專利名稱：一株耐氯菌株s616的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐氯微生物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高鹽度難降解有機廢水，如石油開采、化工、制藥等廢水已經(jīng)成為環(huán)保水處理領(lǐng)域的世界性技術(shù)難題。而鹽酸法黃姜皂素生產(chǎn)廢水在高濃度含鹽難降解有機物廢水中具代表性。一方面，這類廢水成分復(fù)雜，難降解的有機物多，廢水的可生化性差；另一方面，廢水中的鹽含量高，氯離子濃度大，其混合廢水中氯離子濃度可達20000mg/L。目前，含鹽有機廢水采用非生物方法和生物方法，非生物方法由于其處理費用高、處理效果不好，企業(yè)無法接受，生化法一直是水處理工藝中的首先方法，主要采用A-B兩段接觸氧化法，傳統(tǒng)活性污泥法，SBR法，生物濾池，厭氧濾池等，但是上述生物法大多只能處理含鹽量為3％以下的廢水，而對高鹽廢水(含鹽量5％，甚至20％)難以處理，因此需要特殊的微生物。近年來，國外已報道了有關(guān)選育耐鹽(NaCl)菌處理高鹽有機廢水的報道，而對皂素廢水這類高濃度有機物含量、高鹽(CaCl2)、含難降解物質(zhì)(皂素)復(fù)雜的廢水，至今還屬于研究之薄弱領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株耐氯菌株S616的應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的耐氯菌株S616，為堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616 CCTCC NO.M205146，已于2005年12月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC NO.M205146。
一株耐氯菌株S616的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)S616 CCTCC NO.M205146應(yīng)用于含高濃度氯離子廢水的處理中。
所述的一株堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616 CCTCC NO.M205146應(yīng)用于含高濃度氯離子廢水的處理方法為挑取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616單菌落，于擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24h，按培養(yǎng)后的堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616∶含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)的體積比為(1-4)∶50取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616接種于含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)中，30-40℃恒溫培養(yǎng)，pH值為7.0-8.0，反應(yīng)48-72小時。
擴大培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
本發(fā)明從皂素廢水處理系統(tǒng)的厭氧活性污泥中篩選到一株在高濃度氯離子條件下具有一定生長能力的新菌株。耐氯菌株S616有良好的去除皂素廢水中COD的能力，能在72小時之內(nèi)去除廢水中的COD 50-60％。


圖1-1a是菌株S616菌株電鏡圖片圖1-1b是菌株S616菌株電鏡圖片圖1-2是菌株S616在液體不同氯離子濃度的SC培養(yǎng)基上生長情況1-3是菌株S616的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(1核DNA，2擴增產(chǎn)物，MMarker)圖1-4a是菌株S616在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率1-4b是菌株S616在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率1-4c是菌株S616在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率1-4d是菌株S616在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率圖
具體實施例方式
一、一株耐氯菌株S616的篩選方法(一)、材料準(zhǔn)備1、菌源和實驗廢水(1)菌源處理皂素廢水的生化系統(tǒng)中的活性污泥；(2)實驗廢水(即混合皂素廢水)本實驗廢水取自湖北省十堰市方坤置業(yè)有限公司皂素生產(chǎn)廢水；經(jīng)內(nèi)電解和CaO調(diào)配后，具體指標(biāo)為pH＝7.5-8.2，COD＝4000-17000mg/L，Cl-＝8000-30000mg/L，NH4-N 140-300mg/L。
2、培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基CH3CH2COONa 30mmol，CH3CH2CH2COONa 30mmol，CH3CHOHCOONa30mmol，酵母菌2.0g，MgCl20.1g，NH4Cl 1.0g，K2HPO40.4g，刃天青0.002g，半胱氨酸0.5g，蒸餾水1000ml，pH＝7.0～7.3。
篩選培養(yǎng)基MgSO4·7H2O，0.2g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，NH4Cl 0.5/L，CaCl2135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素廢水(COD濃度為1000mg/L)，pH＝7.5，微量元素溶液FeCl3·6H2O 2g，CoCl22g，MnCl20.5g，CuCl20.03g，ZnCl20.05g，NiCl2.6H2O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.O。
擴大培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
SC培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；瓊脂20g(固)；CaCl2的加入量為0-140g；當(dāng)CaCl2加入量為0g時，SC培養(yǎng)基內(nèi)[Cl-]＝3000mg/L。
斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；磷酸二氫鉀2g；氯化銨1g；瓊脂20g；蒸餾水1000ml；CaCl218g/L，pH＝7.5。
以上培養(yǎng)基分別于121℃高壓滅菌30min后備用。
3、實驗儀器和設(shè)備國華SHA-B恒溫振蕩器，SHH150G光照生物培養(yǎng)箱，臥式壓力蒸汽滅菌器，WMX-1型微波密封消解COD速測儀，722S分光光度計，光學(xué)顯微鏡，pH計，超凈工作臺，鼓風(fēng)干燥箱，超薄切片機，日立H-7000FA投射顯微鏡，PTC200型PCR儀，電泳儀及電泳槽，凝膠紫外觀測儀等。
(二)、菌株的分離與篩選1).菌膠團的破碎取2g皂素廢水處理系統(tǒng)中的厭氧活性污泥，加入事先滅菌好的裝有100ml無菌水的250ml的三角瓶內(nèi)，并加入重量為無菌水0.01％的焦磷酸鈉，搖床振蕩，將菌膠團打碎，得泥水混合物，備用；2).耐氯離子優(yōu)勢菌種的分離利用無菌移液管吸取0.5ml上述泥水混合物，加入分離培養(yǎng)基4.5ml，30-40℃(最佳35℃)厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，待試管培養(yǎng)基變混濁，說明細(xì)菌已經(jīng)生長，然后平板稀釋涂布，挑取在菌落特征上有明顯差異的單菌，直至獲得單一菌株，并于斜面培養(yǎng)基上保存；3).耐氯離子優(yōu)勢菌種的篩選
挑取上述分離出的單菌落，分別接種子篩選培養(yǎng)基內(nèi)，30-40℃(最佳35℃)厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，觀察菌懸液的混濁情況，變混濁的即為篩選出的耐氯離子的菌株；經(jīng)過篩選，獲得一株編號為菌株S616的菌株，即耐氯菌株S616。
菌株S616在加入不同濃度氯離子的液體SC培養(yǎng)基上生長情況如附圖1-2所示。
二、耐氯微生物菌株鑒定1、對耐氯性能較強的菌株S616的鑒定對耐氯性能較強的菌株S616進行了生理生化的鑒定以及16S rDNA分子的鑒定，從分子水平確定耐氯菌株的種屬。
16S rDNA序列分析主要按照以下步驟①細(xì)菌核DNA的提取1)用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于擴大培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)過夜，取1.5ml菌液于Eppendorf管內(nèi)，8,000rpm室溫離心5min，徹底除去上清。
2)加STE緩沖夜1.5ml洗滌一次，離心棄上清，再加入0.6mlTE溶液，重懸細(xì)菌。
3)加30ul10mg/ml的溶菌酶，37℃水浴45min4)加65μl 10％的SDS，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃水浴2小時，至溶液變清。
5)加入等積體酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白層為止。
6)在上清液中加入1/10體積的3M的NaAc(pH5.2)。
7)加入等體積的異丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒纏繞挑出DNA細(xì)絲，在用70％的乙醇洗滌一次，自然涼干，并將DNA溶于100μl TE溶液中。
8)加入終濃度為50μg/ml的RNase，37℃，30min，去除RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> ②16S rDNA基因的PCR擴增P1正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’P2反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’在50μL反應(yīng)體積中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μL P1和P2(終濃度為0.5μM)，1μLdNTP(每種NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR緩沖液。PCR擴增條件為94℃預(yù)變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃終延伸10min。
③PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用70％乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水。
④16S rDNA的全序列測定和分析P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR擴增30個循環(huán)(94℃1min，55℃30s，72℃2min)。采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后，在Applied Biosystem 373A DNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終從分子水平上確定該菌的種屬。
2、16S rDNA序列測定本發(fā)明采用對16S rDNA序列測定和分析的方法對細(xì)菌進行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的核DNA為模板，以16S rDNA基因的PCR擴增的通用引物為引物，進行PCR擴增，得到長度為1425bp的擴增帶(用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測)，如圖1-3所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定其全序列。
<110>中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)
<120>一株耐氯菌株S616的應(yīng)用<160>1425<210>1<211>1425bp<212>DNA<213>堅強芽孢桿菌(Bacillus furmus)<220>
<221>misc_feature<222>
<400>1GCCTATGGTGCGGTCGCGCGAATCTGAGGGAGCTTGGTCCCAAAGATTAGCGGCGGACGG 60GTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTA120ATACCGGATAATCCCTTTCCTCACATGAGGAAAGGCTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACT180TACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGA240TGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAAACACGGCCCAAACTCC300TACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCG360CGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTATCGG420AGTAACTGCCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC480AGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGC540AGGTGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAA600CTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTA660GAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC720GCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA780GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCG840CCTGGGGAGTACGACCGCaAGGTTGAAACTCaAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG900GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC960TGACAATCCTAGAGATAGGACGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGT 1020TGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGAT 1080CTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAA 1140GGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT 1200GGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTTTAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAG 1260TTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCA 1320GCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGT 1380TTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGC 1425
三、菌株S616菌落形態(tài)、生理和生化特征見表1-1；細(xì)胞形態(tài)見圖1-1a、圖1-1b。
表1-1菌株S616的菌落形態(tài)特征以及主要的生理特征

表中符號說明“+”90％以上的菌株為陽性，“-”90％以上的菌株為陰性。
四、菌株S616為新的菌株將菌株S616的16S rDNA基因序列與國際GcnBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行網(wǎng)上同源性比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌S616與堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)多個菌株的同源性高達98-99％以上。綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，可確定細(xì)菌S616為堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)，菌株S616，命名為堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616(即耐氯菌株S616)，查閱有關(guān)資料，尚無芽孢桿菌屬有關(guān)高濃度氯離子條件下難降解有機廢水以及對其耐氯能力研究的報道。堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616為新的菌株，已于2005年12月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC NO.M205146。
本發(fā)明分離、篩選出的菌株S616，具有較好降解高濃度氯離子難降解皂素廢水的功能。這就拓寬了人們對堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)在其功能方面的應(yīng)用研究思路，并為降解含高濃度氯離子皂素廢水提供了有用的菌源和技術(shù)，具有較強的實際應(yīng)用價值。
五、耐氯菌株S616的應(yīng)用應(yīng)用實例1挑取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616單菌落，于擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，按培養(yǎng)后的堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)的體積比為3∶50取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616接種于含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)中，30℃恒溫培養(yǎng)，pH值為7.5，反應(yīng)48小時?；旌显硭貜U水中[Cl-]＝8000-20000/L，COD＝4000-17000mg/L。結(jié)果見圖1-4a、圖1-4b、圖1-4c、圖1-4d。
擴大培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
1)為了考察菌株在不同氯離子濃度下，對COD的去除效果，在廢水中加CaCl2調(diào)節(jié)氯離子濃度分別為9864.2、14980、21061、24780、30080mg/L。耐氯菌株S616去除效果結(jié)果如圖1-4a。
從圖1-4a可以看出，當(dāng)[Cl-]＝9864.2mg/L時，反應(yīng)時間為3d，菌株S616對COD的去除率僅為42.96％，但是隨著廢水中氯離子濃度的升高，菌株S616對COD的去除率增加，當(dāng)廢水中氯離子濃度達到2萬mg/L時，菌株S616對COD的去除率可達78.89％，并且菌株S616對COD的去除率隨著廢水中氯離子濃度的繼續(xù)增加而變化不大，當(dāng)廢水中氯離子濃度高達3萬mg/L時，菌株S616對COD的去除率仍保持在70％。
2)為了考察菌株在不同COD濃度下(6610.4、7906.4、11209.6、13420.0、16196.2mg/L)，對COD的去除效果，在廢水中加CaCl2調(diào)節(jié)氯離子濃度分別為20000mg/L。耐氯菌株S616去除效果結(jié)果如圖1-4b。通過實驗可知當(dāng)廢水中[Cl-]＝20000mg/L、COD濃度達到1萬mg/L時，菌株S616對COD的去除率較好，可達73.2％。
3)從圖1-4c和1-4d可以看出，菌株S616對COD的去除率隨pH的增加先增加后下降，其最高去除率在pH為7.5-8時，達到70％。離心處理后的廢水，發(fā)現(xiàn)pH為7-8時，濕菌體量明顯高于pH為9、10、11時，可見在pH在中性時，有利于菌株的生長；當(dāng)接種量在1-4ml之間變化時，菌株S616對COD的去除率無明顯變化，基本為70％，當(dāng)接種量為1ml時，其去除率最好。這是因為菌株的生長需要一定的營養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)菌懸液為1ml時，其需要的物質(zhì)容易得到滿足。
應(yīng)用實例2挑取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616單菌落，于擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，按培養(yǎng)后的堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)的體積比為1∶50取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616接種于含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)中，30℃恒溫培養(yǎng)，pH值為7.0，反應(yīng)48小時?；旌显硭貜U水中[Cl-]＝8000-20000/L，COD＝8000-10000mg/L。
擴大培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
應(yīng)用實例3挑取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616單菌落，于擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，按培養(yǎng)后的堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)的體積比為4∶50取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616接種于含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)中，40℃恒溫培養(yǎng)，pH值為8.0，反應(yīng)72小時?；旌显硭貜U水中[Cl-]＝8000-20000/L，COD＝8000-10000mg/L。
擴大培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
權(quán)利要求
1.一株耐氯菌株S616的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)S616 CCTCC NO.M205146應(yīng)用于含高濃度氯離子廢水的處理中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株耐氯菌株S616的應(yīng)用，其特征在于所述的一株堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616 CCTCC NO.M205146應(yīng)用于含高濃度氯離子廢水的處理方法為挑取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616單菌落，于擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24h，按培養(yǎng)后的堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616含高濃度氯離子廢水的體積比為(1-4)∶50取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616接種子含高濃度氯離子廢水中，30-40℃恒溫培養(yǎng)，pH值為7.0-8.0，反應(yīng)48-72小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株耐氯菌株S616的應(yīng)用，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株耐氯菌株S616的應(yīng)用，其特征在于所述的高濃度氯離子廢水的[Cl-]＝20000mg/L，COD濃度為10000mg/L，反應(yīng)條件35℃恒溫培養(yǎng)，140rpm，pH為7.5，反應(yīng)時間72小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐氯微生物的應(yīng)用。一株耐氯菌株S616的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616 CCTCC NO.M205146應(yīng)用于含高濃度氯離子廢水的處理中。處理方法為挑取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616單菌落，于擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)20－24h，按培養(yǎng)后的堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616含高濃度氯離子廢水的體積比為(1－4)50取堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)S616接種于含高濃度氯離子廢水中，30－40℃恒溫培養(yǎng)，pH值為7.0－8.0，反應(yīng)48－72小時。本發(fā)明應(yīng)用于含高濃度氯離子廢水的處理中可高效降解高濃度有機污染物，能在72小時之內(nèi)去除廢水中的COD 60－70％。
文檔編號C02F1/58GK1896016SQ200610018130
公開日2007年1月17日 申請日期2006年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月10日
發(fā)明者信欣, 王焰新, 鮑建國, 劉慧 , 楊雪芬, 李平 申請人:中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)