本發(fā)明涉及茶樹生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及快速鑒定不同白化茶樹品種的分子標(biāo)記組合、方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

白茶品種是一類在特定條件下產(chǎn)生的具有不同程度的葉綠素缺失的葉色突變體，屬于茶樹中的珍稀資源，目前在全國(guó)各地均有發(fā)現(xiàn)，如浙江的安吉白茶、景寧白茶、黃金芽；江西的黃金菊等。已有的研究表明，這類茶樹資源由于代謝機(jī)制的特異性，新稍芽葉的葉綠素合成減少，碳代謝受抑制，使其芽葉呈現(xiàn)出不同程度的白化現(xiàn)象，同時(shí)由于氮代謝增強(qiáng)，顯著提高了游離氨基酸的生成量，使得有些品種資源的游離氨基酸含量能達(dá)到6％以上，茶氨酸含量達(dá)3％以上。以這類白化突變體為原料制作的茶樣，因具有更高的氨基酸含量和更優(yōu)異的外形，使其經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高，已成為各地茶農(nóng)增收的重要途徑，很多新育成的白化茶樹品種苗木市場(chǎng)價(jià)格高達(dá)1-2元/株。但隨著新育成白化茶樹品種的增多，以及新品種較高的苗木和成品茶價(jià)格，很多不法商販開始利用茶葉和茶苗品種不易鑒定的特點(diǎn)，以老充新、以次充好。經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，很多茶農(nóng)經(jīng)常不確定其購(gòu)買的茶苗為哪一個(gè)品種，出現(xiàn)買到假苗或不合適苗的現(xiàn)象；也有很多茶葉加工企業(yè)不確定其加工出的成品茶是源自那一品種，從而無(wú)法為消費(fèi)者提供更加準(zhǔn)確的產(chǎn)品信息。而目前尚未有一種有效的手段可以將不同白化茶樹茶苗或成品茶的具體品種鑒定區(qū)分的方法。因此，如何能創(chuàng)設(shè)一種快速、有效的鑒定不同白化茶樹品種的分子標(biāo)記，成為急需改進(jìn)的目標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可以快速鑒定不同白化茶樹品種的分子標(biāo)記組合。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種快速鑒定不同白化茶樹品種的分子標(biāo)記組合，所述分子標(biāo)記組合采用CSR238、CSR1297、LG04-06三對(duì)引物組合；所述CSR238的引物序列為：正向引物：TGACCCTACAACAAGACC，反向引物：TTGCCAACAAGCACCAC；所述CSR1297的引物序列為：正向引物：CAAATGCATAATGTGGTCGC，反向引物：ATTTCCCTCCCTTTCATGCT；所述LG04-06的引物序列為：正向引物：ACAGACCTTCACCCTCTCCATTTC,反向引物：GTTTACCTCTGCCTTCGTTCTTCAGC。

進(jìn)一步地，所述白化茶樹品種包括：景寧白茶1號(hào)、MP1001、千年雪、郁金香、黃葉寶、花葉、安吉黃茶、黃金菊、安吉白茶、天臺(tái)白茶、四明雪芽、景寧白茶2號(hào)、越鄉(xiāng)白茶、中黃1號(hào)、黃金芽、中黃2號(hào)。

本發(fā)明還提供了一種利用上述分子標(biāo)記組合快速鑒定不同白化茶樹品種的方法。

進(jìn)一步地，具體包括如下步驟：

(1)對(duì)待測(cè)茶樣或茶樹苗木提取DNA；

(2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，以CSR238、CSR1297、LG04-06為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)對(duì)步驟(2)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，獲得待測(cè)樣品的分離帶型；

(4)對(duì)步驟(3)中的樣品進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)，對(duì)比判定，即可鑒定待測(cè)茶樹品種。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中采用待測(cè)茶樹品種的新鮮幼葉或是成品茶提取DNA。

進(jìn)一步地，所述步驟(4)具體為：對(duì)步驟(3)中的樣品進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)，將三對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果轉(zhuǎn)換成1和0字符串后與下表的指紋圖譜代碼進(jìn)行比對(duì)即可鑒定茶樹品種；下表的指紋圖譜代碼由利用所述三對(duì)引物擴(kuò)增16個(gè)白化茶樹品種得到的等位基因轉(zhuǎn)換成1和0字符串獲得；

本發(fā)明還提供了一種快速鑒定不同白化茶樹品種的試劑盒，所述試劑盒包括上述的分子標(biāo)記組合。

本發(fā)明還提供了上述快速鑒定不同白化茶樹品種的分子標(biāo)記組合在制備試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種白化茶樹品種的指紋圖譜，由上述快速鑒定不同白化茶樹品種的分子標(biāo)記組合中的三對(duì)引物對(duì)白化茶樹品種擴(kuò)增得到的等位基因轉(zhuǎn)換成1和0字符串，并利用在線二維碼生成器生成。

通過采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明采用三對(duì)分子標(biāo)記組合或包含其的試劑盒，可以對(duì)市場(chǎng)上的白化茶樹品種進(jìn)行區(qū)分鑒定，且鑒定方法簡(jiǎn)單、快速，可以解決目前市場(chǎng)上白化茶樹品種混雜的問題，有利于育種工作的開展及白化茶樹品種背景信息的確認(rèn)，

2、茶葉銷售企業(yè)也可利用本發(fā)明生成的二維碼對(duì)公司不同白化茶樹品種加工而成的產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)注，從而使消費(fèi)者更加方便的了解產(chǎn)品信息。

附圖說(shuō)明

上述僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，以下結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

圖1是16個(gè)白化茶樹品種Neighbor-Joining聚類圖；

圖2是利用三對(duì)分子標(biāo)記組合(CSR238、CSR1297、LG04-06)對(duì)16個(gè)白化茶樹品種進(jìn)行擴(kuò)增的電泳圖；

圖3是16個(gè)白化品種的指紋圖譜二維碼。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1分子標(biāo)記組合的篩選實(shí)驗(yàn)

1材料與方法

1.1材料

供試的16種白化茶樹樣品(見表1)所示，樣品均采自國(guó)家茶樹種質(zhì)資源圃杭州分圃。采摘各供試樣品無(wú)病蟲害感染的一芽二葉新梢，液氮迅速冷凍后，于-80℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1供試樣品的編號(hào)、名稱

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取方法

將所有樣品在液氮中磨成粉末，采用CTAB法提取基因組DNA，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，利用ND-1000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，后將DNA濃度稀釋至工作濃度20ng/ul，用于PCR擴(kuò)增，剩余原液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

從本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、篩選的SSR引物中選取62對(duì)多態(tài)性高、擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的引物，用于供試材料的SSR-PCR分析。PCR反應(yīng)在ABI公司的PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為DNA 2ul，Tap DNA polymerase(2U/ul)0.2ul，dNTP(10nmol/L)0.2ul，10×PCR buffer(Mg²⁺)1ul以及Primer(10umol/L)各0.2ul，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min，然后94℃變性30s，不同溫度下退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用10％的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)，150V電壓下電泳80min，電泳結(jié)束后銀染法顯色。

1.2.3數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)處理采用人工讀帶的方法，將電泳圖上目的片段范圍內(nèi)清晰的條帶，按照分子量大小，從大到小按照A、B、C、D、E等依次記錄，從而建立原始數(shù)據(jù)庫(kù)。利用軟件POPGENE分析62對(duì)引物在16個(gè)白化品種中的擴(kuò)增等位基因數(shù)(Observed number of alleles，Na)、有效等位基因(Effective number of alleles，Ne)、觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity，H_O)、期望雜合度(Expected heterozygosity，H_E)、Shannon信息指數(shù)(Shannon’s information index，I)；利用軟件PowerMarker分析基因型數(shù)(Genotype)和多態(tài)性信息量(Polymorphism information content，PIC)，之后計(jì)算16個(gè)品種間的Nei’s遺傳距離，構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行聚類分析。最后根據(jù)62對(duì)SSR引物擴(kuò)增的基因型數(shù)及PIC值，從中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、PIC值高的作為核心引物，將擴(kuò)增出的基因型轉(zhuǎn)化為[0，1]數(shù)據(jù)矩陣，利用在線二維碼生成器(http：mh.cli.im)構(gòu)建分子指紋圖譜。

2結(jié)果與分析

2.1 16個(gè)白化品種的SSR多態(tài)性

觀測(cè)62對(duì)引物的譜帶，發(fā)現(xiàn)除7對(duì)引物之外，剩余的55對(duì)引物擴(kuò)增出的譜帶均表現(xiàn)出多態(tài)性，55對(duì)引物的序列見下表2。分析這55對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果(見表3)，發(fā)現(xiàn)共擴(kuò)增出169個(gè)等位基因(Na)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出3.07個(gè)，最多有5個(gè)，最少的只有2個(gè)；有效等位基因(Ne)的變異范圍在1.06～3.61之間，平均值為2.06；共檢測(cè)到基因型234個(gè)，范圍在2～9個(gè)之間；引物的觀測(cè)雜合度(H_O)最大值為0.87(CSR231)，最小值為0(CSR88)；期望雜合度(H_E)最大值為0.75(CSR1297)，最小值為0.12(CSR1317、CSR1614、CSR1633、CSR1669)；Shannon信息指數(shù)(I)的范圍在0.14～1.39之間，平均值為0.79；而多態(tài)性信息含量(PIC)變化范圍較大，在0.059～0.675之間，平均值為0.401，其中引物CSR1297的PIC值最高，而大于等于平均值的引物有30個(gè)，超過總數(shù)的一半，這說(shuō)明這些引物總體上多態(tài)性情況尚好，多態(tài)性的高低往往與引物鑒別力有關(guān)，多態(tài)性越高，則鑒別力就越強(qiáng)。

表2 55對(duì)SSR標(biāo)記的引物序列表

表3 55個(gè)SSR標(biāo)記在16個(gè)茶樹品種中的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 16個(gè)白化茶樹品種之間親緣關(guān)系分析

根據(jù)55對(duì)SSR引物擴(kuò)增的等位基因出現(xiàn)頻率計(jì)算Nei’s遺傳距離(D)，結(jié)果顯示16個(gè)白化茶樹品種間的遺傳距離在0.086～0.532，說(shuō)明這16個(gè)白化品種間的遺傳差異比較明顯；黃金芽和黃葉寶之間的遺傳距離最大，說(shuō)明此兩個(gè)品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

基于Nei’s遺傳距離，采用NJ法繪制16個(gè)品種的品種聚類圖(參見圖1)。從聚類圖中可以看出，當(dāng)D≈0.18時(shí)，16個(gè)品種基本聚為三大類，第Ⅰ類僅有兩個(gè)品種，分別是黃金菊和花葉；第Ⅱ類包括郁金香、天臺(tái)白茶等10個(gè)品種，而第Ⅲ類則包括中黃2號(hào)、黃金芽、中黃1號(hào)和越鄉(xiāng)白茶等4個(gè)品種。相同地理來(lái)源的品種基本聚在一起，第Ⅱ和第Ⅲ類聚類的品種大部分都來(lái)自浙江省，其中千年雪和四明雪芽均來(lái)自浙江省余姚市。

利用該聚類圖，能夠使茶樹育種工作者了解現(xiàn)有白化品種資源的譜系關(guān)系，從而在選擇雜交親本創(chuàng)制新的白化品種時(shí)更加有的放矢。

2.3 DNA指紋圖譜的構(gòu)建

分析55對(duì)SSR引物擴(kuò)增結(jié)果，發(fā)現(xiàn)16個(gè)品種均具有特征譜帶，利用這些特征引物可以快速準(zhǔn)確地鑒定出這些品種(表4)。從表4中可以發(fā)現(xiàn)，具有特征引物的16個(gè)品種中，每個(gè)品種都至少有1對(duì)引物可以獨(dú)立鑒別，最多的可達(dá)9對(duì)，但沒有任何一對(duì)引物能夠?qū)⑦@16個(gè)白化品種全部區(qū)分開，這就需要采用引物相互組合的方式，通過2對(duì)以上的引物進(jìn)行區(qū)分。

表4 16個(gè)茶樹品種的特征引物

在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，本發(fā)明綜合考慮了55對(duì)引物擴(kuò)增條帶清晰度、基因型數(shù)目及PIC值等因素，遵循以最少的引物鑒定全部品種的原則，篩選出CSR238、CSR1297、LG04-06三對(duì)引物，利用這三對(duì)引物可將參試的16個(gè)品種全部區(qū)分開，引物擴(kuò)增的電泳圖參見圖2。隨后將這三對(duì)引物擴(kuò)增得到的等位基因轉(zhuǎn)換成1和0字符串(表5)，作為每個(gè)品種的分子身份證，并利用在線二維碼生成器(http：mh.cli.im)建立了這16個(gè)白化品種的指紋圖譜(圖3)。

表5 16個(gè)白化茶樹品種的指紋圖譜代碼

實(shí)施例2利用分子標(biāo)記組合快速鑒定不同白化茶樹品種的方法

通過實(shí)施例1篩選出的三對(duì)引物可以用來(lái)鑒別目前市場(chǎng)上的主要白化茶樹品種，從而解決目前市場(chǎng)上茶樹白化苗木命名混雜的問題。

如當(dāng)茶農(nóng)或茶苗繁育企業(yè)完全不清楚某一白化茶樹品種的背景信息時(shí)，則可以利用本研究篩選出的CSR238、CSR1297、LG04-06三對(duì)引物對(duì)該品種進(jìn)行鑒定，具體鑒定方法為：

(1)對(duì)待測(cè)茶樹品種的新鮮幼葉或是成品茶提取DNA；

(2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，以CSR238、CSR1297、LG04-06為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)對(duì)步驟(2)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，獲得待測(cè)樣品的分離帶型；

(4)對(duì)步驟(3)中的樣品進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)，對(duì)比判定，即可鑒定待測(cè)茶樹品種。

步驟(4)中對(duì)帶型統(tǒng)計(jì)完之后，可以直接與標(biāo)準(zhǔn)(用上述三對(duì)引物擴(kuò)增16個(gè)白化茶樹品種所獲得的電泳圖譜帶型)進(jìn)行對(duì)比判定。也可以對(duì)步驟(3)中的樣品進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)，將三對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果轉(zhuǎn)換成1和0字符串后與表5中的指紋圖譜代碼進(jìn)行比對(duì)即可鑒定茶樹品種。

當(dāng)茶農(nóng)或茶苗繁育企業(yè)需鑒定市場(chǎng)上銷售的某一白化茶樹品種是否為“景寧白茶1號(hào)”時(shí)，可利用本項(xiàng)研究篩選出的該品種的任意特征引物之一(CSR829/CSR1297)進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果如確為該品種的特征帶型，則可判定為該白化茶樹苗木為“景寧白茶1號(hào)”，否則可判定為“否”。

實(shí)施例3指紋圖譜二維碼的應(yīng)用

茶葉銷售企業(yè)可利用本發(fā)明實(shí)施例1生成的二維碼對(duì)公司不同白化茶樹品種加工而成的產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)注，從而使消費(fèi)者更加方便的了解產(chǎn)品信息。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許簡(jiǎn)單修改、等同變化或修飾，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所

<120>快速鑒定不同白化茶樹品種的分子標(biāo)記組合、方法及應(yīng)用

<160> 6

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（CSR238正向引物）

<400> 1

tgaccctaca acaagacc 18

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列（CSR238反向引物）

<400> 2

ttgccaacaa gcaccac 17

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（CSR1297正向引物）

<400> 3

caaatgcata atgtggtcgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（CSR1297反向引物）

<400> 4

atttccctcc ctttcatgct 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（LG04-06正向引物）

<400> 5

acagaccttc accctctcca tttc 24

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列（LG04-06反向引物）

<400> 6

gtttacctct gccttcgttc ttcagc 26