本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一組基于懸浮微珠陣列系統(tǒng)檢測遺傳性耳聾的探針、引物、檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
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聽力殘疾居我國殘疾之首。中國殘聯(lián)公布的“2010年末全國殘疾人總數(shù)及各類、不同殘疾等級人數(shù)”顯示，我國8502萬殘疾人當中，聽力殘疾有2054萬人，占比接近1/4。并且新出生的聾兒以每年3萬例的速度在增加。中國人耳聾的病因中，遺傳因素約占60％。為此進行遺傳性耳聾檢測能從源頭上阻斷大部分遺傳性耳聾的發(fā)生。
遺傳性耳聾包括非綜合征性耳聾(nonsyndromic hearing impairment，NSHI)和綜合征性耳聾(syndromic hearing impairment，SHI)。非綜合征性耳聾(NSHI)一般只表現(xiàn)單一的聽覺癥狀，占了遺傳性耳聾超過70％的比例。屬于常染色體隱性遺傳的GJB2基因和SLC26A4基因突變導致的耳聾又占NSHI的80％以上。GJB3基因是我國本土上克隆的第一個遺傳疾病耳聾基因。另外，線粒體12S rRNA基因突變會引發(fā)氨基糖苷類抗生素引發(fā)的耳聾。
因此針對GJB2、GJB3、SLC26A4、12S rRNA基因進行耳聾基因篩查，是社會效益和經(jīng)濟性價比最好的一種遺傳性耳聾基因檢測方式。目前市面上檢測遺傳性耳聾基因的技術和產(chǎn)品，也多是針對以上四個基因的突變位點進行檢測；例如北京博奧生物有限公司采用基于玻璃基質(zhì)的基因芯片檢測以上4個基因的9個及15個突變位點；廣東潮州凱普生物化學有限公司采用基于尼龍膜的導流雜交芯片也是檢測以上4個基因的9個突變位點；北京中生北控生物科技公司采用熒光定量PCR方法檢測以上4個基因的4個突變位點；等等。這些產(chǎn)品各有其特點，但都存在一定的局限性；例如基于熒光定量方法的耳聾基因檢測產(chǎn)品所檢測位點太少，容易漏檢；基于玻璃基質(zhì)的基因芯片對DNA量要求較大，使得干血片樣本難以滿足檢測的要求；另一方面，隨著最近幾年我國研究人員對國人遺傳性耳聾基因的研究，發(fā)現(xiàn)這4個基因的其他高頻致病性突變位點，例如GJB2基因的109G>A突變是高頻的致病性突變位點，而這些新發(fā)現(xiàn)的突變位點在目前市面上的耳聾基因檢測產(chǎn)品中是沒有被覆蓋的。因此有必要建立一種檢測位點較目前產(chǎn)品更多、檢測樣本通量大、檢測靈敏度更高的耳聾基因突變檢測方法及產(chǎn)品，以實現(xiàn)對臨床大樣本人群快速而準確的檢測。
懸浮微珠陣列技術是屬于生物芯片技術的一種，它不同于玻璃基質(zhì)或者尼龍膜基質(zhì)以固體平面來固定支持探針，而是以一種可以在液體中懸浮流動的微珠為介質(zhì)來固定支持探針，探針就能以流動的方式和樣本進行雜交；而固體平面上的探針則是不能流動的，這樣懸浮微珠陣列技術中核酸分子的雜交動力學就會優(yōu)于固態(tài)表面的雜交，并且懸浮微珠陣列技術容易實現(xiàn)自動化操作。
懸浮微珠陣列技術的技術核心是微珠的編碼和解碼。固體平面上的探針是通過有序的行與列的位置關系來實現(xiàn)探針的尋址的；而微珠懸浮陣列技術中，微珠是流動的，自然就無法通過位置來尋址了，因此只能通過對微珠本身進行編碼。目前國際上有兩種微珠編碼技術，一種是Luminex公司的基于紅外材料的熒光編碼技術，就是把兩種紅外材料按照不同的配比混合，使之發(fā)出不同波段的熒光，達到編碼微珠的目的，稱為熒光編碼，例如99％的A材料+1％的B材料混合后，編碼1號微珠；98％的A材料+2％的B材料混合后，編碼2號微珠，諸如類推，這樣至少可以編碼100種微珠。另外一種懸浮微珠技術是Applied BioCode公司的二維編碼技術，是通過電腦微加工技術，在硅質(zhì)的顆粒上蝕刻出不同方向的痕跡，產(chǎn)生橫向和縱向的二維編碼，最多可產(chǎn)生2的12次方共計4096種編碼的微珠。
這兩種懸浮微珠陣列技術盡管各自的編碼技術不同，但對于臨床應用來說，都可以滿足一次試驗檢測指標多、容易自動化操作、單位時間檢測樣本量多的需求。
技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有遺傳性耳聾基因檢測技術和產(chǎn)品的缺點與不足，提供基于懸浮微珠陣列系統(tǒng)檢測遺傳性耳聾的探針、引物、檢測試劑盒及檢測方法。
本發(fā)明的第一個目的是提供一組基于懸浮微珠陣列系統(tǒng)檢測遺傳性耳聾的探針，其特征在于，所述的探針序列如下所示：
GJB2-512N：5’-ACAAGGCCAGGCGTTGCACTT-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
GJB2-512M：5’-AAGGCCAGGCGTTCGTTGCAC-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
GJB2-299N：5’-CTTCTTCTCATGTCTCCGGTA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
GJB2-299M：5’-TCTTCTTCTCGTCTCCGGTAG-3’(如SEQ ID NO.4所示)；
GJB2-235N：5’-ATCAGCTGCAGGGCCCATAGC-3’(如SEQ ID NO.5所示)；
GJB2-235M：5’-TCAGCTGCAGGCCCATAGC-3’(如SEQ ID NO.6所示)；
GJB2-176N：5’-TAGCACACGTTCTTGCAGCCT-3’(如SEQ ID NO.7所示)；
GJB2-176M：5’-TAGTGATCGTAGCTGGCTGCA-3’(如SEQ ID NO.8所示)；
GJB2-109N：5’-CAGCCACAACGAGGATCAT-3’(如SEQ ID NO.9所示)；
GJB2-109M：5’-CAGCCACAATGAGGATCAT-3’(如SEQ ID NO.10所示)；
GJB2-35N：5’-TTAGTTCACACCCCCCAGGA-3’(如SEQ ID NO.11所示)；
GJB2-35M：5’-TTAGTTCACACCCCCAGGAT-3’(如SEQ ID NO.12所示)；
GJB3-538N：5’-TACATTGCCCGACCTACCG-3’(如SEQ ID NO.13所示)；
GJB3-538M：5’-TACATTGCCTGACCTACCG-3’(如SEQ ID NO.14所示)；
SLC-754N：5’-GGAGTTCTCTCTATTATCT-3’(如SEQ ID NO.15所示)；
SLC-754M：5’-GGAGTTCTCCCTATTATCT-3’(如SEQ ID NO.16所示)；
SLC-7-2N：5’-GTTTTATTTCAGACGATAATT-3’(如SEQ ID NO.17所示)；
SLC-7-2M：5’-GTTTTATTTCGGACGATAATT-3’(如SEQ ID NO.18所示)；
SLC-1174N：5’-GGGATCAGCAACATCTTCT-3’(如SEQ ID NO.19所示)；
SLC-1174M：5’-GGGATCAGCTACATCTTCT-3’(如SEQ ID NO.20所示)；
SLC-1226N：5’-GCTCTTTCCCGCACGGCCGTC-3’(如SEQ ID NO.21所示)；
SLC-1226M：5’-GCTCTTTCCCACACGGCCGTC-3’(如SEQ ID NO.22所示)；
SLC-1229N：5’-CTTTCCCGCACGGCCGTCCAG-3’(如SEQ ID NO.23所示)；
SLC-1229M：5’-TTTCCCGCATGGCCGTCCA-3’(如SEQ ID NO.24所示)；
SLC-1692N：5’-CGATGGTTTTAAAAAATGTAT-3’(如SEQ ID NO.25所示)；
SLC-1692M：5’-GATGGTTTTAAAAAAATGTAT-3’(如SEQ ID NO.26所示)；
SLC-15+5N：5’-TCCACAGTAAGTATTTTATCC-3’(如SEQ ID NO.27所示)；
SLC-15+5M：5’-TCCACAGTAAATATTTTATCC-3’(如SEQ ID NO.28所示)；
SLC-1975N：5’-CCATAGCCTTGTGCTTGACTG-3’(如SEQ ID NO.29所示)；
SLC-1975M：5’-CCATAGCCTTCTGCTTGACTG-3’(如SEQ ID NO.30所示)；
SLC-2027N：5’-TGAGATCACTGCGGGTG-3’(如SEQ ID NO.31所示)；
SLC-2027M：5’-TGAGATCACAGCGGGTG-3’(如SEQ ID NO.32所示)；
SLC-2086N：5’-TGCATCACTTCAAGGTAAATA-3’(如SEQ ID NO.33所示)；
SLC-2086M：5’-TGCATCACTTTAAGGTAAATA-3’(如SEQ ID NO.34所示)；
SLC-2168N：5’-TGACGGTCCATGATGCTAT-3’(如SEQ ID NO.35所示)；
SLC-2168M：5’-TGACGGTCCGTGATGCTAT-3’(如SEQ ID NO.36所示)；
12S-1494N：5’-GCCCGTCACCCTCCTCAAG-3’(如SEQ ID NO.37所示)；
12S-1494M：5’-GCCCGTCACTCTCCTCAAG-3’(如SEQ ID NO.38所示)；
12S-1555N：5’-ATAGAGGAGACAAGTCGTA-3’(如SEQ ID NO.39所示)；
12S-1555M：5’-ATAGAGGAGGCAAGTCGTA-3’(如SEQ ID NO.40所示)；
其中，N表示野生型探針；M表示突變型探針；探針的5’端連接有連接臂。連接臂上的-NH2可以和微珠上的-COOH發(fā)生化學縮合反應，使得探針連接到微珠上。
優(yōu)選，所述的連接臂為NH2-C18連接臂。
本發(fā)明的第二個目的是提供一組基于懸浮微珠陣列系統(tǒng)檢測遺傳性耳聾的引物，其特征在于，所述的引物序列如下所示：
deaf-1F：5’-GACACAAAGCAGTCCACA-3’，deaf-1R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCTTCTATGTCATGTACGACGG-3’；
deaf-2F：5’-TTTTGATCTCCTCGATGTCCT-3’，deaf-2R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCCGACTTTGTCTGCAACAC-3’；
deaf-13F：5’-TTTTGATCTCCTCGATGTCCT-3’，deaf-13R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCGCTCCTAGTGGCCATGC-3’；
deaf-3F：5’-CTCATCTCCCCACACCTCCT-3’，deaf-3R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCGCCCAGAGTAGAAGATGGAT-3’；
deaf-4F：5’-CACTCTCTGGCATGGCTT-3’，deaf-4R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCATGAGGTAGCAGAGCTCACA-3’；
deaf-5F：5’-TTGCAGATTGGATTCATAGTGAG-3’，deaf-5R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCAATGAACAGTGACCCATC-3’；
deaf-6F：5’-AGTTCAGCATTATTTGGTTGACA-3’，deaf-6R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCGGAACACCACACTCACCC-3’；
deaf-7F：5’-TGAAATACTCAGCGAAGGTCT-3’，deaf-7R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCTCTGTTGCCATTCCTCGAC-3’；
deaf-8F：5’-CCTCTGAGCAACTGTGAC-3’，deaf-8R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCGGCCTATTCCTGATTGGAC-3’；
deaf-9F：5’-GTGCCAATCCATAGCCTT-3’，deaf-9R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCACCCACATCATTTTACTATTGC-3’；
deaf-10F：5’-TGCTACTGAATTATGGGCAGA-3’，deaf-10R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCCCAGATAGGAGAAAGGGCTT-3’；
deaf-11F：5’-TGATAGAAAAGCTGGAGCAAT-3’，deaf-11R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCAAAATGGAACCTTGACCCTC-3’；
deaf-12F：5’-CCCCAGAAAACTACGATAGCC-3’，deaf-12R：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCCCAGGTTTCAATTTCTATCGCCTA-3’；
deaf-Tag：5’-GTGGCCAAGCGCTGTATCCCGAGTATCTCC-3’；
在與上述的探針的互補序列的引物的5’端進行生物素修飾。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種基于懸浮微珠陣列系統(tǒng)檢測遺傳性耳聾的檢測試劑盒，其特征在于，包括上述的基于懸浮微珠陣列系統(tǒng)診斷遺傳性耳聾的探針和上述的基于懸浮微珠陣列系統(tǒng)診斷遺傳性耳聾的引物。
優(yōu)選，所述的檢測試劑盒還包括多重PCR反應液、DNA聚合酶和微珠。
優(yōu)選，所述的微珠為熒光編碼微珠或者二維編碼微珠。所述的熒光編碼微珠優(yōu)選為美國Luminex公司的表面羧基修飾的微珠。
本發(fā)明的第四個目的是提供一種基于懸浮微珠陣列系統(tǒng)檢測遺傳性耳聾的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)懸浮微珠陣列的制備：將上述的探針分別與不同編碼的微珠偶聯(lián)；然后根據(jù)檢測目的將偶聯(lián)探針的微珠混合，得到懸浮微珠陣列；
2)樣本PCR擴增：提取待測樣本基因組DNA，利用上述的引物對樣本基因組DNA進行多重PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；
3)將PCR產(chǎn)物與懸浮微珠陣列進行雜交，得到雜交產(chǎn)物，再用鏈霉親和素R-藻紅蛋白對雜交產(chǎn)物進行標記，通過懸浮微珠陣列檢測儀讀出檢測結(jié)果，判斷樣本中的基因突變位點。
優(yōu)選，所述的多重PCR擴增，其PCR反應體系為25μL；包括1×PCR緩沖液、dNTPs 0.2mM、Mg2+2mM、1U Taq DNA聚合酶，基因組DNA25ng，上述的引物各0.2μM；PCR擴增程序為：37℃10min；95℃10min；95℃30s，52℃60s，65℃60s，30次循環(huán)；95℃30s，65℃45s，72℃45s，25次循環(huán)；72℃5min。
本發(fā)明的基于懸浮微珠陣列系統(tǒng)檢測遺傳性耳聾的優(yōu)點包括：①由于微珠上的探針和待檢的PCR產(chǎn)物都能處于液體懸浮流動狀態(tài)，因此雜交動力學較固相基因芯片好，結(jié)果穩(wěn)定；②檢測耗時短，操作步驟簡單，整個檢測流程能在6個小時內(nèi)完成；③自動化程度和檢測通量高，整個反應可以在96孔板中完成，中間手工操作步驟少，一次可以同時檢測96個樣品；④可以在一次測試中同時檢測4個主要的遺傳性耳聾基因的20個突變位點，較目前市面上所用的熒光定量PCR和基因芯片方法要多；⑤結(jié)果通過數(shù)字化方式呈現(xiàn)，不受人為主觀影響。
具體實施方式：
以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
實施例：
本發(fā)明基于懸浮微珠陣列系統(tǒng)檢測遺傳性耳聾的引物和探針，可以兼容兩種懸浮微珠陣列系統(tǒng)來檢測遺傳性耳聾基因突變，在一次試驗中可實現(xiàn)對GJB2基因6個位點(235delC、299_300delAT、35delG、176_191del16、512insAACG、109G>A)；GJB3基因1個位點(538C>T)；SLC26A4基因11個位點(IVS7-2A>G、2168A>G、1174A>T、1229C>T、1226G>A、1975G>C、2027T>A、IVS15+5G>A、1693insA、754T>C、2086C>T)；線粒體12S rRNA基因2個位點rRNA(1494C>T、1555A>G)共計20個突變位點的檢測。
1、多重PCR引物設計
為了實現(xiàn)對20個遺傳性耳聾基因突變位點的檢測，一共需要進行20重PCR擴增。這20個突變位點對應的PCR引物序列見表1，其中，反向引物(R)的5’端加有一段通用引物(deaf-Tag)。在與探針互補序列的PCR引物的5’端進行生物素修飾。
表1多重PCR引物序列
注：F表示正向引物；R表示反向引物
2、探針設計
本發(fā)明一共設計了40條探針，包括針對20個突變位點設計的40條探針，即每個突變位點設計一條野生型探針(N)和一條突變型探針(M)(如表2所示)。探針的5’端連接有NH2-C18連接臂，氨基可以微珠上的羧基反生縮合反應將探針連接到微珠上。
表2探針序列
注:N表示野生型探針；M表示突變型探針，探針的5’端連接有NH2-C18連接臂
3、懸浮微珠陣列的制備
將熒光編碼微珠(或者二維編碼微珠)與表2所述的探針分別偶聯(lián)，然后根據(jù)檢測目的將偶聯(lián)好探針的編碼微珠混合，得到懸浮微珠陣列。按照一萬人份理論量計算，一種探針與一個編碼的微珠進行偶聯(lián)，具體實驗步驟為：
a、從-20℃取出密封干燥保存的二氯乙烷(EDC)粉末，使其恢復至室溫。
b、融化已配置好的100μM的探針溶液，渦旋5s混勻并3000rpm離心30s。
c、輕柔渦旋懸浮原料檢驗合格的微珠(2-8℃儲存)，超聲處理30-60s。
d、取1.5mL低吸附離心管編好號(微珠編號+探針號)固定于磁力架上，將微珠輕柔顛倒5-10次，避免劇烈震蕩，移液器反復吹吸3次后吸取12.5×106個(1mL)微珠，靠磁力架內(nèi)壁加至對應離心管中，吸附1min。
e、小心移去上清(左手往磁力架方向壓住管身，右手緩慢吸凈上清，槍頭始終應盡量靠遠離磁力架方向，若有微珠跟進槍頭，則需重新吹打均勻，待其重新吸附后再次嘗試)；加入60μL 0.1M，pH＝4.5的2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)溶液，超聲處理30-60s，渦旋5s混勻，得到偶聯(lián)體系。
f、在偶聯(lián)體系中加入15μL 100μM探針。
g、稱量10mg的EDC粉末至于1.5mL離心管管中，加入1mL純水至終濃度10mg/mL，渦旋5s混勻，立即取10μL加入到偶聯(lián)體系中，渦旋5s混勻。
h、偶聯(lián)體系室溫避光孵育30min，期間每隔10min渦旋5s混勻。
i、重復步驟G和H兩次。
j、加入1mL 0.02％Tween-20，渦旋5s混勻，3000rmp離心1min，上磁力架1min。
k、輕輕開蓋并小心移除上清，加入1mL 0.1％SDS，渦旋5s重懸，3000rmp離心1min，上磁力架1min。
l、輕輕開蓋并小心移除上清，加入500μL 1×TE(pH8.0，包括10mM Tris-HCl和1mM EDTA)超聲處理30-60s后渦旋5s重懸。
m、取1μL稀釋100倍用細胞計數(shù)板在顯微鏡下進行計數(shù)(有自動計數(shù)儀亦可)，計算回收率計算微珠總數(shù)。
n、每種微珠根據(jù)兩種不同的系統(tǒng)要求進行混合配制(Luminex公司的微珠按照每人份每種微珠2000顆進行混合；Applied BioCode公司的微珠按照每人份每種微珠50顆進行混合)，得到懸浮微珠陣列。
o、2-8℃避光保存，有效期14個月。
4、樣本檢測：
從樣本中提取基因組DNA，以表1中的PCR引物進行多重PCR擴增(還可以根據(jù)檢測目的選擇表1所示的引物進行多重PCR擴增)，得到PCR產(chǎn)物(待分析的目標片段)。
多重PCR反應體系：包括1×PCR緩沖液、dNTPs 0.2mM、Mg2+2mM、1U Taq DNA聚合酶，基因組DNA25ng，表1的多重PCR引物各0.2μM，dd H2O補足至25μL。
PCR擴增程序如表3所示：
表3 PCR擴增程序
取步驟3所配制的懸浮微珠陣列，分裝至96孔板中，每孔45μL(包含有40種編碼的微珠，每種微珠各2000個)，然后加入5μL的PCR產(chǎn)物；在95℃變性5min后，60℃雜交15min，得到雜交產(chǎn)物，然后加入25μL 1×TMAC雜交液稀釋的鏈霉親和素R-藻紅蛋白0.04μg(1×TMAC雜交液包括3M TMAC、質(zhì)量體積比0.1％的十二烷基肌氨酸鈉、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、4mM EDTA(pH 8.0))，吸打10-20下以充分混勻，于60℃顯色7min。
用Luminex公司的懸浮微珠陣列讀取儀對顯色后的雜交產(chǎn)物的微珠進行解碼并讀取各探針的熒光信號值MFI(檢測溫度設定為60℃，檢測體積為50μL)，同時通過Luminex附帶XPonent 3.1數(shù)據(jù)收集軟件獲得突變型探針(M)和野生型探針(N)的探針信號值的比值(N/M)，結(jié)果如表4～8所示。根據(jù)基因突變位點判斷標準(如表9所示)，對表4～8的檢測結(jié)果進行判斷分析，24個樣本的突變位點分析結(jié)果見表10。如果微珠為二維編碼微珠就用Applied BioCode公司的懸浮微珠陣列讀取儀對微珠進行解碼并讀取各探針的熒光信號值MFI。
表4 24個樣本的檢測結(jié)果
表5 24個樣本的檢測結(jié)果
表6 24個樣本的檢測結(jié)果
表7 24個樣本的檢測結(jié)果
表8 24個樣本的檢測結(jié)果
表9判斷標準
表10 24個樣本的突變位點分析結(jié)果
可見，本發(fā)明能準確檢出遺傳性耳聾患者。使用本發(fā)明所述的方法和試劑盒，約6小時能得出結(jié)果。現(xiàn)在臨床上使用的Sanger方法，需要2日才能完成。而且，對于大樣本量檢測，本發(fā)明與Sanger測序方法相比，更具有優(yōu)勢。
應用本發(fā)明所述的方法和試劑盒對230例的樣本進行了檢測，與經(jīng)典的測序方法比較準確率達100％。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
序列表
<110> 廣州中心法則生物科技有限公司
<120> 基于懸浮微珠陣列系統(tǒng)檢測遺傳性耳聾的探針、引物、檢測試劑盒及檢測方法
<160> 40
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acaaggccag gcgttgcact t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaggccaggc gttcgttgca c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttcttctca tgtctccggt a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcttcttctc gtctccggta g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atcagctgca gggcccatag c 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcagctgcag gcccatagc 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tagcacacgt tcttgcagcc t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tagtgatcgt agctggctgc a 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cagccacaac gaggatcat 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cagccacaat gaggatcat 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttagttcaca ccccccagga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttagttcaca cccccaggat 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tacattgccc gacctaccg 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tacattgcct gacctaccg 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggagttctct ctattatct 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggagttctcc ctattatct 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gttttatttc agacgataat t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gttttatttc ggacgataat t 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gggatcagca acatcttct 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gggatcagct acatcttct 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tttcccgcat ggccgtcca 19
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cgatggtttt aaaaaatgta t 21
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<400> 26
gatggtttta aaaaaatgta t 21
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gcccgtcact ctcctcaag 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
atagaggagg caagtcgta 19