本發(fā)明涉及微生物分離與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種提高作物耐鹽能力促生菌株的篩選方法。
背景技術(shù)：
目前，隨著社會(huì)的發(fā)展和人口的增加，對(duì)耕地資源的需求越來越多。我國有鹽堿地9913萬公頃，其中環(huán)渤海70萬公頃，是重要的潛在耕地資源。鹽堿地的改良是國際性難題，世界各國都在努力尋找鹽堿地改良的科學(xué)方法，目前可應(yīng)有的方法有物理的改良技術(shù)，如以水壓鹽法，滲管排鹽以及一些耕作措施；化學(xué)的改良技術(shù)，如使用土壤改良劑；生物改良技術(shù)，利用微生物的促生作用，以提高植物耐鹽性和生物產(chǎn)量。其中物理方法并不適宜淡水資源匱乏的地區(qū)，使用土壤改良劑，材料用量大，受地方資源的限制，微生物由于成本低，繁殖快，可利用它們的促生、防病、抗衰老等作用，大幅度提高作物的耐鹽、抗旱性和生物產(chǎn)量，從而達(dá)到改善鹽堿地的目的。利用根際促生微生物提高鹽堿地作物耐鹽促生的方法具有投資少，見效快，效益高的特點(diǎn)，已經(jīng)成為國際上的研究熱點(diǎn)。但是根據(jù)發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)和相關(guān)報(bào)道，大部分菌株功能一般，效果不佳且或效果不穩(wěn)定，優(yōu)良菌株/菌系的高效率選方法顯得十分重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種提高作物耐鹽能力促生菌株的篩選方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了具有提高作物耐鹽能力促生菌株的篩選方法，包括以下步驟:
(1)篩選優(yōu)勢(shì)菌株；
(2)組合優(yōu)勢(shì)菌株。
步驟(1)是將重度鹽堿地上生長(zhǎng)的植物進(jìn)行原位采集后，將其根際土壤、非根際土壤和根系三個(gè)樣品進(jìn)行稀釋，培養(yǎng)基上培養(yǎng)并分離獲得的細(xì)菌菌株。
上述方法中，對(duì)分離獲得的細(xì)菌進(jìn)行耐鹽度，耐堿度，溶磷，固氮，和產(chǎn)IAA、ACCD、嗜鐵素耐鹽促生功能的檢測(cè)，篩選具有上述一個(gè)或多個(gè)優(yōu)勢(shì)功能的菌株。
上述方法中，功能檢測(cè)所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/3KMB培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基，所述1/3KMB培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨6g/L，蛋白胨1g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L pH7.0。所述的LB培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0。
其中，耐鹽度檢測(cè)是檢測(cè)并獲得在含氯化鈉0.1％-5％的培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)的菌株。
其中，酸堿度檢測(cè)是檢測(cè)并獲得在pH值為7.0-9.0的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)的菌株。
步驟(2)組合優(yōu)勢(shì)菌株是將步驟(1)篩選得到的具有一個(gè)或多個(gè)優(yōu)勢(shì)功能的菌株按照功能互補(bǔ)，協(xié)同共生的原則進(jìn)行組合。
本發(fā)明提供了一種促進(jìn)鹽堿地作物生長(zhǎng)的生物肥的制備方法，將上述篩選方法獲得的菌株與腐熟的有機(jī)肥混合，使混合后肥料的活菌數(shù)＞2×107CFU/g。
本發(fā)明提供了上述篩選方法在鹽堿地作物促生中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了上述篩選方法在篩選促生菌株或菌系中的應(yīng)用。
本發(fā)明方法通過一系列耐鹽促生功能篩選，最終獲得具有多種功能或優(yōu)勢(shì)功能的菌株，利用互利共生又功能互補(bǔ)的原則將菌株進(jìn)行合理組合，以提高菌株組合在作物根際的定殖和功能表達(dá)能力，實(shí)現(xiàn)一加一大于二的效果。通過該方法篩選獲得的復(fù)合菌系，在田間應(yīng)用效果突出，克服了同類研究因菌株單一或采用簡(jiǎn)單組合方法，田間應(yīng)用效果不穩(wěn)定和效果差的問題。
具體實(shí)施方式
除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
除有特別說明，本發(fā)明中用到的各種試劑、原料均為可以從市場(chǎng)上購買的商品或者可以通過公知的方法制得的產(chǎn)品。
實(shí)施例1重度鹽堿地植物根系細(xì)菌的分離及其促生功能檢測(cè)
將重度鹽堿地上生長(zhǎng)的植物進(jìn)行原位采集，裝入無菌樣品袋中，記錄釆樣的經(jīng)緯度、溫濕度以及采樣生境。輕柔搖蕩植株樣品，去除根上附著的松散土土壤即根圍土壤。稱取根圍土1g，加入5mL生理鹽水，渦旋震蕩器振蕩1min后獲得的土壤懸液，即為根圍土樣1。剪下根系，附帶一點(diǎn)莖干以使根系都在一起。將根系放在PA瓶中，加入5mL生理鹽水，在渦旋儀上最大頻率振蕩1min。該土壤懸液即為根際土樣2。隨后將根系轉(zhuǎn)移到新PA瓶中，進(jìn)行表面滅菌(95％乙醇浸泡5min，5％次氯酸鈉浸泡5min，無菌水洗滌12次)，然后用燒過的無菌鑷子將根轉(zhuǎn)移到研缽中，加入1ml生理鹽水和適量滅菌石英砂進(jìn)行研磨，用研缽碾碎后加入4mL生理鹽水溶解，該懸液即為根系樣3。上述獲得的3中樣品懸液振蕩均勻后，靜置1min后依次制成樣品1：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度的土壤稀釋液。樣品2：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度的土壤稀釋液。樣品3：10-1、10-2、10-3、10-4梯度的土壤稀釋液。將上述樣品1：10-3、10-4、10-5；樣品2：10-4、10-5、10-6；樣品3：10-2、10-3、10-4梯度的土壤稀釋液分別涂布到含氯化鈉濃度為5％以及pH8.0的基礎(chǔ)培養(yǎng)基1/3KMB平板上，每個(gè)平板涂布菌液100μL，重復(fù)2次。30℃倒置培養(yǎng)2d。最終將獲得的單菌落進(jìn)行保存待用。
實(shí)施例2提高鹽堿地作物生產(chǎn)性能優(yōu)良菌株/系和菌株組合篩選方法
將稀釋分離獲得的細(xì)菌菌株進(jìn)行活化后，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌2次后，重懸于1mL生理鹽水中待用。①準(zhǔn)備好含氯化鈉0％，5％，pH＝9.0的1/3KMB平板，CAS，有機(jī)磷，無機(jī)磷，阿須貝，ADF 8種平板，依次將每種菌懸液點(diǎn)到8種平板上，30℃倒置培養(yǎng)7d。②將重懸液按百分之一的接種量，接種到含有色氨酸終濃度為100mg/L的1/3KMB液體培養(yǎng)基中，30℃，48-72h培養(yǎng)。然后進(jìn)行IAA檢測(cè)(500μg/ml色氨酸)。記錄每株菌的促生結(jié)果，并整理成excel統(tǒng)計(jì)表。
依據(jù)生物功能互補(bǔ)，營養(yǎng)吸收互補(bǔ)，協(xié)同共生的原則，將多株功能菌進(jìn)行組配，通過盆栽試驗(yàn)，檢驗(yàn)提高植物耐鹽、促生、防病等應(yīng)用效果，篩選優(yōu)良復(fù)合菌系。
實(shí)施例3全功能菌系組合及玉米盆栽篩選試驗(yàn)
以功能互補(bǔ)為原則，以盡量多地涵蓋生物功能譜為目標(biāo)，分別挑選具有不同功能的優(yōu)勢(shì)菌株，如具有較強(qiáng)產(chǎn)IAA、解磷、固氮功能的解淀粉芽孢桿菌ZCM18【該菌株于2016年9月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No.12959，分類名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)】，具有較強(qiáng)產(chǎn)嗜鐵素、拮抗病原真菌和產(chǎn)乙烯脫氨酶的優(yōu)勢(shì)菌株特基拉芽孢桿菌ZCM5【該菌株于2016年9月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No.12960，分類名為特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)】功能互補(bǔ)的耐鹽堿菌株，進(jìn)行組合。各菌株單獨(dú)培養(yǎng)，按發(fā)酵液中活菌數(shù)量1：1配成復(fù)合菌液，復(fù)合菌液的活菌數(shù)為1×1010cfu/mL，將菌液接種到含鹽0.3％土壤玉米種子周圍，每顆玉米種子500μL。陽性對(duì)照為單一優(yōu)勢(shì)菌株處理，空白對(duì)照組接種無菌水，每顆玉米種子500μL。重復(fù)10次。光照室培養(yǎng)25d，統(tǒng)計(jì)玉米的株高、地上干重、根干重等生物量指標(biāo)。經(jīng)比較，優(yōu)良菌株組合處理的植株生物量都優(yōu)于單一菌株處理，分別比對(duì)照組增加34.7％、46.8％和15.0％。
表1全功能菌系玉米盆栽試驗(yàn)數(shù)據(jù)
實(shí)施例4全功能單一菌株玉米盆栽篩選試驗(yàn)
挑選具有較強(qiáng)耐鹽堿、促生等功能齊全的單一菌株進(jìn)行玉米盆栽試驗(yàn)。將菌株進(jìn)行培養(yǎng)，最終將培養(yǎng)物調(diào)節(jié)為1×1010cfu/mL。試驗(yàn)組將菌液接種到玉米種子周圍，每顆玉米種子500μL。對(duì)照組接種無菌水到玉米種子周圍，每顆玉米種子500μL。重復(fù)10次。光照室培養(yǎng)25d后統(tǒng)計(jì)玉米的株高、地上干重、根干重等生物量指標(biāo)。結(jié)果表明，試驗(yàn)組的上述生物量分別比對(duì)照組增加23.3％，11.0％，15.0％。
表2全功能菌株玉米盆栽試驗(yàn)數(shù)據(jù)
實(shí)施例5全功能菌系生物肥制備和鹽堿地玉米田間應(yīng)用試驗(yàn)
如實(shí)施例3的方法，將優(yōu)良菌系分別培養(yǎng)并制備復(fù)合菌培養(yǎng)液，活菌數(shù)量達(dá)到1×1010cfu/mL。將菌液按照5％的量噴灑在有機(jī)肥顆粒上制備成菌數(shù)為1×108cfu/g的生物肥。田間試驗(yàn)的地點(diǎn)設(shè)在河北省滄州市海興縣鹽堿地低產(chǎn)田，含鹽范圍0.1-0.3％。采用常用的精量播種、施肥一體播種機(jī)，將生物肥(養(yǎng)分含量5％)與復(fù)混肥料(養(yǎng)分含量39％)混合后一并施入，肥種相距3-5cm。采用等養(yǎng)分比較法，處理組使用15公斤/畝生物肥加18公斤/畝39％復(fù)混肥料，對(duì)照使用39％復(fù)混肥20公斤/畝。最終統(tǒng)計(jì)玉米的根干重和產(chǎn)量。最終處理組的根干重和產(chǎn)量分別比對(duì)照組增加26.2％，19.3％。
表3全功能菌系進(jìn)行玉米田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)
以上的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種變型和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。