本發(fā)明涉及一種智利江蘺原生質(zhì)體的制備方法，屬于藻類細胞工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

植物原生質(zhì)體是指去除細胞壁被質(zhì)膜所包圍的、具有生活力的細胞，其結(jié)構(gòu)包括細胞膜、細胞質(zhì)(包括各種細胞器、細胞骨架系統(tǒng)及胞基質(zhì))和細胞核等部分。原生質(zhì)體技術(shù)是指在原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)基礎(chǔ)上進行的一系列技術(shù)操作，主要包括原生質(zhì)體植株再生、原生質(zhì)體融合和細胞雜交、轉(zhuǎn)基因等培育變異新類型的生物技術(shù)等。原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生技術(shù)具有使用范圍廣、可行性強等優(yōu)點，是植物生物工程的基礎(chǔ)。

植物原生質(zhì)體制備包括材料的選擇和預(yù)處理，組織分解和原生質(zhì)體初步游離以及原生質(zhì)體的純化和活力檢測。選擇適宜的材料是成功分離原生質(zhì)體的基礎(chǔ)；酶解或機械處理前對于材料的預(yù)處理可以提高破壁效率并減少原生質(zhì)的損傷；合理的酶制劑的選擇以及濃度的調(diào)節(jié)、滲透壓調(diào)節(jié)劑的選擇都是提高原生質(zhì)產(chǎn)量及活性的關(guān)鍵。雖然近年來對于原生質(zhì)的培養(yǎng)技術(shù)取得了迅速的發(fā)展，但是還存在原生質(zhì)體活力不高，培養(yǎng)周期長等問題。

智利江蘺(Gracilaria chilensis)具有生長快、耐高溫的特性，是南方潛在的養(yǎng)殖品種之一。目前，江蘺主要通過營養(yǎng)生殖的方式進行繁殖。苗種的繁育受溫度、海水鹽度等環(huán)境因子的影響極大，極具不穩(wěn)定性。原生質(zhì)體具有全能性，在人工控制的條件下可大量快速繁殖，可以緩解苗種的繁育壓力。此外，江蘺的細胞壁中含有較厚的膠質(zhì)物，無法直接進行細胞融合、細胞雜交等遺傳操作，利用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的的酶溶解手段獲得的原生質(zhì)體往往活性較低，產(chǎn)量也不理想。

專利CN2016101618265公開了一種縊江蘺原生質(zhì)體的制備方法，其通過采用鮑消化腺酶液對縊江蘺組織進行酶解，從而制備原生質(zhì)體。但本發(fā)明發(fā)現(xiàn)源自鮑消化組織的酶液對智利江蘺組織的酶解效果不佳。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供智利江蘺原生質(zhì)體的制備方法。同時，根據(jù)海藻體細胞發(fā)育的全能性，利用工具酶分解智利江蘺組織，游離出體細胞原生質(zhì)體，也可為遺傳工程研究提供理想受體系統(tǒng)。

在一個實施方案中，所述制備方法包括組織酶液制備、智利江蘺組織酶解等步驟，所述組織酶液制備步驟為：將其用1-10倍海參腸體積的海水0℃勻漿破碎；在4℃下浸提4-18h，然后將浸提液調(diào)pH值至7.0-8.0，冷凍離心5min，取上層清液即得海參酶液；將海參酶液、纖維素酶和海水混合后即得組織酶液。

在一個具體實施方案中，所述組織酶液制備步驟為：將其用2倍海參腸體積的海水0℃勻漿破碎；在4℃下浸提12h，然后將浸提液調(diào)pH值至7.6，冷凍離心5min，取上層清液即得海參酶液；將海參酶液、纖維素酶和海水混合后即得組織酶液。

在進一步地實施方案中，所述組織酶液的具體組成為2.4ml纖維素酶、0.5ml海參酶液和17.1ml消毒海水。

在另一個實施方案中，所述智利江蘺組織酶解步驟為取智利江蘺組織用解剖刀將藻體切碎，加入制備好的組織酶液進行酶解，然后用200目的篩絹進行過濾，去除未消化的細胞、細胞團和碎片，去上清液離心，800rpm離心10min，使單細胞原生質(zhì)體下沉，細胞碎片留在上清液中，棄去上清液，用含有1mol/L的葡萄糖的消毒海水進行沖洗離心2-3次，收集沉淀后懸浮至2ml，即得原生質(zhì)體。

在一個實施方案中，所述酶解條件為添加組織酶液的藻體組織放入25℃的恒溫搖床上進行黑暗酶解5h。

附圖說明

圖1：原生質(zhì)體的熒光檢測圖(×20倍)左：原生質(zhì)體；右：熒光染色后的原生質(zhì)體，顯示紅色

圖2：原生質(zhì)體培養(yǎng)12天后的顯微鏡圖

具體實施方式

還可進一步通過實施例來理解本發(fā)明，其中所述實施例說明了一些制備或使用方法。然而，要理解的是，這些實施例不限制本發(fā)明?，F(xiàn)在已知的或進一步開發(fā)的本發(fā)明的變化被認為落入本文中描述的和以下要求保護的本發(fā)明范圍之內(nèi)。

實施例1

組織酶液制備：將其用2倍海參腸體積的海水0℃勻漿破碎；在4℃下浸提12h，然后將浸提液調(diào)pH值至7.6，冷凍離心5min，取上層清液即得海參酶液；將海參酶液、纖維素酶和海水混合后即得組織酶液。所述組織酶液的具體組成為2.4ml纖維素酶、0.5ml海參酶液和17.1ml消毒海水。

原生質(zhì)體的制備：取2g智利江籬材料，用吸水紙吸干后用解剖刀將藻體切碎(越碎越好)，加入制備好的組織酶液，放入25℃的恒溫搖床上進行黑暗酶解。每30min鏡檢一次，觀察并拍照。5h后，用200目的篩絹進行過濾，去除未消化的細胞、細胞團和碎片，去上清液離心，800rpm離心10min，使單細胞原生質(zhì)體下沉，細胞碎片留在上清液中，棄去上清液，用含有1mol/L的葡萄糖的消毒海水進行沖洗離心2-3次，收集沉淀后懸浮至2ml，即得原生質(zhì)體。

實施例2

原生質(zhì)體的檢測：

細胞密度的測定：用血球計數(shù)板進行細胞密度的測定

具體結(jié)果如下：

對比例1為組織酶液中海參酶液的制備方法為其用2倍海參腸體積的海水0℃勻漿破碎；在4℃下浸提12h，然后將浸提液調(diào)pH值至7.0，冷凍離心5min，取上層清液即得海參酶液；其他組織酶液及原生質(zhì)體制備方法同本發(fā)明實施例1.

對比例2為組織酶液中海參酶液的制備方法為其用2倍海參腸體積的海水0℃勻漿破碎；在4℃下浸提12h，然后將浸提液調(diào)pH值至8.0，冷凍離心5min，取上層清液即得海參酶液；其他組織酶液及原生質(zhì)體制備方法同本發(fā)明實施例1.

對比例3為組織酶液的組成為2.4ml纖維素酶、0.5ml鮑魚酶液和17.1ml消毒海水；鮑魚酶液制備方法參見專利CN2016101618265說明書中的實施例1，其他組織酶液及原生質(zhì)體制備方法同本發(fā)明實施例1.

對比例4為組織酶液的具體組成為2.0ml纖維素酶、0.9ml海參酶液和17.1ml消毒海水，其他組織酶液及原生質(zhì)體制備方法同本發(fā)明實施例1。

對比例5為組織酶液的具體組成為2.7ml纖維素酶、0.2ml海參酶液和17.1ml消毒海水，其他組織酶液及原生質(zhì)體制備方法同本發(fā)明實施例1。

存活率測定：用0.5％Evans Blue染色，活的原生質(zhì)體呈亮黃色，死細胞呈深藍色。在顯微鏡下隨機選擇5個視野，計算活原生質(zhì)體的存活比率，具體結(jié)果如下：

實施例3

收集實施例1制備的原生質(zhì)體在高滲海水中進行弱光培養(yǎng)，光照強度為100-200lx，原生質(zhì)體再生壁后，逐步降低海水滲透壓至普通海水，光照強度逐步增加至3000lx進行培養(yǎng)。

如圖2所示，培養(yǎng)42小時后，原生質(zhì)體還未形成完整的細胞壁，培養(yǎng)4天后，多數(shù)原生質(zhì)體已經(jīng)再生細胞壁。培養(yǎng)7天后，已經(jīng)分裂成多個細胞，細胞排列較規(guī)則，培養(yǎng)12天后，細胞數(shù)不斷增加，且排列成不同的形狀。

本發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請保護范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。