本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體涉及一株星箭頭菌SCSIO 43502及其在制備促生固氮菌肥中的應用。

背景技術：
：

珊瑚島礁是由造礁珊瑚的碳酸鈣骨骼和其他生物碎屑堆積發(fā)育而成的一種特殊的生態(tài)系統(tǒng)，具有極高的生產(chǎn)力和生物多樣性，因此被譽為“海洋中的熱帶雨林”和“藍色沙漠中的綠洲”。然而由于全球氣候變化和人類活動的影響，全球上處于衰退狀態(tài)，據(jù)估算目前全球約有10％的珊瑚礁已經(jīng)遭到不可逆轉(zhuǎn)的嚴重破壞，約50％的珊瑚礁處于接近崩潰的邊緣，其中東南亞地區(qū)珊瑚的退化問題更為嚴重，該區(qū)域約95％的珊瑚生存受到威脅，如果衰退情況持續(xù)，截止到2030年，全球?qū)⒂屑s90％的珊瑚的生長受到嚴重的影響，而到2050年，全球所有的珊瑚都將處于危險狀態(tài)(Bellwood et al.,2004；Kleypas et al.,2005；Burke et al.,2011)。

島礁生態(tài)系統(tǒng)的海草可以作為先鋒植物在珊瑚礁衰退區(qū)域，從緩慢生長到形成良好的生態(tài)體系統(tǒng)，從而抑制了珊瑚礁底質(zhì)的流失和珊瑚大面積衰退會進一步引起大規(guī)模的死亡，防止島礁的三維立體結構的坍塌，阻止了海洋生態(tài)平衡造成生物多樣性的喪失。島礁生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力通常受到氮素限制，而海草之所以能夠在島礁生態(tài)系統(tǒng)中生長主要得益于其共附生的固氮微生物，如固氮細菌和固氮藍藻等，它們可以通過進行生物固氮作用為生態(tài)系統(tǒng)提供新氮源，從而一定程度上減緩了氮限制，促進海草生長；此外，固氮微生物還可以產(chǎn)生如植物生長調(diào)節(jié)劑、氨基酸和多糖等活性物質(zhì)來促進海草生長(Lambers,Mougel,Jaillard,&Hinsinger,2009)。

Patriquin(1972)發(fā)現(xiàn)南美洲三種泰來藻生長所需要氮素全部是由根際沉積物中的固氮微生物所提供的；而在澳大利亞的卡奔塔利亞灣生物固氮作用能夠滿足大葉藻氮素需求的約50％(O’Donohue et al.,1991)。通過生物固氮作用提供的氮素供給海草植株生長，形成能夠有效地促進島礁生態(tài)系統(tǒng)的修復，固氮菌肥的制作和研究方面在其他生態(tài)系統(tǒng)中都有較多研究，而目前尚未報道。

技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個目的是提供一株從中國海南省三沙市島礁生態(tài)系統(tǒng)海草喜鹽草(Halophila ovalis)根際分離獲得的，具有較高的固氮生物活性的星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502，該菌于2016年9月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏編號：CCTCC NO：M 2016504。

根據(jù)乙炔還原法(Acetylene Reducing Activity,ARA)，應用氣相色譜儀測定星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502固氮活性，研究結果顯示星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO43502具有較高的固氮活性，為343±13.57nmol C₂H₄/h/mL。

將星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的發(fā)酵液加入到海草培養(yǎng)體系中海草的根部，發(fā)現(xiàn)其對海草植株的葉綠素含量、根長、株高和生物量等具有較好的促進作用，對其具有很好的促生作用。

因此，本發(fā)明的第二個目的是提供星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502在制備促生固氮菌肥中的應用。

本發(fā)明的第三個目的是提供星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502在保護和修復海草生態(tài)系統(tǒng)中的應用。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種促生固氮菌肥，其特征在于，以上述的星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502作為活性成分。

本發(fā)明的第五個目的是提供上述的促生固氮菌肥的制備方法，其特征在于，將星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得促生固氮菌肥。

具體步驟為：將星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502接種到選擇性液體無氮液體改良培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，即得促生固氮菌肥；所述的選擇性液體無氮液體改良培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有NaCl 25g，KCl 0.56g，MgSO₄·7H₂O 4.8g，MgCl₂·6H₂O 4.0g，K₂HPO₄ 0.01g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.001g，Tris 0.48g，蛋白胨4.0g，酵母提取物2.0g，甘油2.0mL，余量為水，pH為8.2。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明從珊瑚島礁生態(tài)系統(tǒng)中海草喜鹽草根際中分離篩選到一株星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502，其具有良好的固氮活性、促進海草生長的特性以及抵抗海水酸化的能力，由此該星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502在海洋微生物肥料制備方面和在島礁生態(tài)保護和修復方面具較高的價值以及廣闊的應用前景。

星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502于2016年9月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏編號：CCTCC NO：M2016504。

附圖說明：

圖1是星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的16S rDNA的系統(tǒng)進化發(fā)育樹，圖中的SCSIO 43502表示星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502；

圖2是星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的nifH的系統(tǒng)進化發(fā)育樹，圖中的SCSIO43502表示星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的分離、純化和鑒定

1、星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的分離和純化

樣品采集時間為2015年6月，從中國海南省三沙市珊瑚島礁生態(tài)系統(tǒng)中海草喜鹽草根際，分離純化得到細菌SCSIO 43502。

2、星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502的鑒定

1)形態(tài)學鑒定：光學顯微鏡下，挑取培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的細菌SCSIO 43502置于載玻片上，通過蓋玻片加以固定，進行觀察。本實施例中獲得的細菌SCSIO 43502，為直桿狀，革蘭氏陰性菌，不形成孢子，在靜止期易形成玫瑰狀的花結和聚集、圓形、邊緣凸起，顏色為淡奶油色。

2)細菌固氮活性的測定

本實施例細菌的固氮酶活性采用氣相色譜儀測固氮菌的乙炔還原活性(Acetylene Reducing Activity,ARA)(參考Capone 1993，Capone DG(1993)Determination of nitrogenase activity in aquatic samples using the acetylene reduction procedure.Aquatic Microbial Ecology,621-631)。

本實施例分實驗組和空白對照組。

實驗組：分離純化得到的細菌SCSIO 43502，將該其接種于100mL選擇性液體無氮液體改良培養(yǎng)基內(nèi)，溫度為28℃，200rpm培養(yǎng)12h達到對數(shù)期后，取2mL于滅菌的10mL小瓶中，蓋上橡皮塞，瓶蓋邊緣以石蠟封口，用注射器將1mL的乙炔注入10mL小瓶中，于30℃反應7h，然后取20μL反應后氣體，待測；每個實驗組設三個重復。

所述的選擇性液體無氮液體改良培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有NaCl 25g，KCl 0.56g，MgSO₄·7H₂O 4.8g，MgCl₂·6H₂O 4.0g，K₂HPO₄ 0.01g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.001g，Tris 0.48g，蛋白胨(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)4.0g，酵母提取物2.0g，甘油2.0mL，余量為蒸餾水，pH為8.2(Garriet W Smith,1992)。固體培養(yǎng)基中加入2％的Agar，其中液體培養(yǎng)基采用0.22μm濾膜抽濾滅菌，固體培養(yǎng)基采用高溫高壓滅菌。

空白對照組：對照容器中加入乙炔氣體但是不加入細菌，其他同實驗組。

所有樣品用氣相色譜檢測乙烯的生成量。本實施例分離純化得到的純菌株細菌SCSIO43502可以利用N₂作為氮源，且具有較高的生物固氮活性，純培養(yǎng)條件下平均固氮活性為343±13.57nmol C₂H₄/h/mL。

實施例2：菌株的16SRNA和固氮基因擴增

選擇實施例1分離純化得到的細菌SCSIO 43502純培養(yǎng)物進行DNA提取和純化，本實施例DNA的提取與純化，其操作方法參考東秀珠《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》P₄₀₉。采用細菌的16S 27F/1492R(Weisenburg et al.,1991，16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.，Journal of bacteriology，1991 173(2):697-703和nifH基因通用引物PolF/PolR(參考Poly et al.,2001，Comparison of nifH Gene Pools in Soils and Soil Microenvironments with Contrasting Properties，Applied and Environmental Microbiology,2001，67(5)：2255-2262)分別進行PCR擴增，PCR反應體系如表1所示。

表1 PCR反應體系

PCR反應條件為：預變性95℃5min；變性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃40s，共30個循環(huán)；后延伸72℃10min。取2μL PCR反應產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若有目的條帶的出現(xiàn)，則將剩余的PCR產(chǎn)物直接交與華大基因用ABI Prism 3730XL DNA分析系統(tǒng)測序，并將測序分析得到的16S rDNA(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和固氮基因序列nifH(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)通過應用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，對其種屬鑒定進行初步的分子生物學確定并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1和圖2所示，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出與細菌SCSIO 43502的16S rDNA序列具有較近親緣關系的序列均來自Sagittula屬，并且與已知菌種的星箭頭菌Sagittula stellata SBW140(Genebank登陸號為：KC534335.1)的16S rDNA序列具有99％的相似性，固氮基因與成團范菌Pantoea agglomerans G33-1相似度最高，僅為92％，該菌也來源珊瑚礁生境的海草根際，基于此將細菌SCSIO 43502命名為星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502，其于2016年9月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏編號：CCTCC NO：M 2016504。

實施例3：細菌發(fā)酵液對海草喜鹽草促生作用的有效性試驗

將用選擇性液體無氮液體改良培養(yǎng)基(配方同實施例1)，28℃振蕩過夜發(fā)酵培養(yǎng)后的星箭頭菌(S.stellata)SCSIO 43502菌液，待菌株充分生長后，利用紫外分光光度計測定各菌株懸浮液OD(optical density)值，當OD₆₆₀值0.6，分別取出20mL加入海草喜鹽草養(yǎng)殖缸內(nèi)海草根際(實驗組)，其中對照組中僅僅只加入20mL的超純水(CK組)，各三個重復，然后將其置于相同培養(yǎng)條件下，光暗周期12h:12h(光：暗周期)，光照強度200μE/m²/s，30℃培養(yǎng)，45天后，點數(shù)根的條數(shù)并且測量根的長度，結果如表2所示。

表2不同處理組的海草喜鹽草生理特性

注：“+”表示的升高

如表2所示，通過實驗組和對照組的生長45天后的實驗結果對比可以發(fā)現(xiàn)，實驗組的植株鮮重明顯高于對照組，顯示了星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502對喜鹽草的生長具有較好的促生效果；添加星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502后能夠顯著還提高水體的堿度，比對照組高出16％～58％，因而在一定程度上表明添加星箭頭菌(Sagittula stellata)SCSIO 43502后，可以在一定程度上抑制海水酸化對海洋生物的影響，因此能夠在對抗海洋酸化等方面中發(fā)揮重要作用，具有應用于海草生態(tài)系統(tǒng)保護和修復中的潛力。

序列表

<110> 中國科學院南海海洋研究所

<120> 一株星箭頭菌 SCSIO 43502及其應用

<160> 2

<210> 1

<211> 1288

<212> DNA

<213> 星箭頭菌（Sagittula stellata）SCSIO 43502

<400> 1

tgagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg aatgtgccct tctgttgagg atagccccgg 60

gaaactggga gtaatactcg atacgccctt agggggaagg aaggatcagc ccgcgtctga 120

ttaggtagtt ggtggggtaa tggcctacca agcctacgat cagtagctgg ttttagagga 180

tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgagga 240

atcttagaca atgggcgcaa gcctgatcta gccatgccgc gtgagtgatg aaggccttag 300

ggtcgtaaag ctctttcgcc agggatgata atgacagtac ctggtaaaga aaccccggct 360

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accgtaaacg atgaatgcca gtcgtcgggt tgcatgcaat tcggtgacac acctaacgga 720

ttaagcattc cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 780

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aacccacatc cttagttgcc agcagttcgg ctgggcactc tagggaaact gcccgtgata 1020

agcgggagga aggtgtggat gacgtcaagt cctcatggcc cttacgggtt gggctacaca 1080

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gtctgcaact cgaccccatg aagtcggaat cgctagtaat cgcgtaacag catgacgcgg 1200

tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt ggttctacct 1260

gacggccgtg cgctaacctt cgggaggc 1288

<210> 2

<211> 356

<212> DNA

<213> 星箭頭菌（Sagittula stellata）SCSIO 43502

<400> 2

ggattggctg atctgactcc aggcgcagga cacggtgctg cacctcgcgg ccgagatggg 60

ctccgtcgag gatctcgagc tggaagacgt gctgaagacc ggcttcaagg acatcaagtg 120

cgtcgagtcc ggcggtcccg agccgggcgt cggctgcgcc ggccgcggcg tcatcaccgc 180

catcaacttc ctcgaggaga acggcgccta cgatgacgtg gattacgtgt cctacgacgt 240

tctgggcgac gtggtctgcg gcggcttcgc catgccgatc cgcgaaaaca aggcacagga 300

aatctacatc gtcatgtccg gcgagatgat ggccatttat gccgccaaca ccataa 356