本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)抗菌、抗真菌及抗病毒劑的乳酸桿菌IR WEE-01。
背景技術(shù)：
貫穿本說明書的整體，參照了多個(gè)論文及專利文獻(xiàn)，并表示出對(duì)其的引用。被引用的論文及專利文獻(xiàn)的公開內(nèi)容作為整體在本說明書中作為參照內(nèi)容被引入，從而對(duì)本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域的水平及本發(fā)明的內(nèi)容更加明確地進(jìn)行說明。
條件性(facultative anaerobic)厭氧性及非孢子形成(non-spore-forming)革蘭氏陽性乳酸菌(lactic acid bacteria；LAB)對(duì)于微生物和病毒在體內(nèi)(in vivo)和體外(in vitro)被用作生理活性物質(zhì)(pro-bioactive substances)(Naidu et al.,1999)。因乳酸菌(LAB)分泌拮抗劑化合物(antagonistic materials)并通過代謝副產(chǎn)物來改變細(xì)胞外環(huán)境，從而一直被作為對(duì)于環(huán)境微生物組代謝競(jìng)爭(zhēng)者(competitor)使用(Naidu et al.,1999；Rouse and van Sinderen，2008)。從動(dòng)物和植物等的原料中自然起源的多個(gè)發(fā)酵食品和培養(yǎng)過濾液中共同發(fā)現(xiàn)了LAB的接抗性性質(zhì)(Lindgren and Do brogosz，1990)。由LAB生產(chǎn)的具有生活性的二次代謝產(chǎn)物因包含有有機(jī)酸(organic acids)、過氧化氫(hydrogen peroxide)、二氧化碳(carbon dioxide)、二乙酰基(diacetyl)和乙醛(acetaldehyde)，從而在研究顯示出抗細(xì)菌活性的小的化合物(small compound)方面具有重要性(Naidu et al.,1999；Rouse and van Sinderen，2008)。多個(gè)種類的LAB中，已知乳桿菌(Lactobacillus spp.)在代謝過程中生產(chǎn)分子量小的抗生物質(zhì)(Messens and De，2002)。Kwak等研究過從乳酸桿菌LBP-10K培養(yǎng)過濾液中純化得到的CDPs的抗病毒性及抗真菌性活性(Kwak et al.,2013；Kwak et al.,2014)。在現(xiàn)有的研究中，順式-環(huán)(L-亮氨酸-脯氨酸)和順式-環(huán)(L-苯基丙氨酸-L-脯氨酸)顯示出了對(duì)抗流行性感冒A病毒(influenza A virus)的生活性(Kwak et al.,2013)，證明了順式-環(huán)(L-纈氨酸-L-脯氨酸)和順式-環(huán)(L-苯基丙氨酸-L-脯氨酸)分別抑制作為植物和人的病原有機(jī)體的島靈芝(Ganoderma boninense)和白色念珠菌(Candida albicans)(Kwat et al.,2014)。乳酸菌和其培養(yǎng)上清液是抑制細(xì)菌和真菌的有用的工具(Rouse and van Sinderen，2008)。報(bào)道有乳酸菌在嚙齒類的腹部抑制酵母的生長(zhǎng)，并在鼠的消化道(digestive tract)中對(duì)瑞斯特桿菌屬(Ristella)具有拮抗效果(Ducluzeau et al.,1971)。包含嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)的發(fā)酵混合物抑制了痢疾桿菌(Shigella dysenteriae)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)及大腸桿菌(Escherichia coli)的生長(zhǎng)(Rani and Khetarpaul，1998)。C57BJ/6雌性小鼠中，羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)抑制了隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)的感染(Alak et al.,1997)。
通過測(cè)定是否能夠保護(hù)無胸腺(athymic)鼠和正常胸腺(euthymic)鼠免受全身性念珠菌病(systemic candidiasis)的侵害來調(diào)查嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acido philus)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)GG及動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)的抗真菌活性(Wagner et al.,1997)。棒狀乳桿菌(Lactobacillus coryniformis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)及戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)對(duì)抗真菌而具有活性(Magnusson et al.,2003)。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳脂鏈球菌(Streptococcus cremoris)R3、雙醋酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)V1和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophiles)T2菌株相對(duì)于革蘭氏陽性菌顯示出了寬的抑制范圍(Mezaini et al.,2009)。據(jù)報(bào)道，分離自黑麥米糊(rye sourdoughs)的乳酸菌生產(chǎn)對(duì)抗細(xì)菌和真菌的類細(xì)菌素(bacteriocin-like)抑制物質(zhì)(Digaitiene et al.,2012)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了乳酸桿菌IR WEE-01菌株與現(xiàn)有的已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌相比，具有高的抗菌、抗真菌及抗病毒活性，從而完成了本發(fā)明。
(現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn))
(專利文獻(xiàn))
作為相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，韓國(guó)授權(quán)專利第10-2006-0080130號(hào)(利用分離自泡菜的抗真菌活性乳酸桿菌AF1和上述菌的培養(yǎng)液的產(chǎn)品)中公開了一種分離自泡菜的乳酸桿菌AF1菌株。通過將該菌株添加到食品、飼料及化妝品等中，能夠?qū)崿F(xiàn)提高儲(chǔ)存性的用途，除此之外，能夠用作抗菌劑。
韓國(guó)授權(quán)專利第10-2013-0002870(順式-環(huán)(L-苯基丙氨酸-L-脯氨酸)的新用途)為本發(fā)明人的在先申請(qǐng)，記載了一種包含對(duì)擔(dān)子菌類具有特異性抗真菌活性的順式-環(huán)(L-苯基丙氨酸-L-脯氨酸)作為有效成分的組合物和其生產(chǎn)方法。
(非專利文獻(xiàn))
Scopel M等記載了作為青霉菌屬生產(chǎn)的二肽的順式-環(huán)(亮氨酰-酪氨酰)抑制表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的生物膜形成(Scopel et al.,2013)。
Strom K等報(bào)道了植物乳桿菌MiLAB 393菌株生產(chǎn)作為抗真菌的環(huán)二肽的環(huán)(L-苯基丙氨酸-L-脯氨酸)、環(huán)(L-苯基丙氨酸-反式-4-OH-脯氨酸)及3-苯基乳酸(Strom et al.,2013)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于，提供一種具有高的抗菌、抗真菌及抗病毒活性的乳酸菌株植物乳桿菌IR WEE-01。
技術(shù)方案
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的特征為，提供一種具有抗菌、抗真菌及抗病毒活性的乳酸菌株植物乳桿菌IR WEE-01。
發(fā)明的效果
根據(jù)本發(fā)明的植物乳桿菌IR WEE-01以高水平生產(chǎn)多種抗菌、抗真菌及抗病毒物質(zhì)。因此，在利用本發(fā)明的菌株的情況下，能夠以低廉的費(fèi)用來制備高收率的抗菌、抗真菌及抗病毒物質(zhì)。
具體實(shí)施方式
下面，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。這些實(shí)施例僅是為了更加具體地說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉根據(jù)本發(fā)明的主旨，本發(fā)明的范圍并不受限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1由植物物質(zhì)分離及鑒定植物乳桿菌IR WEE-01菌株。
*菌株的分離及鑒定
從韓國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵泡菜中分離并培養(yǎng)植物乳桿菌IR WEE-01菌株，對(duì)分離的乳酸菌細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以及采用16s rDNA堿基序列法進(jìn)行鑒定。將連續(xù)稀釋的細(xì)菌細(xì)胞在mMRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而計(jì)算集落形成單位(CFU，colony forming unit)。
為了進(jìn)行抗菌活性測(cè)定，準(zhǔn)備菌株指標(biāo)(bacterial indicators)、多藥耐性(multidrug-resistant)革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細(xì)菌菌株。在此使用的多藥耐性菌株如下。對(duì)包含甲氧西林(methicillin)、雙氯西林(dicloxacillin)、萘夫西林(nafcillin)及新青二(oxacillin)的青霉素(penicillins)的β-內(nèi)酰胺抗生素(beta-lactam antibiotics)顯示出抵抗性的新青二-抵抗性金黃色釀膿葡萄球菌(oxacillin-resistant Staphylococcus aureus；ORSA)11471，在青霉素、紅霉素(erythromycin)、四環(huán)素(tetracycline)及克林霉素(clindamycin)中顯示出抵抗性的肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)14596及對(duì)ACSSuT(氨芐青霉素(ampicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、鏈霉素(streptomycin)、磺胺類(sulphonamides)和四環(huán)素(tetracycline))顯示出抵抗性的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)12219。以上所有的細(xì)菌性病原菌均由韓國(guó)國(guó)立保健院(Korea National lnstiute of Health)提供。
抗菌活性測(cè)定(Antimicrobial assays)
所有的實(shí)驗(yàn)均是利用相當(dāng)于沒有有機(jī)酸(organic acids)或糖(sugars)或者沒有有機(jī)酸及糖的培養(yǎng)液的植物乳桿菌IR WEE-01-I、II及III或單一的化合物測(cè)定的。
通過以下方式測(cè)定抗菌活性。以最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration；MIC)接種種菌(seed inoculation)后，每隔24小時(shí)進(jìn)行測(cè)定(Huys et al.,2002；Paulo et al.,2010)。
統(tǒng)計(jì)分析(Statistical analysis)
結(jié)果以平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(表3)。各個(gè)差異的統(tǒng)計(jì)性顯著度利用了微軟辦公電子表格處理軟件(Microsoft Office Excel，2013)程序的學(xué)生t檢驗(yàn)(Student’s-test)。在所有的比較中，視為p<0.05(*)值在統(tǒng)計(jì)性方面有效。
強(qiáng)有力的抗菌性菌株的特性調(diào)查
從韓國(guó)傳統(tǒng)的三種泡菜中分離出400個(gè)左右的菌株，對(duì)其中的200個(gè)乳酸菌株進(jìn)行鑒定(表1)。將具有強(qiáng)有力的抗菌活性的這些菌株接種到mMRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)(28℃)，通過16S rDNA定序方法來進(jìn)行鑒定。從30個(gè)菌株中獲得的培養(yǎng)過濾液對(duì)革蘭氏陽性指標(biāo)細(xì)菌顯示出了顯著性的抗菌活性(表2)。其中，植物乳桿菌IR WEE-01的培養(yǎng)過濾液被測(cè)定為具有最優(yōu)異的抗菌活性的過濾液(表2)。將上述植物乳桿菌IR WEE-01于2015年10月26日保藏在韓國(guó)種菌中心，保藏編號(hào)為KCCM11779P。
為了使在植物乳桿菌IR WEE-01的過濾液中分離抗菌物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)條件最優(yōu)化，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)、菌落數(shù)、pH及抗菌活性。即使在吸光度增加的情況下，在32小時(shí)后CFU數(shù)也具有顯著性而減小，pH為4.0左右。穩(wěn)定期之后pH維持在3.7-3.8左右。因此，可以認(rèn)為是因代謝產(chǎn)物的影響而使得CFU和pH減小，從而抗菌活性得到增加。如果在細(xì)胞生長(zhǎng)期間CFU增加pH減小，則可以認(rèn)為抗菌物質(zhì)顯著性地過多生產(chǎn)?；谶@種結(jié)果，顯示出富含CDP(CDP-rich)植物乳桿菌IR WEE-01培養(yǎng)過濾液顯示出了最強(qiáng)的抗菌性，因此，在該研究中利用該菌株來純化分離了單一的CDP和植物乳桿菌IR WEE-01菌株。
表1
表2植物供應(yīng)院分離的LAB的培養(yǎng)上清液的抗菌活性比較
a標(biāo)記：+，<15mm；++，<22mm；+++，>22mm(指示株系：枯草芽孢桿菌)
bMIC：最小抑菌濃度
c標(biāo)記：+，1-倍；++，0.5-倍；+++，小于0.25-倍(指示株系：枯草芽孢桿菌)
*所有的試驗(yàn)代表了三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。
實(shí)施例2對(duì)于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌菌株的植物乳桿菌IR WEE-01的活性(bioactivity)
在該研究中，分別使用了枯草芽孢桿菌(Bacillus subilis)、金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、李斯特菌(Listeria monocytogens)及肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)等的革蘭氏陽性細(xì)菌。此外，分別使用了沙門氏菌(Salmonella typhimuruium)、大腸桿菌(Escherichia coli)及宋內(nèi)志賀菌(Shigella sonnei)等的革蘭氏陰性細(xì)菌。此外，使用了包括金黃色釀膿葡萄球菌11471，肺炎鏈球菌14596菌株的革蘭氏陽性細(xì)菌和包括鼠傷寒沙門氏菌12219菌株的革蘭氏陰性細(xì)菌作為多藥耐性菌株。
顯然地，通過MIC試驗(yàn)證明了植物乳桿菌IR WEE-01菌株對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌及革蘭氏陰性細(xì)菌和多藥耐性細(xì)菌具有顯著地抗菌活性(表3)。對(duì)于多藥耐性細(xì)菌的活性所需的植物乳桿菌IR WEE-01菌株的濃度示于表3中。關(guān)于植物乳桿菌IR WEE-01菌株對(duì)于金黃色釀膿葡萄球菌11471、肺炎鏈球菌14596及鼠傷寒沙門氏菌12219的抗菌活性的情況，分別在表3中示出了它們的濃度和活性。
由于抗菌活性與其它菌株相比優(yōu)異，因此認(rèn)為植物乳桿菌IR WEE-01菌株為L(zhǎng)AB培養(yǎng)液的最強(qiáng)的抗菌混合物。其結(jié)果，顯示出植物乳桿菌IR WEE-01菌株的抗菌物質(zhì)是通過該菌株自然發(fā)生而生產(chǎn)出的，可以與其它抗菌劑或LAB匹敵。
表3
植物乳桿菌IR WEE-01菌株中生產(chǎn)的順式-環(huán)(L-Leu-L-Pro)的抗菌活性
aMIC:最小抑菌濃度.
b標(biāo)記:+，1-倍；++，0.5-倍；+++，小于0.25-倍.
c多耐藥性革蘭氏陽性菌.
d多耐藥性革蘭氏陰性菌.
*這些值是3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值.
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