本發(fā)明涉及生物技術領域，一種用于檢測轉基因調(diào)控元件的標準質(zhì)粒及其構建方法與應用，以及包含該標準質(zhì)粒的試劑盒。

背景技術：

自從首例轉基因產(chǎn)品被批準商業(yè)化生產(chǎn)以來，越來越多的轉基因作物在不同的國家和地區(qū)開始商業(yè)化種植，越來越多的已批準的轉基因農(nóng)產(chǎn)品出現(xiàn)在流通市場上，比如：轉基因玉米、大豆、油菜、木瓜、棉花等。但隨著轉基因作物及其相關產(chǎn)品的在全球內(nèi)迅速發(fā)展，其環(huán)境安全和食品安全性問題一直受到人們的關注。對轉基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測有利于政府職能部門對其進行監(jiān)管。

目前，轉基因作物的檢測方法主要是在核酸水平上的檢測，常用方法是提取檢測樣品的DNA，進行定性PCR或定量PCR檢測。在PCR檢測過程中，必須設置陰性對照和陽性對照，確保實驗的有效性。因此檢測結果的可靠性、準確性、有效性則需要陽性標準物質(zhì)(包括標準質(zhì)粒)做對照，可見陽性標準物質(zhì)對轉基因個農(nóng)產(chǎn)品的檢查過程是十分重要不可缺少的。目前，國外研制轉基因陽性標準物質(zhì)的單位主要是歐洲標準物質(zhì)研究院(IRMM)和美國的油料化學學會(AOCS)。研制的種類主要包括轉基因玉米、大豆、油菜、棉花、甜菜、馬鈴薯等50余種。這些標準物質(zhì)是針對其的特定品系，同時它們自身僅包含一種或兩種特定的啟動子或終止子，并不能涵蓋多個啟動子或終止子。

陽性標準質(zhì)粒分子的構建是采用檢測的目的外源基因片段進行特異性擴增，重組于質(zhì)粒分子上。它的優(yōu)點是可以通過微生物大量培養(yǎng)，質(zhì)粒DNA容易提取且純度高，并且同一陽性質(zhì)粒分子可以包含多個外源目的基因。然而，這與190多種轉基因作物種類相比，還遠遠不能滿足需求。轉基因農(nóng)產(chǎn)品檢測中轉基因標準物質(zhì)是非常匱乏的。因此，根據(jù)轉基因品種的外源基因特研制陽性轉基因標準質(zhì)粒，涵蓋多個啟動子或終止子的質(zhì)粒來代替標準物質(zhì)進行檢測，已成為本領域亟待解決的技術難題。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供一種用于檢測轉基因調(diào)控元件的標準質(zhì)粒，在轉基因農(nóng)產(chǎn)品篩選調(diào)控元件時用作陽性參照物質(zhì)，可檢測多種轉基因農(nóng)產(chǎn)品中的調(diào)控元件，覆蓋面廣，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

一種用于檢測轉基因調(diào)控元件的標準質(zhì)粒，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

一種如本發(fā)明所述用于檢測轉基因調(diào)控元件的標準質(zhì)粒的構建方法，具體步驟如下：

以重疊PCR技術將SEQ ID No.1所示的CaMV35S啟動子基因、SEQ ID No.2所示的FMV35S啟動子基因、SEQ ID No.3所示的Pat29基因、SEQ ID No.4所示的Ubiquitin基因、SEQ ID No.5所示的NOS啟動子基因、SEQ ID No.6所示的T-35S終止子基因、SEQ ID No.7所示的NOS終止子基因和SEQ ID No.8所示的T-E9終止子基因片段依次連接獲得融合片段，再將融合片段克隆到載體pMD-19中，即獲得所述用于檢測轉基因調(diào)控元件的標準質(zhì)粒。

如本發(fā)明所述用于檢測轉基因調(diào)控元件的標準質(zhì)粒在檢測轉基因農(nóng)產(chǎn)品調(diào)控元件中的應用。

一種包含如本發(fā)明所述用于檢測轉基因調(diào)控元件的標準質(zhì)粒的試劑盒。

進一步，本發(fā)明所述試劑盒中，還包括如下引物：

CaMV35S啟動子的特異性引物P-35S-F和P-35S-R，他們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；

或者，F(xiàn)MV35S啟動子的特異性引物FMV35S-F和FMV35S-R，他們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；

或者，PTA29啟動子的特異性引物PTA29-F和PTA29-R，他們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；

或者，Ubiquitin啟動子的特異性引物Ubiquitin-F和Ubiquitin-R，他們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；

或者，NOS啟動子的特異性引物PNOS-F和PNOS-R，他們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；

或者，T35S終止子T-35S的特異性引物T35S-F和T35S-R，他們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；

或者，NOS終止子T-NOS的特異性引物T-NOS-F和T-NOS-R，他們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示；

或者，E9終止子T-E9的特異性引物T-E9-F和T-E9-R，他們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示。

進一步，本發(fā)明所述的試劑盒體積為25μL，其中包括：10×PCR緩沖液Mg²⁺2.5μL、200mmol的dNTPs、含量均為0.5mmol的特異性引物、1.25U的Taq DNA聚合酶以及濃度為25mg/L的所述用于檢測轉基因調(diào)控元件的標準質(zhì)粒1.5μL，去離子水補足至25μL。

本發(fā)明所提供的試劑盒的關鍵在于重組標準質(zhì)粒和特異性引物的設計，試劑盒中其他組份，例如PCR反應試劑，可按本領域常規(guī)進行選擇。PCR反應試劑包括PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等。將PCR反應試劑盒擴增引物混合，再加入待測樣品或標準品，即可進行PCR擴增反應，PCR擴增產(chǎn)物用2％的瓊脂糖跑膠，若樣品的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)對應195bp、210bp、266bp、314bp、183bp、121bp、180bp、262bp條帶，即可判定含有相應的轉基因元件。

本發(fā)明根據(jù)目前轉基因農(nóng)產(chǎn)品檢測中常用的調(diào)控元件：CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子、Fmv35S啟動子、Pat29、Ubiquitin、NOS啟動子、T-35S終止子、NOS終止子和T-e9終止子，設計相應的引物，利用重疊PCR技術將8個序列片段融合在一起，這些外源調(diào)控元件基因構建在同一質(zhì)粒分子中，再利用分子克隆技術將融合片段克隆到pMD-19T中，獲得長度為1731bp的重組標準質(zhì)粒pMD-RG(其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所述)。

該重組標準質(zhì)粒可以替代轉基因農(nóng)產(chǎn)品篩查檢測中的陽性標準物質(zhì)，用于盲樣轉基因農(nóng)產(chǎn)品定性PCR篩查檢測，解決我國轉基因農(nóng)產(chǎn)品篩查中陽性標準物質(zhì)不足等問題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明構建標準質(zhì)粒分子pMD-RG的流程示意圖。

圖2為本發(fā)明構建的標準質(zhì)粒分子的全部外源序列，其中CaMV35S啟動子、FMV35S、Pat29、Ubiquitin、NOS啟動子、T-35S終止子、NOS終止子和T-e9終止子分別代表通用元件的特異序列；陰影部分序列為重疊PCR引物中的重疊部分；劃線箭頭序列為定性PCR引物。

圖3為重組標準質(zhì)粒pMD-RG和陽性標準物質(zhì)在PCR檢測中對比電泳圖。

圖4為重組標準質(zhì)粒用于定性PCR靈敏度檢測的電泳圖。

具體實施方式

實施例中涉及的轉基因大豆MON89788、GTS40-3-2；轉基因水稻KF6、TT51-1；轉基因油菜RF1、MS1、GT73；轉基因油菜GT73、轉基因玉米MON863、Bt176、MON810均有農(nóng)業(yè)部發(fā)展中心提供；

非轉基因材料為大米南粳46，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提取保存。

實施例中涉及的試劑盒儀器：

pMD-19T載體、Taq DNA聚合酶及其緩沖液、dNTPs、Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；

植物DNA提取試劑盒和DNA 5a感受態(tài)購自北京天根生物有限公司；

PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑、生化試劑盒和引物購自上海生物工程有限公司；

PCR(德國Biometra)、凝膠成像系統(tǒng)(Tiangen)、Nandrop100紫外分光光度計(美國GE)、其它儀器包括：恒溫混勻儀、電子天平、微量移液器等均由商業(yè)途徑購買。

實施例中涉及的DNA序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.32如說明書附件中序列表所示。

實施例1構建標準質(zhì)粒

1、利用Genbank數(shù)據(jù)庫和相關文獻檢索，獲得常用的外源調(diào)控元件：35S啟動子(以下簡稱CaMV35S)、FMV35S啟動子(以下簡稱FMV35S)、pTA 29啟動子(以下簡稱pTA 29)、Ubiquitin啟動子(以下簡稱Ubiquitin)、NOS啟動子(以下簡稱PNOS)、T-35S終止子(以下簡稱T-35S)、NOS終止子(以下簡稱TNOS)和T-E9終止子(以下簡稱T-E9)的序列：這些調(diào)控元件的序列是以下基因的部分序列：

CaMV35S(SEQ ID NO.1,195bp)：花椰菜花葉病毒35S啟動子；

Fmv35S(SEQ ID NO.2,210bp)：玄參花葉病毒35S啟動子；

pTA29(SEQ ID NO.3,266bp)：煙草花藥組織特異基因TA29；

Ubiquitin(SEQ ID NO.4,314bp)：玉米泛素蛋白基因啟動子；

PNOS(SEQ ID NO.5,183bp)：胭脂堿合成酶基因NOS的啟動子；

T-35S(SEQ ID NO.6,121bp)：花椰菜花葉病毒的35S終止子；

TNOS(SEQ ID NO.7,180bp)：胭脂堿合成酶基因NOS終止子；

T-E9(SEQ ID NO.8,262bp)：豌豆1，5-二磷酸核酮糖羧化酶E9基因終止子；

上述基因序列依次如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示。

2、根據(jù)上述調(diào)控元件：CaMV35S、Fmv35S、pTA29、Ubiquitin、PNOS、T-35S、TNOS和T-E9的序列(分別編號1-8)，設計重疊PCR引物。所述的重疊PCR引物，是指序列完全相同或者互補的引物，使各目的片段達到無縫連接(如圖1所示)，實施例中的重疊PCR引物序列如表1所示：

表1構建標準質(zhì)粒分子pMD-RG的重疊PCR引物

(1)分別利用表1中的正向引物和反向引物為引物(反應體系中兩種引物的終濃度均為0.5mmol/L)，以對相應的8個轉基因標準品(其氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:7所示)為模板進行普通PCR擴增：

普通PCR體系為：10×PCR buffer(Mg²⁺plus)，終濃度為200mmol/L的dNTPs，終濃度為均為0.5mmol/L的引物，1.25U的Taq DNA聚合酶和1.5μLDNA模板(25mg/L)，去離子補足至25μL；

普通PCR程序為:95℃,5min預變性；94℃,1min，56℃,30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸7min。

所獲得1-8組PCR產(chǎn)物再分別用2％的瓊脂糖跑膠，切膠并利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(嚴格根據(jù)說明書操作)回收正確大小的片段，獲得CaMV35S擴增產(chǎn)物、FMV35S擴增產(chǎn)物、PTA29擴增產(chǎn)物、Ubiquitin擴增產(chǎn)物、PNOS擴增產(chǎn)物和TNOS擴增產(chǎn)物。

(2)分別以上述1-7組擴增產(chǎn)物為模板(第8組T-E9無需擴增)，以表1中對應的正向引物和重疊PCR引物進行PCR擴增(PCR體系與程序與步驟(1)普通PCR體系和普通PCR程序相同)；

所獲得的7組PCR產(chǎn)物再分別用2％的瓊脂糖跑膠，切膠并利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(嚴格根據(jù)說明書操作)回收正確大小的片段，獲得含有連接片段的CaMV35S擴增產(chǎn)物、含有連接片段的FMV35S擴增產(chǎn)物、含有連接片段的PTA29擴增產(chǎn)物、含有連接片段的Ubiquitin擴增產(chǎn)物、含有連接片段的PNOS擴增產(chǎn)物和含有連接片段的TNOS擴增產(chǎn)物。

(3)利用重疊PCR技術將步驟(2)獲得多個含有連接片段的擴增產(chǎn)物進行拼接

重疊PCR體系(25μL)：10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)，終濃度為200mmol/L的dNTPs，濃度均為25mg/L的模板各1μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，以去離子補足至25μL；

重疊PCR程序：94℃預變性2min；94℃變性30s，58℃退火10min，72℃延伸3min，循環(huán)15次；72℃延伸10min。

拼接步驟如下：

(a)首先，將CaMV35S和FMV35S片段連接在一起：

按照如上重疊PCR體系，以步驟(2)獲得含有連接連段的CaMV35S擴增產(chǎn)物和含有連接連段的FMV35S擴增產(chǎn)物為模板，進行重疊PCR反應；

重疊PCR擴增結束后，以重疊PCR擴增產(chǎn)物為模板(模板濃度25mg/L)，以引物P-35S-F(25μL反應體系中終濃度為0.5mmol/L)和FMV35S-PTA29-R(25μL反應體系中終濃度為0.5mmol/L)為正向引物和重疊PCR引物進行普通PCR擴增(按照步驟(1)所述普通PCR體系和普通PCR程序進行擴增，下同)，從而將CaMV35S和FMV35S兩個片段連接在一起，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，獲得擴增產(chǎn)物(CaMV35S+FMV35S)；

(b)PTA29啟動子和Ubiquitin啟動子片段連接在一起

按照重疊PCR擴增體系，以步驟(2)獲得的含有連接片段的PTA29擴增產(chǎn)物和含有連接片段的Ubiquitin擴增產(chǎn)物為模板，進行重疊PCR反應；

重疊PCR擴增結束后，以重疊PCR擴增產(chǎn)物為模板，以引物PTA29-F(25μL反應體系中終濃度為0.5mmol/L)和Ubiquitin-PNOS-R(25μL反應體系中終濃度為0.5mmol/L)為正向引物和重疊PCR引物進行普通PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，獲得擴增產(chǎn)物(PTA29+Ubiquitin)；

(c)擴增產(chǎn)物CaMV35S+FMV35S和擴增產(chǎn)物PTA29+Ubiquitin的連接

按照重疊PCR擴增體系，以步驟(a)獲得的擴增產(chǎn)物(CaMV35S+FMV35S)和步驟(b)獲得的擴增產(chǎn)物(PTA29+Ubiquitin)為模板，進行重疊PCR反應；重疊PCR擴增結束后，以重疊PCR擴增產(chǎn)物為模板，以引物P-35S-F(25μL反應體系中終濃度為0.5mmol/L)和Ubiquitin-PNOS-R(25μL反應體系中終濃度為0.5mmol/L)為正向引物和重疊PCR引物進行普通PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物，最后利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，獲得擴增產(chǎn)物(CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin)；

(d)PNOS和T-35擴增產(chǎn)物連接

按照重疊PCR擴增體系，以步驟(2)獲得的含有連接片段的PNOS擴增產(chǎn)物和含有連接片段的T-35擴增產(chǎn)物為模板，進行重疊PCR反應；

重疊PCR擴增結束后，以重疊PCR擴增產(chǎn)物為模板，以引物PNOS-F和T35S-TNOS-R為正向引物和重疊PCR引物進行普通PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物，最后利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，從而獲得擴增產(chǎn)物(PNOS+T35S)；

(e)TNOS和T-E9擴增產(chǎn)物連接

按照重疊PCR擴增體系，以步驟(2)獲得的含有連接片段的TNOS擴增產(chǎn)物和步驟(1)獲得的TNOS擴增產(chǎn)物為模板，進行重疊PCR反應；

重疊PCR擴增結束后，以重疊PCR擴增產(chǎn)物為模板，以引物NOS-F/T-E9-R為正向引物和反向引物進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物，最后利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，從而獲得擴增產(chǎn)物(NOS+T-E9)；

(f)擴增片段(PNOS+T35S)和擴增片段(NOS+T-E9)的連接

按照重疊PCR擴增體系，以步驟(d)獲得的擴增產(chǎn)物(PNOS+T35S)和步驟(e)獲得的擴增產(chǎn)物(NOS+T-E9)為模板，進行重疊PCR反應；

重疊PCR擴增結束后，以重疊PCR擴增產(chǎn)物為模板，以引物PNOS-F/T-E9-R為正向引物和重疊PCR引物進行普通PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物，最后利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，從而獲得擴增產(chǎn)物(PNOS+T35S+NOS+T-E9)；

(g)按照重疊PCR擴增體系，以步驟(c)獲得的擴增產(chǎn)物(CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin)和步驟(f)獲得的擴增產(chǎn)物(PNOS+T35S+TNOS+T-E9)為模板，進行重疊PCR反應；

重疊PCR擴增結束后，以重疊PCR擴增產(chǎn)物為模板，以引物P-35S-F/T-E9-R為正向引物和反向引物進行普通PCR擴增，從而獲得擴增產(chǎn)物，最后利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，獲得擴增產(chǎn)物(CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin+PNOS+T-35S+TNOS+T-E9)的整體序列，即為構建的調(diào)控元件的質(zhì)粒分子。

(4)重組片段克隆

利用分子克隆方法將步驟(3)重疊PCR擴增獲得的擴增產(chǎn)物(CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin+PNOS+T-35S+TNOS+T-E9)連接到載體pMD-19T上：

連接體系(10μL)：solutionI 5μL,擴增產(chǎn)物(CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin+PNOS+T-35S+TNOS+T-E9)4.5μL(25mg/L)，加入pMD-19T補足至10ul；16℃連接4h。

連接反應結束后利用連接產(chǎn)物以熱激法轉化DH5a感受態(tài)菌株，

具體轉化步驟如下：在裝有DH5α感受態(tài)菌株的離心管中加入DNA連接液，輕輕旋轉搖勻，冰上靜置30min，42℃水浴中熱激90s后迅速放冰上，靜置冷卻3-5min；向離心管中加800μL LB液體培養(yǎng)基(或SOC)，混勻后37℃振蕩(搖床180rpm)，培養(yǎng)45min，取100μL菌液涂布在含Amp的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16h)，即獲得含有重組片段的質(zhì)粒的單克隆菌株pMD-RG。利用菌落PCR對重組菌株進行鑒定，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，通過測序分析確定重組標準質(zhì)粒中的外源序列和預期是一致的，說明構建成功，即獲得重組標準質(zhì)粒pMD-RG，其DNA序列如SEQ ID NO.9所示，(其全部外源序列如圖2所示，其中CaMV35S啟動子、FMV35S、Pat29、Ubiquitin、NOS啟動子、T-35S終止子、NOS終止子和T-e9終止子分別代表通用元件的特異序列；陰影部分序列為重疊PCR引物中的重疊部分；劃線箭頭序列為定性PCR引物)。

實施例2標準質(zhì)粒分子在實際檢測中的應用

1、基因組DNA提取

實驗材料：轉基因大豆MON89788(其調(diào)控元件為FMV35S，T-E9)、GTS40-3-2(其調(diào)控元件為CaMV35S，PNOS)，轉基因水稻KF6(其調(diào)控元件為CaMV35S，TNOS和T-35S)、轉基因油菜RF1(其調(diào)控元件為PTA29，PNOS和TNOS)、MS1(其調(diào)控元件為PTA29、PNOS和TNOS)、GT73(其調(diào)控元件為FMV35S和T-E9)；

轉基因玉米MON863(其調(diào)控元件為CaMV35S，TNOS以及玉米本身具有的Ubiqutin)、Bt176(其調(diào)控元件為CaMV35、T35S和玉米本身具有的Ubiqutin)；上述材料均取種子粉末；

稱取100mg研磨好的種子粉末樣品，按照基因組提取試劑盒說明書提取上述樣品的DNA；上述DNA樣品的質(zhì)量用瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量檢測的方法進行評價。

2、重組標準質(zhì)粒pMD-RG的提取與檢測

將實施例1獲得的含有標準質(zhì)粒分子pMD-RG的大腸桿菌于37℃培養(yǎng)10h，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒DNA。

取3ul步驟1獲得的10組DNA樣品，分別用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷DNA完整性；再分別用分光光度計檢測DNA純度和濃度，計算OD₂₆₀nm/OD₂₈₀nm的比值在1.8左右，符合定性、定量PCR檢測要求；根據(jù)重組標準質(zhì)粒DNA初始濃度和大小，將其稀釋到5×10⁵copies/μL進行分裝，保存于-20℃冰箱備用。

3、重組標準質(zhì)粒pMD-RG在定性PCR檢測通用元件中的應用

根據(jù)通用元件的特異性序列，使用引物進行定性PCR，檢測標準質(zhì)粒分子的檢測效果，使用的引物序列見表2：

表2：重組標準質(zhì)粒定性PCR檢測引物

(1)分別以重組標準質(zhì)粒pMD-RG(25mg/L)，轉基因大豆MON89788、GTS40-3-2，轉基因水稻KF6、轉基因油菜RF1、MS1、GT73，轉基因玉米MON863、Bt176，大米南粳46(非轉基因作物)的DNA為模板，依次利用表2中的引物進行PCR擴增，判斷重組標準質(zhì)粒用于定性PCR檢測的特異性。

PCR體系(25μL)為：10×PCR緩沖液(Mg²⁺)2.5μL，終濃度為200mmol的dNTPs，終濃度為0.5mmol的正向引物，終濃度為0.5mmol反向引物，1.25U的Taq DNA聚合酶和1.5μL的模板(25mg/L)，去離子補足至25μL；

PCR程序為：95℃,5min預變性；94℃,1min，56℃,30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸7min。

PCR產(chǎn)物用2％的瓊脂糖跑膠，電泳結果如圖3所示，圖3A為以質(zhì)粒pMD-RG為DNA模板PCR擴增的電泳圖，其中，泳道M為Marker，泳道1-8依次為以目的基因CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、TNOS、T-E9和T-35S對應的引物擴增結果電泳圖；

圖3B為分別以標準物質(zhì)(MON89788、GTS40-3-2、KF6、RF1、MS1、GT73、MON863、Bt176)為模板PCR擴增電泳圖，其中，泳道M為Marker，泳道1-8依次為以目的基因CaMV35S(轉基因材料Bt176)、FMV35S(轉基因材料GT73)、PTA29(轉基因材料RF1)、Ubiquitin(轉基因材料MON863)、PNOS(轉基因材料MS1)、TNOS(轉基因材料GTS40-3-2)、T-E9(轉基因材料MON89788)和T-35S(轉基因材料KF6)對應的引物擴增結果電泳圖；

圖3C為以非轉基因材料南粳46的DNA為模板進行PCR擴增的電泳圖，其中，泳道M為Marker，泳道1-8依次為以目的基因CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、TNOS、T-E9和T-35S對應的引物擴增結果電泳圖；

由圖3可見，只有在相應的轉基因與案件中重組質(zhì)粒才有擴增，表明重組質(zhì)粒有很好的特異性，且重組標準質(zhì)粒的擴增結果與相應的陽性轉基因的擴增結果一致，說明重組標準質(zhì)粒pMD-RG能替代轉基因水稻篩查工作中陽性轉基因樣品。

(2)分別以不同濃度的重組標準質(zhì)粒pMD-RG的DNA樣品(濃度依次為1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10和1.0copy/μL)為模板，分別以表2中目的基因CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、T35S、TNOS和T-E9對應的特異性引物為引物，反應體系同步驟(1)，進行定性PCR擴增，以判斷重組標準質(zhì)粒用于定性PCR檢測的靈敏度。其結果如圖4所示，其中，圖4A-圖4H依次為對目的基因CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、T35S、TNOS和T-E9的擴增，泳道M為Marker，1-8代表加入反應體系中的重組標準質(zhì)粒pMD-RG濃度為1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10和1.0copy/μL；由圖4可知，8個插入片段的擴增靈敏度都達到了1.0×10copy.μL^-1，此拷貝數(shù)遠低于25mg/L，可見pMD-RG滿足定性PCR檢測的需求。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院

<120> 一種用于檢測轉基因調(diào)控元件的標準質(zhì)粒及其構建方法與應用

<130> 32

<160> 32

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat gcctctgccg 60

acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc 120

caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg 180

cacaatccca ctatc 195

<210> 2

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aagacatcca ccgaagactt aaagttagtg ggcatctttg aaagtaatct tgtcaacatc 60

gagcagctgg cttgtgggga ccagacaaaa aaggaatggt gcagaattgt taggcgcacc 120

taccaaaagc atctttgcct ttattgcaaa gataaagcag attcctctag tacaagtggg 180

gaacaaaata acgtggaaaa gagctgtcct 210

<210> 3

<211> 266

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

taaggtgggt ggctggacta gaataaacat cttctctagc acagcttcat aatgtaattt 60

ccataactga aatcagggtg agacaaaatt ttggtacttt ttcctcacac taagtccatg 120

tttgcaacaa attaatacat gaaaccttaa tgttaccctc agattagcct gctactcccc 180

attttcctcg aaatgctcca acaaaagtta gttttgcaag ttgttgtgta tgtcttgtgc 240

tctatatatg cccttgtggt gcaagt 266

<210> 4

<211> 314

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aacactggca agttagcaat cagaacgtgt ctgacgtaca ggtcgcatcc gtgtacgaac 60

gctagcagca cggatctaac acaaacacgg atctaacaca aacatgaaca gaagtagaac 120

taccgggccc taaccatgga ccggaacgcc gatctagaga aggtagagag gggggggggg 180

ggaggacgag cggcgtacct tgaagcggag gtgccgacgg gtggatttgg gggagatctg 240

gttgtgtgtg tgtgcgctcc gaacaacacg aggttgggga aagagggtgt ggagggggtg 300

tctatttatt acgg 314

<210> 5

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gccgttttac gtttggaact gacagaaccg caacgttgaa ggagccactc agccgcgggt 60

ttctggagtt taatgagcta agcacatacg tcagaaacca ttattgcgcg ttcaaaagtc 120

gcctaaggtc actatcagct agcaaatatt tcttgtcaaa aatgctccac tgacgttcca 180

taa 183

<210> 6

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata 60

cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc agtactaaaa tccagatccc 120

c 121

<210> 7

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 60

tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 120

cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 180

<210> 8

<211> 262

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ttatggcatt gggaaaactg tttttcttgt accatttgtt gtgcttgtaa tttactgtgt 60

tttttattcg gttttcgcta tcgaactgtg aaatggaaat ggatggagaa gagttaatga 120

atgatatggt ccttttgttc attctcaaat taatattatt tgttttttct cttatttgtt 180

gtgtgttgaa tttgaaatta taagagatat gcaaacattt tgttttgagt aaaaatgtgt 240

caaatcgtgg cctctaatga cc 262

<210> 9

<211> 1731

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat gcctctgccg 60

acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc 120

caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg 180

cacaatccca ctatcaagac atccaccgaa gacttaaagt tagtgggcat ctttgaaagt 240

aatcttgtca acatcgagca gctggcttgt ggggaccaga caaaaaagga atggtgcaga 300

attgttaggc gcacctacca aaagcatctt tgcctttatt gcaaagataa agcagattcc 360

tctagtacaa gtggggaaca aaataacgtg gaaaagagct gtccttaagg tgggtggctg 420

gactagaata aacatcttct ctagcacagc ttcataatgt aatttccata actgaaatca 480

gggtgagaca aaattttggt actttttcct cacactaagt ccatgtttgc aacaaattaa 540

tacatgaaac cttaatgtta ccctcagatt agcctgctac tccccatttt cctcgaaatg 600

ctccaacaaa agttagtttt gcaagttgtt gtgtatgtct tgtgctctat atatgccctt 660

gtggtgcaag taacactggc aagttagcaa tcagaacgtg tctgacgtac aggtcgcatc 720

cgtgtacgaa cgctagcagc acggatctaa cacaaacacg gatctaacac aaacatgaac 780

agaagtagaa ctaccgggcc ctaaccatgg accggaacgc cgatctagag aaggtagaga 840

gggggggggg gggaggacga gcggcgtacc ttgaagcgga ggtgccgacg ggtggatttg 900

ggggagatct ggttgtgtgt gtgtgcgctc cgaacaacac gaggttgggg aaagagggtg 960

tggagggggt gtctatttat tacgggccgt tttacgtttg gaactgacag aaccgcaacg 1020

ttgaaggagc cactcagccg cgggtttctg gagtttaatg agctaagcac atacgtcaga 1080

aaccattatt gcgcgttcaa aagtcgccta aggtcactat cagctagcaa atatttcttg 1140

tcaaaaatgc tccactgacg ttccataagt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc 1200

cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac 1260

caaaatccag tactaaaatc cagatccccg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 1320

atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 1380

tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 1440

aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataat tatggcattg ggaaaactgt ttttcttgta 1500

ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg ttttcgctat cgaactgtga 1560

aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc cttttgttca ttctcaaatt 1620

aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat ttgaaattat aagagatatg 1680

caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc ctctaatgac c 1731

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gctcctacaa atgccatcat tgc 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gatagtggga ttgtgcgtca tccc 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

aagacatcca ccgaagactt a 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aggacagctc ttttccacgt t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

taaggtgggt ggctggacta 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

acttgcacca caagggcata 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

aacactggca agttagcaat 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ccgtaataaa tagacaccc 19

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

gccgttttac gtttggaact g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ttatggaacg tcagtggagc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gtttcgctca tgtgttgagc 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

ggggatctgg attttagtac tg 22

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

gaatcctgtt gccggtcttg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

ttatcctagt ttgcgcgcta 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

ttatggcatt gggaaaactg t 21

<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

ggtcattaga ggccacgatt 20

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

ggtggatgtc ttgatagtgg gattgtgcgt catccc 36

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

ccacccacct taaggacagc tcttttccac gtt 33

<210> 28

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

cttgccagtg ttacttgcac cacaagggca ta 32

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

acgtaaaacg gcccgtaata aatagacacc c 31

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

catgagcgaa acttatggaa cgtcagtgga gc 32

<210> 31

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

gcaacaggat tcggggatct ggattttagt actg 34

<210> 32

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

ccaatgccat aattatccta gtttgcgcgc ta 32