(Trt)-OH 及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為 1:1:1.2 ； 所述三肽Mpa (Trt)-Lys (Boc)-Gly-OMe用NaOH溶液水解的工藝條件為溶劑為Imol/L的NaOH溶液，反應(yīng)溫度為O 35°C ;反應(yīng)時(shí)間為I. 5小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟4)中，所述H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 與 Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OH 進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為在偶和試劑為DIC和HOCt，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O 35°C的條件下，反應(yīng)時(shí)間4 小時(shí)；其中，所述 H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) _NH2、Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OH 及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為I: I: I. 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟5)中，所述環(huán)化的具體步驟為將所述 Mpa (Trt)-Lys (Boc)-Gly-Asp (OtBu)-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2 與 I2的DCM溶液，在溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O 35°C的條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間4小時(shí)，得到反應(yīng)液，反應(yīng)液分別用Na2S2O3溶液和飽和NaCl溶液萃取,再用無(wú)水Na2SO4干燥，然后加乙 醚析出粗產(chǎn)物，再用DCM和MeOH重結(jié)晶，得到環(huán)肽
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟6)中，將所 Mpa-Lys(Boc)-GIy-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-NH2述
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟7)中，將環(huán)七 Mpa-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2肽鹽酸鹽I
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，所述三氧化硫脲的制作步驟為將濃硫酸、雙氧水及二氧化硫脲進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為4°C，反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)，水沉淀出所述三氧化硫脲；其中，所述濃硫酸、雙氧水及二氧化硫脲的摩爾比為O.05:1:0. 8。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9任一項(xiàng)所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟I)至步驟4)中，所述洗滌步驟均為用NaHCO3溶液、鹽酸溶液及飽和NaCl溶液依次進(jìn)行洗滌；所述干燥劑均為無(wú)水Na2SO4干燥劑；所述減壓溫度均為30 40°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種依替巴肽的液相合成方法，包括合成三肽，合成四肽，合成七肽，環(huán)化，脫除保護(hù)基和胍基化六個(gè)階段。本發(fā)明液相合成依替巴肽的方法，解決了形成分子內(nèi)二硫鍵合成環(huán)肽過(guò)程中導(dǎo)致副產(chǎn)物生成的問(wèn)題，確立了脫除環(huán)肽側(cè)鏈保護(hù)基的相關(guān)條件，建立了將環(huán)肽氨基轉(zhuǎn)化為胍基的條件及方法，提高了收率；該方法的原料試劑均價(jià)廉易得，能有效降低產(chǎn)品成本，顯著提高生產(chǎn)效益。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102924569SQ20121033964
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者高秀偉, 高秀巖, 任孝敏, 王樸 申請(qǐng)人:煙臺(tái)海安多肽藥物研發(fā)技術(shù)有限公司