本發(fā)明涉及致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株EF0591基因缺失株及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腸球菌是人類和動(dòng)物腸道的正常菌群重要成員，但近年來(lái)醫(yī)學(xué)臨床研究已證實(shí)了腸球菌的致病性。在需氧革蘭陽(yáng)性球菌中，它是僅次于葡萄球菌的重要的院內(nèi)感染致病菌。美國(guó)醫(yī)院感染監(jiān)視系統(tǒng)(NISS)已將其列為引起醫(yī)院感染的第二大病原菌，其中糞腸球菌和屎腸球菌在臨床分離率最高。研究表明腸球菌致病除了其耐藥性以外，更重要的是其攜帶眾多的毒力因子。目前已發(fā)現(xiàn)的毒力因子包括膠原蛋白黏附素(ace)、心內(nèi)膜炎抗原(efa)、溶血素激活因子(cylA)、明膠酶(gelE)、聚合物質(zhì)(asa1和asa373)、表面蛋白(esp)、兩種新推測(cè)的表面蛋白(EF0591和EF3314)等十余種。在全世界范圍內(nèi)雖然投入大量的人力和物力，但腸球菌的致病機(jī)制還不清楚。因此毒力因子的詳細(xì)研究是闡明腸球菌獨(dú)特致病機(jī)制的關(guān)鍵。在獸醫(yī)臨床中，腸球菌感染的研究處于起步階段，只有一些由腸球菌引起畜禽感染的臨床報(bào)道，均缺乏深入系統(tǒng)的研究。近年來(lái)，新疆北疆部分地區(qū)發(fā)生以神經(jīng)癥狀和敗血癥為主要特征的羔羊腦炎，引起大批羔羊死亡，從病死羔羊的大腦內(nèi)分離鑒定到了糞腸球菌，命名為XJ05。通過(guò)對(duì)XJ05全基因組精細(xì)圖的測(cè)定結(jié)果顯示該菌共有3412個(gè)預(yù)測(cè)基因，在這些基因除了已經(jīng)研究和發(fā)現(xiàn)的與致病有關(guān)的基因外是否還存在其他的致病的基因還不得而知。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05(E.faecalis XJ05)株EF0591基因缺失株(E.faecalis XJ05-△0591)的制備方法，主要目的是提供一種致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株EF0591基因缺失株。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明主要提供如下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株EF0591基因缺失株，其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2016503。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株EF0591基因缺失株的制備方法，包括如下步驟：

致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05培養(yǎng)及基因組DNA提取；

根據(jù)EF0591基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增及回收純化；

將提取的pTX4577質(zhì)粒用Kpn I與Sal I進(jìn)行雙酶切，用膠回收試劑盒回收pTX4577載體大片段，用T4連接酶與回收的純化目的片段過(guò)夜連接；連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化成功的重組細(xì)菌能在LK平板上生長(zhǎng)；挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落，LK液體培養(yǎng)基增菌后，提取質(zhì)粒用Kpn I與Sal I雙酶切，經(jīng)電泳鑒定正確后，將重組質(zhì)粒測(cè)序，重組質(zhì)粒命名為pTX4577-△0591；

采用電轉(zhuǎn)化的方法將重組穿梭質(zhì)粒pTX4577-△0591轉(zhuǎn)化入新鮮制備的E.Faecalis XJ05感受態(tài)細(xì)菌中，重組后的細(xì)菌用含有pTX4577質(zhì)粒的T7啟動(dòng)子上部分序列(GTAATACGACTCACTATAGGGC)作為上游引物，用插入片段的下游序列(ATTTATAAAAATGGTATTGAA)作為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；成功構(gòu)建致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株EF0591基因缺失株(E.faecalis XJ05-△0591)。

作為優(yōu)選，致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05接種在BHI固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，5000rpm/min離心5min，取沉淀按細(xì)菌基因組DNA小量抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。

作為優(yōu)選，根據(jù)EF0591基因序列設(shè)計(jì)引物EF0591C1(GAAAACAAGAAATCCTGAA)和EF0591C2(CCGATAATTACTGATGCTG)，并在引物EF0591C1(GAAAACAAGAAATCCTGAA)引入內(nèi)切酶Kpn I的酶切位點(diǎn)，在EF0591C2(CCGATAATTACTGATGCTG)引入內(nèi)切酶Sal I的酶切位點(diǎn)；以提取的DNA為模板，以EF0591C1和EF0591C2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性90s，58℃退火90s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán),最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min；反應(yīng)結(jié)束后，電泳進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定正確后按膠回收試劑盒提供的步驟進(jìn)行片段回收。

制備電轉(zhuǎn)化用E.faecalis XJ05感受態(tài)細(xì)胞的具體步驟如下；

挑取糞腸球菌單個(gè)菌至BHI(腦心浸液肉湯)-蔗糖培養(yǎng)液中37℃輕微振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，BHI和蔗糖的質(zhì)量比為1:2；

將菌液于分裝于離心棄上清，沉淀用電擊轉(zhuǎn)化緩沖液重懸，冰浴后4℃，4000g離心15分鐘，重復(fù)一次；

棄上清，沉淀用管內(nèi)殘留的電擊轉(zhuǎn)化緩沖液懸浮，將受體菌分裝于eppendorf管中，置于冰浴中立即使用或-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

作為優(yōu)選，電轉(zhuǎn)化的具體步驟如下；

加重組穿梭質(zhì)粒pTX4577-△0591到E.Faecalis XJ05感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻?qū)⑵滢D(zhuǎn)移到預(yù)先處理過(guò)的電轉(zhuǎn)杯中；

調(diào)整電轉(zhuǎn)儀為1.5kv，5ms，電擊3次，完畢后立刻加入1ml BHI培養(yǎng)基，37℃放置60min；

8000r/min離心5min，棄上清，將剩余細(xì)菌吹打后均勻涂布于含卡那霉素的BHI平板上，37℃溫箱中培養(yǎng)24h；

待平板上長(zhǎng)出單個(gè)菌落后，挑取單菌落到BHI液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素10μg/mL)，然后37℃條件下?lián)u床中培養(yǎng)24h。

作為優(yōu)選，構(gòu)建致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株EF0591基因缺失株時(shí)PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸l0min。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株EF0591基因缺失株在確定表面蛋白EF0591在糞腸球菌XJ05在導(dǎo)致羔羊腦發(fā)生中的作用中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述應(yīng)用為細(xì)胞黏附、侵染能力確定中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述應(yīng)用為生物被膜形成能力確定中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述應(yīng)用為毒力確定中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明實(shí)施例通過(guò)構(gòu)建E.faecalis XJ05-△0591，確定表面蛋白EF0591能增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)Hela細(xì)胞黏附、增強(qiáng)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的侵染能力以及使小鼠臟器載菌增加，同時(shí)能明顯增強(qiáng)XJ05株生物膜的形成能力，使小鼠LD50 升高一個(gè)數(shù)量級(jí)，進(jìn)一步確定了EF0591基因功能，進(jìn)而闡述表面蛋白EF0591在糞腸球菌XJ05在導(dǎo)致羔羊腦發(fā)生中的作用，同時(shí)也為動(dòng)物腸球菌感染機(jī)制的研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

保藏說(shuō)明

本發(fā)明實(shí)施例的致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株EF0591基因缺失株已于2016年9月20日由位于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2016503，分類命名為糞腸球菌XJ05-△0591(Enterococcus faecalis XJ05-△0591)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施中插入片段擴(kuò)增結(jié)果；

圖2為本發(fā)明實(shí)施中pTX4577-Δ0591酶切結(jié)果；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中E.faecalis XJ05-Δ3813突變株鑒定結(jié)果；

圖4為E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591在1h和2h黏附HeLa細(xì)胞的數(shù)量；

圖5為E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591侵染小鼠巨噬細(xì)胞后的細(xì)菌數(shù)；

圖6a至圖6e分別為E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591在小鼠心臟、腦組織、左腎、肝小葉及脾臟的載菌量；

圖7為E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591形成生物膜的OD595；

圖8A至圖8H分別為E.Faecalis XJ05和E.Faecalis XJ05-Δ0591在不同時(shí)間形成的生物膜；

圖9A至圖9F分別為E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591不同時(shí)間的多糖形成量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。在下述說(shuō)明中，不同的“一實(shí)施例”或“實(shí)施例”指的不一定是同一實(shí)施例。此外，一或多個(gè)實(shí)施例中的特定特征、結(jié)構(gòu)、或特點(diǎn)可由任何合適形式組合。

本發(fā)明實(shí)施例中所需原料來(lái)源如下：致羔羊腦炎糞腸球菌E.faecalis XJ05由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室從發(fā)生羔羊腦炎病羊大腦中分離鑒定得到并提供。Taq plus DNA聚合酶、dNTP Mix購(gòu)自上海東盛公司；pfu taq酶購(gòu)自康為公司，瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購(gòu)自諾維森公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天庚公司；限制性內(nèi)切酶(KpnI和SalI)購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)公司；甘氨酸、氨芐青霉素和卡那霉素、溶菌酶購(gòu)自promega公司；試劑BHI培養(yǎng)基購(gòu)自BD公司。

致羔羊腦炎糞腸球菌E.Faecalis XJ05株EF0591基因缺失株(E.faecalis XJ05-△0591)的制備方法，具體步驟如下：

1)E.faecalis XJ05培養(yǎng)及基因組DNA提取

E.faecalis XJ05接種在BHI固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；5000rpm/min離心5min，取沉淀按細(xì)菌基因組DNA小量抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。

2)設(shè)計(jì)引物，EF0591基因插入片段的PCR擴(kuò)增及回收純化

根據(jù)EF0591基因序列設(shè)計(jì)引物EF0591C1(GAAAACAAGAAATCCTGAA)和EF0591C2(CCGATAATTACTGATGCTG)，在引物EF0591C1(GAAAACAAGAAATCCTGAA)引入內(nèi)切酶Kpn I的酶切位點(diǎn)，在引物EF0591C2(CCGATAATTACTGATGCTG)引入內(nèi)切酶Sal I的酶切位點(diǎn)，以DNA試劑盒提取的的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性90s，58℃退火90s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，電泳進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定正確后按膠回收試劑盒提供的步驟進(jìn)行片段回收(見(jiàn)圖1，圖中，M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、4、5為插入片段)。

3)pTX4577-△0591的構(gòu)建

將提取的pTX4577質(zhì)粒(大理學(xué)院吳利先教授提供，也可商業(yè)購(gòu)得)用Kpn I與Sal I進(jìn)行雙酶切，用膠回收試劑盒回收pTX4577載體大片段，用T4連接酶與2中純化目的片段過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化成功的重組細(xì)菌能在LK平板上生長(zhǎng)。挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落，LK液體培養(yǎng)基增菌后，提取質(zhì)粒用Kpn I與Sal I雙酶切，經(jīng)電泳鑒定正確后，將重組質(zhì)粒測(cè)序。重組質(zhì)粒命名為pTX4577-△0591(見(jiàn)圖2，圖 中為DNA Marker，1-3為pTX4577-Δ0591雙酶切結(jié)果)。

4)電轉(zhuǎn)化用E.faecalis XJ05感受態(tài)細(xì)胞的制備

(1)挑取糞腸球菌單個(gè)菌BHI培養(yǎng)液至l新鮮配制的BHI 2蔗糖培養(yǎng)液中37℃輕微振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；

(2)將菌液于分裝于離心棄上清，沉淀用電擊轉(zhuǎn)化緩沖液重懸，冰浴后4℃，4000g離心15分鐘，重復(fù)一次；

(3)棄上清，沉淀用管內(nèi)殘留的電擊轉(zhuǎn)化緩沖液(約原菌液的體積的1％)懸浮將受體菌分裝于eppendorf管中，置于冰浴中立即使用或-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

5)電轉(zhuǎn)化

采用電轉(zhuǎn)化的方法將重組穿梭質(zhì)粒pTX4577-△0591轉(zhuǎn)化入新鮮制備的E.faecalis XJ05感受態(tài)細(xì)胞中，具體如下：

(1)加重組穿梭質(zhì)粒pTX4577-△0591到E.faecalis感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻?qū)⑵滢D(zhuǎn)移到預(yù)先處理過(guò)的電轉(zhuǎn)杯中；

(2)調(diào)整電轉(zhuǎn)儀為1.5kv，5ms，電擊3次，完畢后立刻加入1ml BHI培養(yǎng)基，37℃放置60min；

(3)8000r/min離心5min，棄上清將剩余細(xì)菌吹打后均勻涂布于含卡那霉素的BHI平板上，37℃溫箱中培養(yǎng)24h；

(4)待平板上長(zhǎng)出單個(gè)菌落后，挑取單菌落到BHI液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素10μg/mL)，然后37℃條件下?lián)u床中培養(yǎng)24h。

6)同源重組株的鑒定

取上述菌液，用含有pTX4577質(zhì)粒的T7啟動(dòng)子上部分序列(GTAATACGACTCACTATAGGGC)作為上游引物，用插入片段的下游序列(ATTTATAAAAATGGTATTGAA)作為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸l0min(見(jiàn)圖3，圖中M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為突變株P(guān)CR產(chǎn)物)。成功構(gòu)建致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株EF0591基因缺失株(E.faecalis XJ05-△0591)。

按照上述實(shí)施例進(jìn)行多次重復(fù)操作均能得到本發(fā)明實(shí)施例的目的菌株(E.faecalis XJ05-△0591)。

本發(fā)明實(shí)施例中的致羔羊腦炎糞腸球菌E.faecalis XJ05可由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院提供，也可從發(fā)生羔羊腦炎病羊大腦中分離得到。

下面通過(guò)上述實(shí)施例得到的致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株EF0591基因缺失株確定表面蛋白EF0591在糞腸球菌XJ05在導(dǎo)致羔羊腦發(fā)生中的作用，確定了EF0591基因功能，同時(shí)也為動(dòng)物腸球菌感染機(jī)制的研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

細(xì)胞黏附、侵染能力

向培養(yǎng)好的HeLa細(xì)胞中加入菌懸液孵育一定時(shí)間，裂解細(xì)胞后進(jìn)行計(jì)數(shù)，以野毒株為對(duì)照，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4，圖4為E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591在1h和2h黏附HeLa細(xì)胞的數(shù)量。從圖4可以看出，E.faecalis XJ05-△0591對(duì)HeLa細(xì)胞黏附數(shù)量下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異顯著(P＜0.05)。

向培養(yǎng)好的RAW264.7細(xì)胞中加入菌懸液，培養(yǎng)一定時(shí)間，裂解細(xì)胞后進(jìn)行計(jì)數(shù)，0小時(shí)、3小時(shí)和24小時(shí)的結(jié)果見(jiàn)圖5。通過(guò)圖5可以發(fā)現(xiàn)本發(fā)明實(shí)施例得到的突變株對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞的侵染數(shù)量明顯下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異顯著(P＜0.05)。

將制備好的菌懸液腹腔注射小鼠，在不同時(shí)間取小鼠腦組織、心臟、左腎肝小葉和脾臟進(jìn)行勻漿計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖6a至圖6e。結(jié)果顯示E.faecalis XJ05-△0591在小鼠肝小葉、心臟、脾臟和腎臟中的載菌量下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異顯著(P＜0.05)；在腦組織中細(xì)菌數(shù)量有變化，但差異不顯著。

通過(guò)上述試驗(yàn)可以看出，E.faecalis XJ05-△0591細(xì)胞黏附、侵染能力下降，小鼠臟器載菌量升高。

生物被膜形成能力

E.faecalis XJ05-△0591及E.faecalis XJ05親本株分別在相同條件下培養(yǎng)，結(jié)晶紫染色后測(cè)其不同時(shí)間點(diǎn)的OD595值，結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果顯示各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生物膜形成量都明顯低于E.faecalis XJ05親本株，且差異顯著(P＜0.05)。

將突變株和野毒株置于放有細(xì)胞爬片的六孔板中培養(yǎng)，分別用結(jié)晶紫和FITC-ConA及PI染液染色，在光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)的生物膜。光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)E.faecalis XJ05形成的生物膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較多，形態(tài)較致密，膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)也更多。結(jié)果見(jiàn)圖8和圖9， 其中圖8A至圖8H分別為E.Faecalis XJ05和E.Faecalis XJ05-Δ0591在不同時(shí)間形成的生物膜；圖9A至圖9F分別為E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591不同時(shí)間的多糖形成量。圖8中，圖8A至圖8D分別為E.Faecalis XJ05在12h、24h、36h和48h形成的生物膜；圖8E至圖8H分別為E.Faecalis XJ05-Δ0591在12h、24h、36h和48h形成的生物膜。圖9中，圖9A至圖9C分別為E.Faecalis XJ05在12h、24h和72h的多糖形成量；圖9D至圖9F分別為E.Faecalis XJ05-Δ0591在12h、24h和72h的多糖形成量。

通過(guò)上述試驗(yàn)可以看出，E.faecalis XJ05-△0591生物被膜形成能力的下降。

E.faecalis XJ05-△0591LD50的測(cè)定

取體重為18-20g的健康鼠36只，隨機(jī)分為6組,每組6只，其中1-5組按10倍梯度接種E.faecalis XJ05-△0591(2*10¹²-2*10⁹)cfu菌液，腹腔接種，第6組為空白對(duì)照組。重復(fù)測(cè)定一次。根據(jù)10d內(nèi)死亡比例,按Reed-Munch法計(jì)算2次試驗(yàn)測(cè)定的平均值，LD50為5.47*10¹¹cfu。比原始菌株XJ05的LD50高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，即E.faecalis XJ05-△0591毒力下降。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。

序列表

<110> 石河子大學(xué)

<120>致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05株EF0591基因缺失株及其制備方法和應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF0591C1

<400>1

GAAAACAAGA AATCCTGAA 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF0591C2

<400>2

CCGATAATTA CTGATGCTG 19