本發(fā)明涉及特異性植物病原菌PCR檢測方法，具體涉及一種西瓜果斑病菌（Acidovorax citrulli）巢式PCR檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術：

瓜類細菌性果斑病(Bacterial fruit blotch, BFB)是西甜瓜等葫蘆科作物上重要的細菌病害。瓜類細菌性果斑病是一種典型的種傳病害，由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)引起。該病能侵染葉片、果實和種子，嚴重影響果實的品質和產量，對瓜類生產及相關產業(yè)構成了極大的威脅。我國自上世紀90年代首次報道后，現已在新疆、寧夏、河北、內蒙古、北京、福建、海南、山東、吉林、湖南等地大量發(fā)生。瓜類細菌性果斑病造成大田西瓜和甜瓜減產甚至絕收，給西甜瓜生產帶來巨大損失，該病害目前的發(fā)生已呈上升趨勢。因此建立西瓜噬酸菌的快速、準確的檢測技術是防止該病害發(fā)生的重要舉措。

傳統的病原菌檢測技術是在分離和進行進一步的培養(yǎng)從而獲得相應病原物的基礎上，通過形態(tài)學觀察和科赫氏法則來判斷病原物的種類。但是，分離，培養(yǎng)全部過程往往都非常消耗時間以及需要大量的勞動力資源。免疫血清學鑒定方法雖然敏感，特異性強，但制備過程耗時耗力。近幾年，以PCR技術為代表的分子檢測方法得到了迅速的發(fā)展和應用，PCR快速分子檢測方法普遍具有精度高，快速，有效的特點，而且PCR技術相對特異，敏感。而套式PCR檢測方法擁有比傳統過往PCR分子檢測方法更準確的靈敏度以及更強的特異性。因此，建立西瓜果斑病菌快速分子檢測體系，可以在西瓜發(fā)病前或者發(fā)病早期對發(fā)病植株進行快速準確檢測，對西瓜果斑病害的及時預報，以及控制其產生的病害，保護我國瓜類產業(yè)具有重大的意義。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種西瓜果斑病菌巢式PCR檢測方法，其具有特異性強、靈敏度高的特點，可用于田間西瓜果斑病的早期診斷。該技術對于西瓜果斑病菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測和及時防治具有十分重要的意義。

本發(fā)明的目的可通過以下技術方案來實現：

西瓜果斑病菌巢式PCR檢測方法，包括以下步驟：

步驟A、基因組DNA提?。翰捎肅TAB法提取西瓜果斑病菌基因組DNA或發(fā)病植物組織DNA；

步驟B、第一輪PCR擴增：以步驟A得到的DNA樣品為模板，采用西瓜果斑病菌VapB-like抗毒素基因引物VapB -1F/ VapB -1R經過PCR擴增得到第一輪PCR產物。

引物序列：VapB-1F：5’-GGGCAATAGCTTGGCGGTTCG-3’；

VapB -1R：5’-CATTGGCCTCGTCCCGGTTGA-3’；

PCR反應體系25μl：基因組DNA 1μl，10×PCR反應緩沖液(含Mg²⁺) 2.5μl，各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，DNA Taq聚合酶0.5μl (5U/μl)，10 μmol/L的VapB-1F引物1μl，10 μmol/L的VapB-1R引物1μl，滅菌超純水補足至25μl；PCR擴增程序：94℃預變性4min， 94℃變性30sec，55℃退火30 sec，72℃延伸45sec，共30個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存；

步驟C、第二輪PCR擴增：以第一輪PCR擴增產物或者第一輪PCR擴增產物的稀釋液為模板，采用特異性引物VapB-2F/VapB-2R經過PCR擴增得到第二輪PCR擴增產物。

引物序列：VapB-2F：5’-GCGAACGTAGTCGAAGCGCTCG-3’；

VapB-2R：5’-TGGCCTCGTCCCGGTTGAACT-3’；

PCR反應體系25μl：第一輪PCR擴增產物或者第一輪PCR擴增產物的稀釋液1μl，10×PCR反應緩沖液(含Mg²⁺) 2.5μl，各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，DNA Taq聚合酶0.5μl (5U/μl)，10 μmol/L的VapB-2F引物1μl，10 μmol/L的VapB-2R引物1μl，滅菌超純水補足至25μl；

PCR擴增程序：94℃預變性4min， 94℃變性30sec，55℃退火30 sec，72℃延伸40sec，共30個循環(huán)；72℃延伸8min；4℃保存；

步驟D、PCR擴增產物檢測：取8 μl第二輪PCR擴增產物，采用1%瓊脂糖凝膠，在80 V 電壓下電泳30min，之后置于EB內染色20min后取出，于凝膠成像系統下觀察拍照，如果存在175bp的特異條帶，則確定所檢測的病菌為西瓜果斑病菌。

本發(fā)明具有以下技術優(yōu)勢和積極效果

1、靈敏度高：本發(fā)明檢測靈敏度為0.5 fg西瓜果斑病菌基因組DNA，較常規(guī)PCR靈敏度提高了1000倍。

2、特異性強：本發(fā)明針對性的檢測出西瓜果斑病菌，能從西瓜果斑病菌基因組中擴增出175bp的單一目的條帶，而燕麥食酸菌燕麥亞種、野油菜黃單胞菌錦葵致病變種、丁香假單胞菌、大黃歐文氏菌、方氏棒形桿菌、解淀粉歐文氏菌等30個參試菌株基因組DNA和西瓜植物組織DNA中均無擴增產物，受其他菌類干擾小，準確率高。

3、實用性好：本發(fā)明可用于西瓜果斑病潛伏期或者感病初期時的病害檢測。對病害的早期診斷和及時防治報具有十分重要的意義。

4、操作簡便快速：應用本發(fā)明方法，對帶西瓜果斑病菌的植物組織進行病菌DNA提取、PCR擴增和常規(guī)的瓊脂糖電泳后即可判定結果，無需對擴增產物進行限制性內切酶酶切。一般整個檢測過程可在8小時內完成。

附圖說明

圖1是西瓜果斑病菌VapB特異性引物的特異性驗證結果。其中，M：DL2000 DNA Marker，1為陽性對照，2-3是不同來源地的西瓜果斑病菌的DNA，6：燕麥食酸菌燕麥亞種，7：野油菜黃單胞菌錦葵致病變種，8：丁香假單胞菌，9：大黃歐文氏菌，10：方氏棒形桿菌，11：解淀粉歐文氏菌，12：陰性對照。

圖2是西瓜果斑病菌VapB靈敏性驗證結果。其中，M為DL2000 DNA Marker，1-9：5.0 ng/μL，5.0×10-1ng/μL，5.0×10-2ng/μL，5.0×10-3ng/μL，5.0×10-4ng/μL，5.0×10-5ng/μL，5.0×10-6ng/μL，5.0×10-7ng/μL，5.0×10-8ng/μL的不同濃度西瓜果斑病菌DNA。

圖3是發(fā)病組織VapB特異性檢測結果。其中，M為2000 DNA marker，1，8：健康植物組織，2：陽性對照，3-4：發(fā)病潛伏期植物組織，5-7，9：分別為發(fā)病植物組織。

具體實施方式

以下結合實施例具體闡述本發(fā)明。

實施例1西瓜果斑病菌的巢式PCR檢測

1. 樣品DNA提取

1.1 提取菌體DNA

將西瓜果斑病菌接種于LB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm過夜培養(yǎng)。用CTAB法提取細菌基因組DNA，具體操作如下：

1) 取1.5ml 培養(yǎng)物于2.0ml離心管中，12000rpm離心2min；

2) 棄上清液，加入567μl TE緩沖液重新懸浮菌體，加入30μl 10%SDS溶液和3μl 20mg/ml 的蛋白酶K，輕輕混勻，于37℃溫育1h；

3) 加入100μl 5mol/L NaCl溶液，充分混勻，再加入80ul CTAB/NaCl 溶液，混勻后65℃溫育10min；

4) 加入800μl的酚/氯仿/異戊醇溶液（三者體積比為25:24:1），混勻后12000rpm離心5min；

5) 取上清液轉入新的1.5ml離心管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，12000rpm離心15 min；

6) 棄上清液，加入1000μl 無水乙醇，混勻，12000 rpm 離心 5 min；

7) 棄上清液，在超凈工作臺上自然晾干，加入60 μl ddH₂O溶解DNA，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 提取待檢植物組織樣品DNA

1)稱取荔枝發(fā)病組織100mg，加入液氮研磨成粉末，轉入2.0ml離心管中；

2)加入1000μl CTAB/NaCl 溶液，于65℃水浴30min，每各10min混勻一次，12000rpm離心10min；

3)取上清液800μl于2.0ml離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液（三者體積比為25:24:1），混勻后12000rpm離心5min；

4)取上清液750μl于2.0ml離心管中，加入等體積的氯仿/異丙醇溶液（體積比為24:1），混勻，12000rpm離心5min；

5)取上清液500μl于2.0ml離心管中，加入50μl預冷的3mol/L NaAC溶液(PH=5.2)，混勻，加入50μl預冷的異丙醇，混勻，于－20℃放置30min；

6)4℃10000rpm離心5min，棄上清液，加入1000μl 預冷的75%無水乙醇洗滌沉淀2次，在用無水乙醇洗滌1次，在超凈工作臺上自然晾干，加入60 μl ddH₂O溶解DNA，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 第一輪PCR擴增

以提取的DNA樣品為模板，采用西瓜果斑病菌VapB-like抗毒素基因引物VapB -1F/ VapB -1R經過PCR擴增得到第一輪PCR產物。

引物序列：VapB-1F：5’-GGGCAATAGCTTGGCGGTTCG-3’

VapB -1R：5’-CATTGGCCTCGTCCCGGTTGA-3’

PCR反應體系25μl：基因組DNA 1μl，10×PCR反應緩沖液(含Mg²⁺) 2.5μl，各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，DNA Taq聚合酶0.5μl (5U/μl)，10 μmol/L的VapB-1F引物1μl，10 μmol/L的VapB-1R引物1μl，滅菌超純水補足至25μl；PCR擴增程序：94℃預變性4min， 94℃變性30sec，55℃退火30 sec，72℃延伸45sec，共30個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存；

2. 第二輪PCR擴增：以第一輪PCR擴增產物或者第一輪PCR擴增產物的稀釋液為模板，采用特異性引物VapB-2F/VapB-2R經過PCR擴增得到第二輪PCR擴增產物。

引物序列：VapB-1F：5’-GCGAACGTAGTCGAAGCGCTCG-3’

VapB-2R：5’-TGGCCTCGTCCCGGTTGAACT-3’

PCR反應體系25μl：第一輪PCR擴增產物或者第一輪PCR擴增產物的稀釋液1μl，10×PCR反應緩沖液(含Mg²⁺) 2.5μl，各2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，DNA Taq聚合酶0.5μl (5U/μl)，10 μmol/L的VapB-2F引物1μl，10 μmol/L的VapB-2R引物1μl，滅菌超純水補足至25μl；

PCR擴增程序：94℃預變性4min， 94℃變性30sec，55℃退火30 sec，72℃延伸40sec，共30個循環(huán)；72℃延伸8min；4℃保存；

4. PCR擴增產物檢測

取8 μl第二輪PCR擴增產物，采用1%瓊脂糖凝膠，在80 V 電壓下電泳30min，之后置于EB內染色20min后取出，于凝膠成像系統下觀察拍照，如果存在175bp的特異條帶，則確定所檢測的病菌為西瓜果斑病菌。

實施例2 巢式PCR靈敏度試驗

利用10倍稀釋的方法將提取的西瓜果斑病菌初始濃度為50 ng/μL的DNA，分別稀釋成5.0 ng/μL，5.0×10^-1ng/μL，5.0×10^-2ng/μL，5.0×10^-3ng/μL，5.0×10^-4ng/μL，5.0×10^-5ng/μL，5.0×10^-6ng/μL，5.0×10^-7ng/μL，5.0×10^-8ng/μL，5.0×10^-9ng/μL不同濃度進行套式PCR。分別取各濃度的DNA 1μl 作為模板，按實施例1的步驟，依次進行第一輪和第二輪兩輪PCR擴增。經兩輪PCR擴增所得產物的電泳結果見圖2。本發(fā)明巢式PCR檢測靈敏度是0.5 fg西瓜果斑病菌基因組DNA，較常規(guī)PCR靈敏度提高了100倍。

實施例3：發(fā)病組織中西瓜果斑病菌的檢測

1．樣品采集：植物組織樣品采自福建福州不同地區(qū)超市及農貿市場。

2．DNA提取及檢測

發(fā)病植物組織采用NaOH快速裂解法提取西瓜果斑病菌DNA。具體過程如下：(1)將西瓜組織洗凈、晾干，剪取發(fā)病部位；(2)按1mg病葉加入10μl（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）計量，將組織充分磨碎成糊，在12,000g離心機中離心5min；(3)取上清20μl與等體積的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合；(4)稀釋10倍、100倍、1000倍液，分別取1μl原液、 10倍、100倍、1000倍液作為PCR模板進行擴增。

按實施例1的步驟2和步驟3依次進行第一輪和第二輪兩輪PCR擴增。兩輪擴增后的產物電泳結果見圖3。其中，M為2000 DNA marker，1：健康植物組織，2：陽性對照，3-7：分別為發(fā)病植物組織，8-11：分別為發(fā)病潛伏期植物組織。由圖3可見，利用巢式PCR對35個樣品進行檢測時均擴增出175bp的目的條帶，健康組織和陰性對照均無擴增產物。這表明，本發(fā)明可用于西瓜果斑病潛伏期或者感病初期時的病害檢測。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農業(yè)科學院植物保護研究所

<120> 一種西瓜果斑病菌巢式PCR檢測方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggcaatagc ttggcggttc g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cattggcctc gtcccggttg a 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgaacgtag tcgaagcgct cg 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggcctcgtc ccggttgaac t 21