本發(fā)明涉及一株鼠抗豬pd-1單克隆抗體及其應用，屬于抗體工程技術領域。

背景技術：

程序性死亡因子-1(programmeddeath-1，pd-1)屬于b7家族成員，它是50kda～55kda左右的i型跨膜蛋白分子，誘導性表達于活化的t細胞、b細胞、nk細胞、nkt細胞、單核細胞和樹突狀細胞?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，pd-1有pd-l1和pd-l2兩個配體。pd-l1廣泛表達于t細胞、b細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞以及多種腫瘤細胞。pd-l2則誘導性表達于樹突狀細胞、巨噬細胞、髓源性肥大細胞和生發(fā)中心b細胞。pd-1/pd-l是一對重要的負性協(xié)同刺激分子，pd-1所介導的負性協(xié)同刺激信號能導致t細胞的凋亡和功能耗竭，在t細胞成熟過程的陰性和陽性選擇中發(fā)揮重要作用。近年來研究表明，pd-1/pd-l抑制途徑在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展以及慢性病毒感染中均發(fā)揮了重要作用。采用阻斷型抗體干預pd-1/pd-l信號可有效提高機體抗慢性病毒感染免疫力；相反，可通過增強pd-1負性信號來緩解自身免疫反應和抑制器官移植排斥反應。因此，制備鼠抗豬pd-1單克隆抗體具有重要的理論研究和實際應用價值。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一株鼠抗豬pd-1單克隆抗體及其應用，該單克隆抗體能夠和豬pd-1蛋白特異性結合。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：

一株鼠抗豬pd-1單克隆抗體，所述的單克隆抗體由保藏編號為cctccno：c2016196的雜交瘤細胞株2b5分泌，所述的雜交瘤細胞株2b5保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏日期為2016年11月30日。

所述的單克隆抗體為lgg1類免疫球蛋白。

一種所述的鼠抗豬pd-1單克隆抗體在制備檢測豬pd-1蛋白試劑中的應用。

所述的單克隆抗體在制備豬pd-1蛋白診斷試劑或輔助診斷試劑中的應用。

所述的診斷試劑包括免疫組織化學檢測試劑或血清免疫檢測試劑。

所述的血清免疫檢測試劑為酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑。

一種包含所述的單克隆抗體的藥物組合物。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明以誘導表達純化后的豬pd-1胞外區(qū)蛋白為免疫原，有效地激發(fā)小鼠機體對靶分子的特異性免疫應答。運用elisa方法對雜交瘤進行篩選，篩選出的上清液為陽性的生長孔內常會有兩個以上的雜交瘤細胞集落，有的集落可能不分泌抗體，或分泌的不是所需抗體，因此，要利用克隆培養(yǎng)方法及時將其分開。最常用的雜交瘤克隆培養(yǎng)法是有限稀釋法和軟瓊脂培養(yǎng)法。本發(fā)明中，采用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆培養(yǎng)，最終獲得1株可穩(wěn)定分泌鼠抗豬pd-1的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其單抗為igg1類免疫球蛋白，非其他亞型；且該株單抗具有良好的效價。通過elisa試驗鑒定，結果呈陽性反應，初步證明該株單抗是抗pd-1胞外區(qū)蛋白的，再用交叉試驗證明該株單抗與pet32a載體蛋白和無關蛋白無交叉反應，進一步證明所篩出的雜交瘤是特異的，用western-blot鑒定陽性雜交瘤分泌單克隆抗體與重組蛋白發(fā)生特異性反應，最后用流式細胞術檢測證實雜交瘤分泌單克隆抗體可以與外周血單核細胞(pbmc)上pd-1蛋白有效結合。

本發(fā)明成功研制了特異性鼠抗豬pd-1單克隆抗體，并對mab的免疫學特性進行初步分析。該mab的獲得為進一步從蛋白水平檢測疾病狀態(tài)下pd-1分子的表達變化奠定了基礎。

附圖說明

圖1為western-blot試驗鑒定單克隆抗體的特異性結果，圖中，m：marker；1：pd-1蛋白；2：rosetta上清；3：pet-32a(+)空載體蛋白。

圖2為流式細胞術檢測單抗與豬pbmc上pd-1蛋白的結合情況。

具體實施方式

以下結合具體實施例來進一步說明發(fā)明內容，沒有特殊說明的情況下，所采用的操作手段、驗證方法等都是本領域技術人員的常規(guī)技術手段，具體可參考《分子克隆實驗指南》及其它常規(guī)實驗方法。本發(fā)明只是突出了技術方案的創(chuàng)新點，故現(xiàn)有技術不在此做進一步的說明。

實驗材料

小鼠骨髓瘤細胞ns0由本實驗室凍存；6～8周齡balb/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，在本實驗室動物房飼養(yǎng)。1640培養(yǎng)基、hat和ht培養(yǎng)基購自美國gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和可溶性單組分tmb底物溶液購自美國sigma公司；聚乙二醇(peg)1500購自美國roche公司；hrp標記羊抗鼠igg購自美國invitrogen公司；tween-20購自廣州鼎國生物技術有限公司；鼠igg亞型鑒定試劑盒購自美國roche公司；細胞培養(yǎng)板、細胞凍存管購自上海微科生化試劑有限公司；其它試劑均為國產分析純試劑。

gnk溶液：稱取kcl0.4g、nacl8g、na2hpo4·12h2o3.56g、nah2po4·h2o0.69g、酚紅0.01g、葡萄糖2g，加雙蒸水(ddw)定容至1000ml，調節(jié)ph值至7.2，115℃高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例1鼠抗豬pd-1單抗的制備

1、免疫原的制備

根據(jù)genbank中豬pd-1的基因序列及原核表達載體多克隆酶切位點，設計其胞外區(qū)引物，以豬外周血單個核細胞(pbmc)的cdna為模板，應用pcr技術擴增pd-1胞外區(qū)片段，并與pmd18-t-simple載體連接，構建pmd-pd-1重組質粒，轉化至dh5α中通過菌液pcr篩選陽性克隆并測序，利用限制性內切酶ecori和xhoi分別對陽性重組質粒pmd-pd-1及原核表達載體pet-32a(+)進行雙酶切并回收，利用t4dna連接酶連接回收的酶切目的片段及載體片段，構建pet-32a-pd-1原核表達載體，連接產物轉化至dh5α中，經(jīng)鑒定正確后轉化至宿主菌rosetta(de3)進行誘導表達。應用sds-page分析重組蛋白的表達情況，western-blot鑒定重組蛋白的抗原特異性。然后采用鎳柱對重組目的蛋白進行分離純化，用純化的蛋白加入等體積的完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，在勻漿機上進行乳化，分別制成完全佐劑抗原和不完全佐劑抗原。其中，涉及的具體步驟有：

1.1含有pet-32a-pd-1原核表達載體的宿主菌rosetta(de3)的誘導表達

將含有重組表達質粒pet-32a-pd-1的菌種rosetta(de3)于含amp(100μg/ml)lb液體培養(yǎng)基中，37℃過夜擴大培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)菌按體積比1:100接種于新鮮的相應的2×yt培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)至od600值為0.5，加入iptg至終濃度為0.5mmol/l，以誘導目的蛋白的表達，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，將誘導的產物5000rpm、4℃離心10min后，收集菌體，按體積比1:20加pbs重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度為100μg/ml，30℃水浴30min；超聲破碎15min，8000rpm、4℃離心20min后收集沉淀，用適量2m尿素洗滌液重懸放冰上10min，8000rpm、4℃離心20min，重復洗4-5次，最后用8m尿素溶解包涵體，8000rpm、4℃離心20min，收集上清置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表達產物的sds-page分析：12％分離膠(質量分數(shù))，約15.0ml，各組分見表1。將各組分混合均勻后，將分離膠溶液立即加入已安裝好的玻璃制膠平板中，至距離玻璃板頂端約1.5cm，然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋約1.0cm的水層，以防止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。室溫靜置約30min，待凝膠聚合完全后，倒掉覆蓋的水層，用水沖洗凝膠上部幾次后用濾紙盡可能吸干凝膠頂端的水。

表112％分離膠的配制

配制5％濃縮膠(質量分數(shù))，約6.1ml，各組分見表2。將各組分混合均勻后，將濃縮膠溶液立即加入至玻璃板內，液面與玻板上沿齊平，立即將梳子輕輕插入玻板之間，盡可能避免產生氣泡。約30min濃縮膠聚合完全后，小心拔出梳子。加入適量1×tris-gly電泳緩沖液，上樣前用電泳緩沖液沖洗梳子孔，小心加入處理后的樣品。濃縮膠階段電壓為80v，待溴酚藍進入分離膠時升電壓至120v，直至溴酚藍前沿遷移至凝膠底部。電泳完畢后，小心剝離凝膠，加入適量的考馬斯亮藍r-250染色液緩慢振搖染色2h，取出凝膠在水中漂洗數(shù)次，再用考馬斯亮藍脫色液脫色3h，其間需更換脫色3次。待蛋白條帶清晰后，觀察結果，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存。結果顯示，表達產物的相對分子質量為33kda，與預期重組蛋白的相對分子質量一致。

表25％濃縮膠的配制

表達產物的western-blot分析：目的蛋白經(jīng)sds-page電泳后，切下需要轉膜的部分。分別將凝膠、海綿墊和pvdf膜(在甲醇浸泡1～2min)預先在電轉移緩沖液中平衡30～60min。然后按照從上到下依次為海綿墊、凝膠、pvdf膜、海綿墊的順序依次放好，特別是在把凝膠放到pvdf膜上時要盡量避免氣泡的產生，最后用手輕輕壓緊排除各層之間的氣泡，以消除氣泡的產生。放好半干轉移器上蓋，連接至電泳儀，正負極依次接好，在25v條件下轉膜30～45min。將電轉移結束后的凝膠放入考馬斯亮藍r-250染色液中染色，以檢查轉移效果。

轉移完畢后取下pvdf膜，進行如下操作：

封閉：將pvdf膜放入大小適當?shù)牟Ａ矫笾?，并做好標記，然后用tbst洗滌，用質量分數(shù)5％脫脂奶粉-tbst室溫封閉過夜；

洗膜i：棄去封閉液，用tbst慢搖洗膜三次，每次5min～10min；

加一抗：將6×his單克隆抗體(工作濃度2μg/ml)和羊抗人pd-1單克隆抗體(工作濃度0.4μg/ml)分別用1％脫脂奶粉-tbst稀釋后加入，37℃慢搖2h；

洗膜ⅱ：棄去一抗，用tbst慢搖洗膜三次，每次5min～10min；

加二抗：將辣根過氧化物酶標記羊抗鼠(二抗)用1％脫脂奶粉-tbst稀釋(1:1000)后加入，37℃緩慢振搖60min；

洗膜ⅲ：棄去二抗，用tbst緩慢振搖洗膜三次，每次5min～10min；

顯色：參照aec顯色試劑盒中的說明書配制顯色液，將pvdf膜置于顯色液中，待出現(xiàn)特異性反應條帶后，立即用雙蒸水沖洗以終止反應，拍照記錄結果。

western-blot結果顯示，該重組蛋白能與6×his單克隆抗體和羊抗人pd-1抗體所識別，證明pd-1胞外區(qū)基因片段在原核表達系統(tǒng)中獲得正確表達，且具有良好的反應原性。

1.2pet-32a-pd-1重組目的蛋白的純化

依照proteinpure-ni-ntaresin親和柱的操作手冊，進行蛋白純化，具體步驟如下：

平衡：用5～10倍體積的平衡緩沖液平衡層析柱。對于結合能力強的his標簽重組蛋白或提高其特異性結合，平衡液中可加入低濃度咪唑(10mm～20mm)。

上樣：樣品緩沖液應盡可能與平衡緩沖液一致。為了避免堵塞層析柱樣品已提前過濾或離心。

洗滌：用5～10倍柱體積的平衡緩沖液洗滌層析柱，收集流出液。

洗脫：可采不同濃度的咪唑洗脫目的蛋白。

然后對收集洗脫的目的蛋白進行sds-page鑒定后，使用梯度透析法對鑒定的純化蛋白進行濃縮和脫鹽，具體步驟為：于處理好的透析袋中加入適當?shù)暮康牡鞍椎南疵撘?，用夾子夾好后依次放入8mol/l、6mol/l、4mol/l、2mol/l、1mol/l、0.5mol/l的尿素溶液中，每個梯度4℃透析3h，最后透析到pbs溶液中。經(jīng)硅膠適當濃縮后，收集重組目的蛋白溶液并測量目的蛋白的濃度。

2、動物免疫

選擇3只6周齡左右的雌性balb/c小鼠，采用頸背部皮下多點注射法進行免疫，50μg/只，每只200μl的劑量。用弗氏完全佐劑乳化的抗原進行首次免疫，皮下多點注射；然后用弗氏不完全佐劑乳化的抗原分別進行二次免疫和三次免疫，每次間隔14d，三次免疫10天后，用間接elisa測抗體效價，當抗體效價達到1:1600后即可進行融合，細胞融合前3～5d進行加強免疫，尾靜脈或腹腔注射25μg不加佐劑的抗原。

結果顯示，首次免疫后3只balb/c鼠的血清抗體效價分別為3.2×10³、3.2×10³和6.4×10³；三次免疫后效價分別為2.56×10⁴、2.56×10⁴和5.12×10⁴(見表3)。

表3免疫balb/c鼠的血清效價

3、ns0骨髓瘤細胞的復蘇與培養(yǎng)

在融合前一周，復蘇骨髓瘤細胞ns0，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日換液。融合當天，用吸管輕輕吹取處于對數(shù)生長期的ns0細胞，收集至離心管中，1000r/min離心10min，棄去上清液，用gnk溶液洗滌一次后將細胞重新懸浮，細胞計數(shù)，調整細胞密度為10⁶個/ml，放培養(yǎng)箱中備用。

4、飼養(yǎng)細胞的制備

融合前1d制備飼養(yǎng)細胞。取昆明鼠1只致死，75％酒精消毒體表，無菌手術剪刀打開小鼠的腹部皮膚，暴露腹膜。然后用5ml注射器將5ml預冷的hat培養(yǎng)基打入小鼠腹腔，輕輕壓擠腹部，重新吸出注入的液體，收取小鼠腹腔巨噬細胞。用hat培養(yǎng)基稀釋至40ml，100μl/孔添加到4塊96孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5、細胞融合

在40℃水浴中預熱gnk溶液、50％(質量分數(shù))peg溶液；用于融合的小鼠采血并分離血清，然后致死浸泡到酒精中；收集ns0細胞于50ml離心管中，1000r/min離心10min，棄上清，用gnk溶液洗一次；依次剪開小鼠皮膚、腹膜，暴露腹腔，取脾臟放置于尼龍紗布上研碎，并用gnk溶液洗下去，收集脾細胞于50ml離心管中，1000r/min離心10min，棄上清；將脾細胞與ns0骨髓瘤細胞混合于50ml離心管中(脾細胞數(shù)約為2.6×10⁸個，所用ns0細胞大約是3瓶80％的10mlns0細胞，脾細胞：ns0細胞個數(shù)約為10:1)，加gnk溶液至40ml，1000r/min離心10min，棄上清，打散細胞團；將此融合管移入40℃水浴中，用1ml吸管將預熱的50％peg(ph8.0)滴加到融合管中，邊加邊輕輕搖動融合管，1min內加完，并繼續(xù)在水浴中緩緩搖動融合管1.5min。立即緩慢滴加40℃預熱的gnk溶液15ml。加入步驟為：1ml/30s，3ml/30s，11ml/30s。然后慢慢補加gnk溶液至40ml，37℃水浴靜置5min，1000r/min離心10min，棄上清。打散細胞團，加40mlhat培養(yǎng)基吹打混勻，加到含飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔100μl，置37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6、融合細胞的培養(yǎng)

融合后的細胞置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日檢查有無污染，如發(fā)現(xiàn)污染立即滴加1％的naoh。一般3～4d可見小克隆；7d時于出現(xiàn)克隆的孔內半量換液；10d左右可以吸取少量上清用于篩選，并補加等量的hat培養(yǎng)基；14d左右對所篩選的陽性孔可半量更換ht培養(yǎng)基，同時對篩選陽性孔的細胞轉至24孔培養(yǎng)板中擴大培養(yǎng)，準備克隆化，在篩選過程中將hat培養(yǎng)基逐漸更換為1640完全培養(yǎng)基。

7、陽性雜交瘤細胞的篩選

用5μg/ml純化重組pd-1胞外區(qū)蛋白包板，50μl/孔，通過間接elisa對融合的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液進行初次篩選，對篩選的強陽性克隆孔進行第二次特異性篩選，用載體蛋白、正常大腸桿菌上清以及其它無關蛋白進行包板檢測，其檢測方法與第一次相同，同時設立對照組，對篩選的特異性較強的陽性孔轉至24孔培養(yǎng)板中擴大培養(yǎng)，準備克隆化。

具體篩選步驟如下：用5μg/ml的蛋白包被，50μl/孔，4℃包被過夜，次日用pbst洗板，然后用5％脫脂牛奶(pbst溶解)于37℃封閉2h，棄上清，用封閉液1:1稀釋待檢測克隆孔上清(一抗)，每孔50μl為宜。同時做陽性、陰性對照、空白對照和無克隆孔上清對照，37℃孵育30min，棄上清，pbst洗滌5次，加二抗，二抗1:1000倍稀釋，50μl/孔，37℃孵育30min，棄上清，用pbst洗5次，然后加入tmb顯色劑，顯色5～10min，測od450值。

8、陽性雜交瘤細胞的克隆

當陽性克隆的細胞孔長至80％時進行有限稀釋，有限稀釋前一天制備飼養(yǎng)細胞。取出少許細胞懸液進行計數(shù)，采用有限稀釋法對陽性孔的細胞進行克隆化。其步驟如下：

用10μl臺盼藍和10μl細胞懸液于pcr管中等比例混合后，在顯微鏡下進行活細胞計數(shù)，公式：細胞數(shù)/ml＝n/4×10³×10×稀釋倍數(shù)(n為顯微鏡下四角4個大方格的活細胞總數(shù))，計算每毫升細胞懸液所含的活細胞數(shù)，然后取適量的細胞懸液，用1640培養(yǎng)基稀釋到10ml，并且要含有2×10³個活細胞(稀釋度i)，用稀釋度i的細胞懸液鋪板半塊96孔板，100μl/孔，20個細胞/孔；取1ml稀釋度i的細胞懸液加9ml1640完全培養(yǎng)基(稀釋度ⅱ)，用稀釋度ⅱ的細胞懸液鋪板另半塊96孔板，100μl/孔，2個細胞/孔；取3ml稀釋度ⅱ的細胞懸液加7ml1640完全培養(yǎng)基(稀釋度ⅲ)，用稀釋度ⅲ的細胞懸液鋪一塊96孔板，100μl/孔，0.6個細胞/孔；將上述培養(yǎng)板置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后，對單克隆孔進行標記并半量換液，當單克隆長至孔底的1/10時，進行效價檢測和特異性檢測，篩選出特異性較高和陽性較強的細胞進行重復克隆；同時每次將克隆剩余細胞轉入24孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)(并在原孔中補加另一批培養(yǎng)基，以防二者同時污染或細胞死亡)，繼而轉入6孔板或細胞中進行擴大培養(yǎng)，并及時凍存；經(jīng)過多次克隆操作，直至所有克隆的細胞孔檢測陽性率為100％時，即可確定已獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株后，及時進行擴大培養(yǎng)并凍存。

9、腹水的制備、純化

將8～12周齡雌性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml液體石蠟致敏。7d后腹腔注射雜交瘤細胞，細胞注射量為5×10⁶個/只，接種細胞后每天觀察小鼠腹部，待小鼠腹部明顯膨大，用無菌注射器吸出腹水，3000r/min離心20min，取上清分裝、標記，－20℃保存?zhèn)溆?。應用igg類單克隆抗體純化試劑盒提取純化單抗，按照北京百奧萊博科技有限公司提供的該純化試劑盒使用說明書步驟操作。

實施例2鼠抗豬pd-1單抗特異性鑒定

1、間接elisa鑒定單克隆抗體的特異性

經(jīng)3次亞克隆，獲得1株分泌特異性單抗的雜交瘤細胞，雜交瘤細胞株命名為2b5。分別用獲得的豬pd-1蛋白、雞pd-1蛋白、rosetta(de3)上清與pet-32a(+)空載體蛋白(包被濃度均為5μg/ml)包被酶標板，50μl/孔。加入待檢單抗上清，50μl/孔(1:200稀釋)，37℃孵育30min，pbst洗板3次。加入1∶1000倍稀釋的hrp標記的山羊抗鼠igg二抗50μl，置于37℃溫箱孵育30min，pbst洗滌3次，加入50μltmb顯色液，作用5-10min，用2mol/lh2so4終止反應，讀取各檢測孔od450數(shù)值，各孔od450值以p/n＞2.1為陽性判定標準(結果見表4)。結果表明，該株單抗能與重組豬pd-1蛋白反應而不與pet32a(+)空載體蛋白和無關蛋白反應，具有良好的特異性

表4單抗特異性鑒定結果

2、western-blot試驗鑒定單克隆抗體的特異性

重組pd-1胞外區(qū)目的蛋白經(jīng)sds-page電泳后，切下需要轉膜的部分。分別將凝膠、海綿墊和pvdf膜(在甲醇浸泡1～2min)預先在電轉移緩沖液中平衡30～60min。然后按照從上到下依次為海綿墊、凝膠、pvdf膜、海綿墊的順序依次放好，特別是在把凝膠放到pvdf膜上時要盡量避免氣泡的產生，最后用手輕輕壓緊排除各層之間的氣泡，以消除氣泡的產生。放好半干轉移器上蓋，連接至電泳儀，正負極依次接好，在25v條件下轉膜30～45min。當電轉移結束后的凝膠放入考馬斯亮藍r-250染色液中染色，以檢查轉移效果。

轉移完畢后取下pvdf膜，將pvdf膜用tbst洗滌，用5％脫脂奶粉-tbst室溫封閉過夜；棄去封閉液，用tbst慢搖洗膜三次，每次5～10min；加入一抗：將雜交瘤細胞2b5培養(yǎng)上清用1％脫脂奶粉-tbst稀釋(1∶100)后將pvdf膜覆蓋，37℃慢搖2h；棄去一抗，pbst慢搖洗膜3次，每次5-10min；加入hrp標記的山羊抗鼠igg二抗(1∶1000稀釋)，37℃緩慢振搖1h；棄二抗，用tbst緩慢振搖洗膜三次，每次5min～10min；按照aec顯色試劑盒的說明書配制顯色液，將pvdf膜置于顯色液中，待出現(xiàn)特異性反應條帶后，立即用雙蒸水沖洗以終止反應，拍照記錄結果。同時設置rosetta上清和pet-32a(+)空載體蛋白對照組(結果見圖1)。結果表明，該株單抗與豬pd-1蛋白發(fā)生特異性反應，并出現(xiàn)特異條帶，但不與對照組rosetta上清與pet-32a(+)空載體蛋白反應，無條帶出現(xiàn)。

實施例3鼠抗豬pd-1單抗生物學特性鑒定

1、單克隆抗體效價的檢測

將收集的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清按1:1、1:2¹、1:2²、1:2³、1:2⁴、1:2⁵、1:2⁶、1:2⁷、1:2⁸、1:2⁹、1:2¹⁰、1:2¹¹、1:2¹²、1:2¹³稀釋，雜交瘤細胞注射小鼠腹腔后取得的腹水按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400、1∶204800稀釋后，將重組pd-1胞外區(qū)蛋白包板，通過間接elisa法測定其od450值，分檢測雜交瘤細胞上清及腹水效價。用免疫前小鼠血清做平行陰性對照試驗，以與重組pd-1胞外區(qū)蛋白靶抗原發(fā)生反應的單克隆抗體的最大稀釋度即為其效價，各孔od450值以p/n≥2.1為陽性。結果表明，細胞上清的效價為1：2¹²；腹水的效價為1：2.048×10⁵。

2、單克隆抗體亞型鑒定

采用ig亞類鑒定試劑盒法鑒定上述單克隆抗體的ig亞類，操作步驟嚴格按說明書進行。結果表明雜交瘤細胞株2b5分泌的單抗為igg1類免疫球蛋白，非其他亞型。

3、雜交瘤細胞株分泌單抗的穩(wěn)定性鑒定

收集體外連續(xù)傳代的雜交瘤細胞株上清，用間接elisa法測定其效價，凍存細胞，間隔1個月后復蘇凍存的細胞，檢測其培養(yǎng)上清液中的抗體效價，連續(xù)檢測3個月，以此評價該分泌抗體的穩(wěn)定性。結果表明，克隆純化的雜交瘤細胞于液氮凍存3個月后復蘇，經(jīng)多次傳代仍能夠穩(wěn)定分泌高效價抗體，抗體效價可達1∶2¹²。

4、單克隆抗體的流式細胞術檢測

參照外周血淋巴細胞分離液的說明書分離豬外周血淋巴細胞，具體步驟如下：

(1)從豬前腔靜脈采集抗凝血5ml(抗凝劑為10％檸檬酸鈉，全血與抗凝劑比例為10:1)，抗凝血與等量pbs輕輕混勻；

(2)取4ml淋巴細胞分離液于12ml玻璃離心管中，將上述混勻血6ml沿管壁慢慢加入離心管中(注：動作要輕，不能混勻)，水平離心，2000rpm，室溫離心20min；

(3)用毛細管吸取血漿層與分離液之間的白色細胞薄層，移入新的12ml玻璃離心管中，加入2～5倍體積pbs，輕輕懸浮細胞，1000rpm，室溫離心10min，棄上清，加入10mlpbs，輕輕懸浮細胞，重復離心一次，棄上清；

(4)觀察白細胞中紅細胞量，適當加入1～2ml紅細胞裂解液，冰上裂解紅細胞5min，加入10mlpbs，1000rpm，室溫離心10min，棄上清，加入0.5mlpbs懸浮細胞，使其分散為單個細胞懸液，細胞計數(shù)后備用。

取1×10⁶個pbmcs加入終濃度為10μg/ml的抗pd-1的單克隆抗體中，反應體系為100μl，鼠igg1為同型抗體對照，37℃作用1h，用pbs洗滌3次，加入fitc標記的羊抗鼠igg(1:500倍稀釋)，37℃作用1h，用pbs洗滌3次，用1mlpbs懸浮細胞，流式細胞術檢測(結果見圖2)。圖2結果顯示，單克隆抗體的熒光強度比同型抗體對照的熒光強度明顯增強，說明制備的單抗可以很好的結合pbmc上的pd-1蛋白。