本發(fā)明涉及生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種彎曲假單胞菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：原油是未經(jīng)加工的石油，是天然有機(jī)物質(zhì)經(jīng)過(guò)地質(zhì)變遷而形成的一種粘稠的黑色或深棕色的液體或固體，一般情況下大多存在于地下或海底，且?guī)в写碳ば詺馕?，主要成分是碳?xì)湓咏Y(jié)合形成的鏈狀化合物，其對(duì)水體環(huán)境具有極大的危害。水環(huán)境中維持生命所需的最小溶解氧量約為2mg/L，石油或含油廢水排入水體后一方面會(huì)漂浮在水面上，阻隔氧氣的進(jìn)入，影響氣體交換，另一方面部分靠石油提供碳源繁殖的微生物也會(huì)消耗氧氣，導(dǎo)致水中溶解氧的缺乏。同時(shí)又會(huì)使厭氧生物迅速繁殖使水體水質(zhì)惡化。同時(shí)芳香烴類化合物產(chǎn)生的毒性也影響藻類的生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)食物鏈造成影響。此外，石油中的有毒成分也會(huì)影響水生生物的生長(zhǎng)繁殖，它會(huì)沾附在魚(yú)鰓上使其窒息死亡或影響其卵化，多環(huán)芳烴會(huì)破壞水生生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，當(dāng)存在極低的濃度的多環(huán)芳烴時(shí)，魚(yú)類都會(huì)產(chǎn)生魚(yú)臭味，直接影響了魚(yú)類的正常生存，嚴(yán)重破壞了水環(huán)境中水生生物的多樣性。目前，對(duì)石油污染的水體的修復(fù)技術(shù)主要有物理修復(fù)技術(shù)、化學(xué)修復(fù)技術(shù)、光催化修復(fù)技術(shù)和生物修復(fù)技術(shù)；生物修復(fù)技術(shù)是一個(gè)具有政策、經(jīng)濟(jì)和技術(shù)吸引力的處理方法，被認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)方法，并且逐步發(fā)展成為一種經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益俱佳的、解決復(fù)雜環(huán)境污染問(wèn)題的最有效的手段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種彎曲假單胞菌，該菌種可用于降解修復(fù)原油污染水體。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。提供一種可用于降解原油污染水體的彎曲假單胞菌，將該菌種直接投加入污染水體中，達(dá)到較好的降解效果，實(shí)現(xiàn)原油污染的治理。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。(一)一種彎曲假單胞菌，已于2016年09月12日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.13004；命名為彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3。將所述彎曲假單胞菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌株3在牛肉膏蛋白胨的平板上起初呈淡黃色，隨著菌齡的增加，顏色越來(lái)越深，最后呈黃色。該菌落特征為針尖大小的淡黃色菌落，呈規(guī)則圓形，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，革蘭氏染色后，不易著色。菌體細(xì)胞呈短桿、棒狀，大小為(1-1.5)μm×0.5μm，為革蘭氏陰性菌。所述彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3的16SrDNA測(cè)序結(jié)果如SEQIDNo.1所示。(二)一種彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3在降解原油污染水體中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的彎曲假單胞菌不但易于規(guī)?；a(chǎn)，而且降解效率高，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)。所提供的彎曲假單胞菌能在大量有機(jī)物存在的條件下順利生長(zhǎng)，以原油為碳源，達(dá)到較好的降解效果。該菌能在原油濃度達(dá)1mL/100mL的原油污染水體中體現(xiàn)出較優(yōu)的降解效果，實(shí)現(xiàn)原油污染水體的修復(fù)處理，在原油污染廢水的生物修復(fù)中展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1為本發(fā)明的彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)圖；圖2為本發(fā)明的彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3在顯微鏡下的的菌體形態(tài)圖，圖中，放大倍數(shù)為1000倍；圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中I號(hào)原油的波長(zhǎng)-吸光度曲線圖；圖中，橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，單位為nm，縱坐標(biāo)為吸光度，單位為1；圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中I號(hào)原油的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖中，橫坐標(biāo)為濃度，單位為mg/L，縱坐標(biāo)為吸光度，單位為1。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1菌株的分離純化(1)菌株來(lái)源本發(fā)明提供一種彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3，分離自延長(zhǎng)石油集團(tuán)的七里洞采油場(chǎng)集油站落地原油污染土壤中，土壤的理化性質(zhì)為：銨態(tài)氮15.09ppm，硝態(tài)氮0.72ppm；氮含量15.81ppm，磷含量82.05ppm，鉀含量17.45ppm，有機(jī)質(zhì)含量1.43％，pH為7.65。(2)菌株的分離純化將10g石油污染土壤樣品加入100mL富集液體培養(yǎng)基中，28℃、130r/min搖床培養(yǎng)7d。待培養(yǎng)液混濁后，吸取5mL培養(yǎng)液重新轉(zhuǎn)接入新鮮富集培養(yǎng)基中，與上述培養(yǎng)條件相同連續(xù)轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)3次。取1mL上述菌懸液，用無(wú)菌水系列稀釋后，分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，29℃左右恒溫培養(yǎng)3d。其中，富集液體培養(yǎng)基的成分為：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸餾水1000mL，原油I號(hào)1％(體積比)，pH7.0。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的成分為：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，營(yíng)養(yǎng)瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH7.4-7.6。待平板菌落有效分離后，根據(jù)菌落顏色、形態(tài)特征及表面濕度的不同，分別用接種針挑選菌落進(jìn)行平板劃線純化分離。將菌株接種于斜面，4℃冰箱冷藏備用。(3)溶油圈法篩選石油降解菌將上述菌種接種于含油無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-15d，觀察有無(wú)嗜油圈，并根據(jù)嗜油圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值初步確定菌株的石油降解能力；其中，含油無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基的成分為NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸餾水1000mL，原油I號(hào)1％(體積比)。將初步篩選的石油降解菌接種于斜面培養(yǎng)基，4℃冰箱冷藏備用。實(shí)施例2菌株的鑒定(1)菌株的形態(tài)特征如圖1所示，將所述彎曲假單胞菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)，菌株3起初呈淡黃色，隨著菌齡的增加，顏色越來(lái)越深，最后呈黃色。該菌落特征為針尖大小的淡黃色菌落，呈規(guī)則圓形，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，革蘭氏染色后，不易著色。如圖2所示，菌體細(xì)胞呈短桿、棒狀，大小為(1-1.5)μm×0.5μm，為革蘭氏陰性菌。(2)生化特性根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)彎曲假單胞菌進(jìn)行生理生化鑒定，鑒定結(jié)果如表1所示。表1彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3的菌株生理生化鑒定結(jié)果指標(biāo)特性革蘭氏染色—葡糖糖+麥芽糖+淀粉水解—M.P(甲基紅)試驗(yàn)—硫化氫—硝酸鹽還原—氧化酶+吲哚+V.P(乙酰甲基甲醇)試驗(yàn)—接觸酶+過(guò)氧化氫酶+明膠液化+注：“—”表示反應(yīng)為陰性；“+”表示反應(yīng)為陽(yáng)性(3)菌株的16SrDNA鑒定用DNA提取試劑盒提取彎曲假單胞菌3的基因組DNA，然后進(jìn)行16SrDNA基因克隆、測(cè)序，其16SrDNA測(cè)序結(jié)果如SEQIDNo.1所示，具體如下：之后在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，與其序列相似度達(dá)到98.56％均為彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)，將其歸屬為單胞菌類并命名為彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3。實(shí)施例3彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3對(duì)原油污染水體的降解試驗(yàn)方法：(1)彎曲假單胞菌3菌懸液的制備在無(wú)菌條件下，挑取分離純化獲得的石油降解菌，接種于100mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，搖床擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)48h；其中，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的成分是：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，營(yíng)養(yǎng)瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH7.4-7.6。pH值用1mol/L的氫氧化鈉或1mol/L氯化氫調(diào)至要求值。培養(yǎng)基滅菌條件是：溫度為121～126℃，時(shí)間為25min。(2)I號(hào)原油最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定石油及其產(chǎn)品在紫外光區(qū)有一定的吸收特征，石油組分中帶有苯環(huán)的芳香族化合物波長(zhǎng)一般為250～260nm，而帶有共軛雙鍵的化合物波長(zhǎng)一般在215～230nm之間，有研究表明，在使用紫外分光光法測(cè)定時(shí)，255nm左右為原油和重質(zhì)油的選擇范圍，225nm左右與為輕質(zhì)油及煉油廠的油品的選擇范圍。在100mg/L濃度下，依據(jù)獲得的波長(zhǎng)與吸光度數(shù)據(jù)，繪制供試I號(hào)原油的波長(zhǎng)-吸光度曲線如圖3所示，其中，I號(hào)原油采自延長(zhǎng)石油集團(tuán)七里洞采油場(chǎng)集油站，密度為0.65g/mL。(3)I號(hào)原油標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取0、2、2.5、5、6、7mgI號(hào)原油于50mL比色管中，用石油醚定容，此時(shí)的濃度分別為0、40、50、100、120、140mg/L，在258nm波長(zhǎng)下，以石油醚為參比溶液，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)濃度的吸光度，橫坐標(biāo)為濃度(mg/L)，縱坐標(biāo)為吸光度，繪制I號(hào)原油的濃度(mg/L)-吸光度(A)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。(4)原油降解率的測(cè)定取擴(kuò)大培養(yǎng)的彎曲假單胞菌3菌懸液3mL，接種于100mL含油無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的成分是：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸餾水1000mL，原油1.5mL，pH7.0；在30℃，120rpm恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)7d。培養(yǎng)液用5:1(V/V)的硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值為2-3，加入甲醇2-4mL，用3×15mL的石油醚(60-90℃)萃取三次，萃取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后轉(zhuǎn)入50mL容量瓶并定容。將石油醚萃取液經(jīng)系列稀釋后，以石油醚為參比，通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定其相應(yīng)的吸光度，根據(jù)I號(hào)原油的濃度(mg/L)-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定石油醚提取液相應(yīng)樣品的濃度，依據(jù)濃度計(jì)算降解效率。原油降解率的計(jì)算方法參考以下公式：η(％)＝(1-Ct/Co)×100％其中：η-原油降解率；Ct-菌株存在下原油濃度；Co-對(duì)照原油濃度。按照上述計(jì)算公式計(jì)算得彎曲假單胞菌3-1對(duì)原油污染水體的降解率為71.24％。雖然，本說(shuō)明書(shū)中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。SEQUENCELISTING<110>長(zhǎng)安大學(xué)<120>一種彎曲假單胞菌及其應(yīng)用<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1319<212>DNA<213>彎曲假單胞菌（Pseudomonasgeniculata）3<400>1AGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAA60TCTACTCTGTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACG120GGTGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTA180GTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAG240CCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGG300ACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTA360AAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCTGGCTAATACCCGGTTGGGATGACGGTACCC420AAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCG480TTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAG540CCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAGTGTGGTAGAGGGTA600GCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCATGGCGAAG660GCAGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTA720GATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCAC780GCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAA840CTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAA900CGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTCCAGAGATGGATGGGTGCCT960TCGGGAACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGG1020TTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACT1080CTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGC1140CCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCG1200ACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCC1260ATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGG1319當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3